光ファイバー共焦点レーザー微小内視鏡検査を用いた眼内ドラッグデリバリーシステムの時空間的イン ビボ イメージング

生体系における薬物の血クリアランス、組織分布、および標的占有率は、生体内薬物の性質を理解するための柱である。前臨床動物モデルでは、これらのパラメータは、通常、薬物投与後の特定の時点で頻繁に血液および組織サンプリングによって評価される。しかし、これらの手順は、一般に侵襲的であり、多くの場合、非生存測定、および統計的パワーのための大きな動物コホートを必要とすることを含む。動物の過度の使用に対する倫理的な懸念と共に、余分なコストと時間が発生する可能性があります。その結果、非侵襲的イメージングは、バイオディストリビューション研究の不可欠なステップになりつつあります。共焦点レーザー顕微鏡(^CLM1,2)は、高感度かつ高分解能の生きている動物の目の中で治療の時空間分布を非侵襲的に画像化する眼球用途に適しています^1,3,4。

CLMは、DDSおよび薬物バイオアベイラビリティの包括的な定量化に先立ち、リポソームなどの眼内薬物送達システム(DDS)の堅牢なスクリーニングを容易にする可能性を有する。リポソームは、物理化学的および生物物理学的特性を調整する柔軟性に対して魅力的です5,6,7,8,9,10,11は、多種多様な治療貨物をカプセル化し、薬物放出および作用持続期間の組織部位を制御する。リポソームは、モノクローナル抗体ベバシズマブ¹²などの大きな分子の送達のための眼球用途で使用されており、シクロスポリン¹³やガンシクロビル¹⁴のような小分子が使用されている。薬物を含むリポソームは、非リポソーム「フリードラッグ」製剤と比較して、生物学的半減期および長期治療効果を有する。しかし、眼組織における薬物分布は、典型的には、眼の流体成分(すなわち、血液、房水、および膜膜房^15、16、17)における薬物濃度から外挿される。装填された薬物貨物の初期のin vivo運命は、ナノキャリア自体の特性によって定義されるので、蛍光リポソームのCLMイメージングは、組織ターゲティングおよびその地で組織の滞留時間を明らかにする薬物の代理として役