ヒト胚性幹細胞からの肝細胞様細胞誘導の効率的な方法

サマリー

本稿では、ヒト胚性幹細胞(hESC)を、hESC分化中にアクチビンAおよびCHIR99021を確実なエンドドーム(DE)に継続的に補い、機能性肝細胞様細胞(HLC)に分化するための詳細なプロトコルを記述する。

要約

ヒト胚性幹細胞(hESC)由来の肝細胞様細胞(HLC)の潜在的な機能は、疾患のモデル化および薬物スクリーニング用途に大きな約束を果たしています。ここでは、機能性 Hfc に hESC を分化するための効率的で再現可能な方法を提供します。内胚葉系統の確立は、HLFc との差別化の重要なステップです。我々の方法により、hESC分化中のアクチビンAおよびCHIR99021を確実な内因(DE)に連続的に補い、続いて肝前駆細胞の生成、そして最後に完全に定義された試薬を用いた段階的な方法で典型的な肝細胞形態を有するHLCを補うことによって、主要なシグナル伝達経路を調節する。この方法によって生成されるhESC由来のHFCは、ステージ固有のマーカー(アルブミンを含む) HNF4α核受容体、及びタウロコール酸共輸送ポリペプチド(NTCP)と、成熟および機能的肝細胞(中毒性の緑染色、グリコーゲン保存、ヘマトキシリン-エオシン染色およびCYP3活性を含む)に関する特別な特徴を示し、肝疾患の研究におけるHLCベースの応用の開発のためのプラットフォームを提供することができる。

概要

肝臓は、脱酸化、グリコーゲンの貯蔵、タンパク質の分泌と合成など、いくつかの役割を果たす高度に代謝性の高い器官^{である1。}様々な病原体、薬物および遺伝は肝臓の病理学的変化を引き起こし、その機能に影響を及ぼす^2,3.肝細胞は、肝臓の主要な機能単位として、人工肝支援システムおよび薬物毒性除去において重要な役割を果たす。しかし、原発性ヒト肝細胞の資源は、細胞ベースの治療だけでなく、肝臓病の研究において限られている。したがって、ヒト肝細胞の機能性を新たに開発することは、再生医療分野における重要な研究の方向性である。hESCが^確立された1998年から、hESCは優れた分化能力(適切な環境で様々な組織に分化することができる)と高度な自己更新性のために研究者によって広く検討され、バイオ人工肝、肝細胞移植、さらには肝組織工学⁵に理想的なソース細胞を提供する。

現在、肝分化効率は、内胚葉⁶を充実させることにより大きく高めることができる。幹細胞の内胚葉への系統分化において、変容成長因子β(TGF-β)シグナル伝達およびWNTシグナル伝達経路のレベルは、内胚形成段階のノードにおける重要な因子である。高レベルのTGF-βおよびWNTシグナル伝達の活性化は、endoderm^7,8の開発を促進することができる。アクチビンAは、TGF βスーパーファミリーに属するサイトカインである。従って、アクチビンAは、ヒト誘導多能性幹細胞(hiPSC)及びhESC9,10の内胚葉誘導に広く用いられている。GSK3はセリンスレオンニンプロテインキナーゼです。研究者は、GSK3βの特定の阻害剤であるCHIR99021が典型的なWNTシグナルを刺激し、特定の条件下で幹細胞分化を促進できることを発見し、CHIR99021がエンドドーム^11、12、13に幹細胞分化を誘導する可能性があることを示唆している。

ここでは、hESCの機能的なHCへの分化を効果的に誘導するための効率的で再現可能な方法を報告します。アクチビンAおよびCHIR99021の順次添加により、約89.7±0.8%SOX17(DEマーカー)陽性細胞が産生された。さらに 体質化された細胞は、肝特異的マーカーを発現し、肝細胞様形態(ヘマトキシリン-エオシン染色(H&E)に基づく)およびインドシアニングリーン(ICG)の取り込み、グリコーゲン貯蔵およびCYP3活性の取り込みなどの機能を発揮した。この結果は、hESCがこの方法によって成熟した機能的なHlCに正常に分化され、肝疾患関連の研究と インビトロ 薬物スクリーニングの基礎を提供できることを示している。

プロトコル

1. 幹細胞のメンテナンス

注: 以下に説明するセル維持プロトコルは、接着単層で維持される hES03 細胞株に適用されます。この原稿の次のプロトコルすべてについて、細胞は生物学的安全キャビネットの下で扱われるべきである。

1. 5x補充培地をmTesR塩基性培地に希釈して1x mTesR幹細胞培地を調製した。
2. 氷の上に5 mLのDMEM/F12でhESC修飾マトリゲルの5 mLを希釈することによって30x hESC修飾マトリゲル培地を準備する。-20°Cで保管してください。
3. DMEM/F12の1 mLで30x hESC修飾マトリゲルの33.3 μLを希釈することによって1x hESC修飾マトリゲル培地を準備する。
4. 滅菌6ウェルをコートし、各ウェルに1xhESC修飾マトリゲルの1mLを有する組織培養処理プレートを事前に、4°Cで一晩保存する。室温(RT)で使用する前に30分以上放置してください。
5. 37°Cの水浴で凍結保存されたhESCを3分間振らずに解凍します。次いで、4 mLプリウォームした37°C mTesR培地を含む15mL遠心管にピペットして細胞を直ちに移し、上下に2回ピペットします。
6. 200 x g の hESC を RT で 2 分間遠心分離します。
7. 上清を吸引し、細胞を1mLのmTesR培地で穏やかに再懸濁する。
8. DMEM/F12培地をプレートから吸引し、2 mLのmTesRで1 x¹⁰⁵ 細胞の密度で6ウェルプレートのウェルに細胞を播種します。
9. 5%CO2インキュベーターでインキュベートし、毎日予熱されたmTesR培地に置き換えることによって細胞を維持する。約70〜80%の合流で、または細胞コロニーが接触し始めると、細胞を通過させる。

2. 幹細胞の通過と分化

1. 細胞を通過させる場合、培地を吸引し、酵素溶液のウェル当たり1mLで細胞をインキュベートする(例えば、アキュターゼは37°Cで5分間。 次に、4 mLのDMEM/F12を含む15 mL遠心分離管にピペットして細胞を37°Cに予熱した。
2. 2分間RTで200 x g で細胞を遠心分離する。
3. 培地を吸引し、細胞ペレットを1mLのmTesR培地に静かに再懸濁させる。
4. 24ウェルプレートを250 μLの1x hESC認定マトリゲル培地でコーティングして事前に準備します。上記のように、500 μLのmTesR培地中のウェル当たり1〜1.5 x¹⁰⁵ 細胞の密度で、上記のようにhESCをシードする。
5. 細胞がCO2インキュベーターで37°Cで₂₄ 時間インキュベートすることを可能にする。

3. DE形成

1. DMSOで0.2%BSAと3 mM CHIR99021を含むDPBSを備えた100 μg/mLアクティビンAのストックソリューションを準備します。
2. 1x B27でRPMI培地を補うことによってステージI分化基本培地を準備する。
3. アクチビンAを100 ng/mLの最終濃度に加え、CHIR99021を適切な体積の予熱ステージI分化基本培地で3μMの最終濃度に加えます。
4. 細胞から吸引mTesR培地を、付加分化因子(例えば、24ウェルプレートのウェルあたり0.5 mL)を含むステージI分化培地に置き換える。
5. 細胞が_CO2 インキュベーターで37°Cで3日間インキュベートすることを可能にし、毎日ステージI培地を新たに添加した分化因子に置き換える(Days 0-2)。
   注:分化の3日後、分化細胞は、例えばFOXA2、SOX17、GATA4、CRCR4、およびFOXA1(進行に必要なSOX17の最低80%)のようなDE細胞のマーカーを表す必要があります。

4. 肝前駆細胞の分化

1. ノックアウトDMEMで20%の最終濃度にノックアウト血清置換(KOSR)を溶解することにより、ステージII分化基本培地を調製します。
2. 1%DMSO、1xグルタマックス、1x非必須アミノ酸(NEAA)溶液、100 μM 2-メルカプトエタノールおよび1xペニシリン/ストレプトマイシン(P/S)を含むステージII分化培地を適切な量のKOSR/ノックアウトDMEMに調製する。
3. 分化の3日目に、培地を吸引し、ステージII培地(例えば、24ウェルプレートのウェルあたり0.5 mL)に置き換える。その後、24時間インキュベートする。
4. 分化の4日目に、培地を吸引し、ステージII培地(例えば、24ウェルプレートのウェルあたり1mL)に置き換える。
5. 1 日おきにメディアを変更します (6 日目にメディアを交換します)。
   注:分化の8日後、分化細胞は、HNF4α、AFP、TBX3、TTR、ALB、NTCP、CEBPA(進行に必要なHNF4αの最低80%)のような肝前駆細胞の適切なマーカーを発現するべきである。

5. 肝細胞分化

1. 10 μg/mL 肝細胞成長因子 (HGF)、20 μg/mL オンコスタチン(OSM)ストックソリューションを DBPS (0.2% BSA を含む) とフィルター 0.22 μm フィルター膜で準備します。
2. ステージIII分化基本培地(ヘパトザイム-SFM(HZM)培地を10 μMヒドロコルチゾン-21-半球化および1x P/Sで補う。
3. HGFを最終濃度の10 ng/mLに加え、最終濃度の20 ng/mLを適切な濃度のステージIII分化培地に加えます。
4. 分化の8日目に、細胞からステージII培地を吸引し、ステージIII培地(例えば、24ウェルプレートのウェルあたり1mL)に置き換える。
5. 細胞が_CO2 インキュベーターで37°Cで10日間インキュベートすることを可能にし、ステージIII培地を1日おきに新たに分化因子を加えて変更する(Days 8-18)。
   注:分化の18日後、分化細胞は、AAT、ALB、TTR、HNF4α、NTCP、ASGR1、CYP3A4などの肝細胞の特徴的なマーカーを発現する必要があります。アルブミン陽性細胞の割合は、通常90%以上である。

RNAの単離、cDNA合成およびRT-qPCR分析

1. 細胞から培地を吸引し、RNAiso Plus試薬の適切な量を加え、(例えば、24ウェルプレートのウェルあたり0.3 mL)。上清を1.5mLチューブに集め、RTで5分間放置します。
2. 60 μLのクロロホルム試薬を加え、RTで5分間放置します。その後、12,000 x g で遠心分離機を15分間行います。
3. 125 μLの上清を集め、別の遠心分離管に移します。イソプロパノールを160μL加え、よく混ぜ、RTで10分間放置します。
4. 12,000 x g で10分間の遠心分離機。
5. 上清を取り除き、沈殿物に75%エタノールを加え、遠心分離機を7,500xgで5分間加える。
6. RTで乾燥した後、40 μLのDEPC処理水を加えて溶解します。qPCRの場合、メーカーのプロトコルに従って逆転写キットを使用して、総RNAの2μgを逆転写します。
7. 製造元のプロトコルに従って、市販キットを使用して RT-qPCR を実行します。
8. 非誘導幹細胞に対する遺伝子発現を正常化し、GAPDHに対する正常化後のフォールド変動を決定する。

7. 分化の免疫蛍光検証

1. 0.1%Tween-20をPBSに加えて1x PBST洗浄バッファーを調製します。
2. 付着細胞から培地を吸引し、シェーカーのRTでPBSで短時間洗浄する。
3. 吸引PBSと24ウェルプレートのウェルあたり500 μLの氷冷メタノールを含む細胞をインキュベートし、一晩で-20 °Cで細胞を固定します。
4. メタノールを取り出し、RTで毎回10分間シェーカーでPBSで3回洗浄します。
5. 5%BSAの500 μLのブロック細胞は、シェーカー上のRTで1-2時間PBSで調製した。
6. ブロッキングに使用される同じ溶液中の1:200で希薄な一次抗体。
7. シェーカー上で4°Cで一晩300μLの一次抗体溶液中の固定細胞をインキュベートします。
8. 一晩インキュベーションした後、シェーカー上のRTで毎回10分間PBSTで細胞を3回洗浄する。
9. 1:1000でブロッキング溶液中の二次抗体溶液を調製する。
10. 300 μL の二次抗体溶液を、シェーカーの RT で 1 時間光から保護します。
11. 吸引二次抗体溶液と細胞をシェーカー上のRTで毎回10分間PBSTで3回洗浄する。
12. 300 μLの1 μg/mL DAPIを3~5分間インキュベートし、PBSTで2回洗浄します。
13. PBSTを吸引した後、蛍光顕微鏡で写真を撮るための適切な量のPBSを加える。

8. ウェスタンブロット分析

1. トリスバッファー生理生理(TBS)に 0.1% Tween-20 を加えて、1x TBST 洗浄バッファーを準備します。
2. メーカーのプロトコルに従って市販のキットを使用してSDS-PAGE電気泳動バッファーと西部転写バッファーを準備します。
3. 10%のドデシル硫酸ポリアクリルアミドゲルで全細胞タンパク質(40μg)を分解し、約2時間の15mA定電流でSDS-PAGE電気泳動バッファーで動作します。
4. ゲルをポリビニリデンジフルオリド(PVDF)膜に、低温で2時間の300mA定電流で移動します。
   注:実行時間と転送時間は、使用する機器とゲルの種類と割合によって異なる場合があります。
5. シェーカーのRTで1時間TBSTで調製された3%BSAで膜をブロックします。
6. シェーカー上で一次抗体溶液(1:1000希釈)を4°Cで一晩インキュベートする。
7. 一晩のインキュベーションの後、シェーカーのRTで1時間あたり15分間TBSTで3回ブロット膜を洗浄する。
8. 二次抗体溶液(1:2000希釈)で2時間、シェーカー上のRTでインキュベートする。
9. 二次抗体溶液を廃棄し、TBSTで膜を3回洗浄し、毎回15分間、シェーカー上でRTで洗浄します。
10. 化学発光試薬を用いてオートラジオグラフィーを使用して免疫反応性バンドを可視化します。β-actin をロード制御として使用します。

9. インドシアニングリーンの取り込み

1. DMSOで200mg/mLのインドシアニングリーンストック溶液を準備します。
2. 1 mg/mL の最終濃度にインドシアニングリーン溶液でステージ III 分化培地を補うことによって作業ソリューションを準備します。.
3. 37°C、5%CO2インキュベーターで1〜2時間インキュベーターをインキュベートする。
4. 培地を吸引し、細胞をPBSで3回洗浄する。
5. 顕微鏡で撮影。

10. 周期酸シフ(PAS)染色およびヘマトキシリン-エオシン(H&E)染色

1. 付着細胞から培地を吸引し、PBSで2回短時間洗浄する。
2. 細胞固定のために、PBSを吸引し、一晩-20°Cで氷冷メタノールで細胞をインキュベートする。
3. PAS染色でグリコーゲン保存を可視化し、メーカーの指示に従ってキットを使用してH&E染色による二核細胞を観察します。
4. 蛍光顕微鏡で画像を撮ります。

11. CYP活性のアッセイ

1. メーカーの指示に従って市販のセルベースアッセイ(P450-Gloアッセイ)を使用してCYP450活性を測定します。
2. テストには 3 つの独立した繰り返しを使用します。データはSDの平均±表現されます。

結果

hESCからのHLC誘導の概略図と各分化段階の代表的な明視野画像を図1に示す。ステージIでは、殺菌剤AおよびCHIR99021を3日間添加し、幹細胞を誘導して内胚細胞を形成した。ステージIIでは、内胚葉細胞を5日間分化培地で処理した後、肝前駆細胞に分化した。ステージIIIでは、HGFおよびOSMで10日後に初期肝細胞が成熟し、HCに分化していた(図1A)。分化の最終段階では、細胞は典型的な肝細胞表現型(細胞は多角形であり、均等かつ規則的に分布する)を示した(図1B)。

さらに肝分化を確認するために、RT-qPCR、免疫蛍光染色およびウェスタンブロッティングを用いて、内胚葉細胞、肝前駆細胞、および成熟肝細胞のマーカーを検出した(図2)。分化した細胞は、各段階で分化関連遺伝子やタンパク質の発現レベルが高いことを示し、 3日目の内胚葉マーカーSOX17...

ディスカッション

ここでは、hESCからHCSを誘導するステップワイズ方式を3段階で提示する。第1段階では、アクティビンAとCHIR99021を使用して、hESCをDEに区別しました。第2段階では、KO-DMEMおよびDMSOを用いて、DEを肝前駆細胞に分化した。第3段階では、HZMプラスHGF、OSMおよびヒドロコルチゾン21-半ミコミネートナトリウム塩を使用して、肝前駆細胞をHLCsに分化し続けた。

プロトコルを使用する際には、次の重要な手順を考慮する必要があります。細胞の初期分化密度と中程度の変化の正確なタイミングは、分化を成功させるための重要な要素です。分化し始めると、細胞が互いに接触し始めたばかりの合流点30~40%で、細胞間空間が視野の下でネットワークに均等に配置されるように、初期シード密度が適切であることを確認する必要があります。分化の間、対応する分化培地は、特に各置換段階の第1段階および重要な瞬間において、細胞が胚発生のプロセスを模倣するモードおよびステージで分化することを確実にするために、指示された時間に正確に変更されなければならない。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
2-メルカプトエタノール		Σ M7522	肝臓前駆細胞分化用
488 標識ヤギ IgG	zsgb-bio	ZF-0512	IF用 2番目の抗体
488 ウサギIgGに対するヤギ	ZSGB-BIO	ZF-0516	IF用 2番目の抗体
Accutase	Stem Cell Technologies	7920	細胞継代
用 アクチビンA	peproTech	120-14E	決定的な内胚葉形成のために
抗アルブミン (ALB)	Sigma-Aldrich	A6684	IFおよびWB用、一次抗体
抗ヒトOct4	Abcam	Ab19587	IF用、一次抗体
抗-&α;-フェトプロテイン(AFP)	Sigma-Aldrich	A8452	IFおよびWB用、一次抗体
抗-SOX17	アブカム	ab224637	IFの場合、一次抗体
抗肝細胞核因子4α(HNF4α)	Sigma-Aldrich	SAB1412164	IF用、一次抗体
B-27 Supplement	Gibco	17504-044	決定的内胚葉形成用
BSA	Beyotime	ST023-200g	細胞ブロッキング
用 CHIR99021	Sigma-Aldrich	SML1046	決定的内胚葉形成用
DAPI	Beyotime	C1006	核染色用
DEPC-water	Beyotime	R0021	RNA溶解用
DM3189		MCE HY-12071	決定的な内胚葉形成用
DMEM/F12	Gibco	11320-033	細胞培養用
DMSO	Sigma-Aldrich	D5879	肝臓前駆細胞分化用
DPBS	Gibco	14190-144	細胞培養用
GlutaMAX	Gibco	35050-061	肝臓前駆細胞分化用
H&E染色キット	Beyotime	C0105S	For H&E染色肝
細胞増殖因子(HGF)	peproTech	100-39	肝細胞分化用
HepatoZYME-SFM (HZM)	Gibco	17705-021	肝細胞分化用
ヒドロコルチゾン-21-ヘミスコハク酸	Sigma-Aldrich	H4881	肝細胞分化用
インドシアニン	サンゴンバイオテック	A606326	インドシアニン染色用
ノックアウトDMEM	Gibco	10829-018	肝臓前駆細胞分化用
ノックアウトSRマルチ種	Gibco	A31815-02	肝臓前駆細胞分化用
マトリゲルhESC認定	コーニング	354277	細胞培養
用 MEM NeAA	Gibco	11140-050	肝臓前駆細胞分化用
mTesR 5Xサプリメント	細胞技術	85852	細胞培養
用 mTesR 基礎中	幹細胞技術	85851	細胞培養用
オンコスタチン (OSM)	peproTech	300-10	肝細胞分化用
P450 - CYP3A4 (ルシフェリン - PFBE)	Promega	V8901	CYP450活性
用 PAS染色キット	Solarbio	G1281	PAS染色用
Pen/Strep	Gibco	15140-122	細胞分化用
ペルオキシダーゼ結合ヤギ 抗マウス IgG	ZSGB-BIO	ZB-2305	WB用 2番目の抗体
一次抗体希釈バッファーウェスタンブロット	Beyotime	P0256	一次抗体希釈用
ReverTraAce qPCR RTキット	東洋紡	FSQ-101	cDNA合成用
RNAiso Plus	TaKaRa	9109	RNA単離用
RPMI 1640	Gibco	11875093	決定的な内胚葉形成用
スキムミルク	サンゴンバイオテック	A600669	二次抗体調製用
SYBRの緑のマスターの組合せ	RT-PCRの分析	モフィッシャー科学	A25742
Torin2	MCE	HY-13002	決定的な内胚葉の形成のための
Tween	ΣSigma-Aldrich	WXBB7485V	洗浄緩衝液の準備のため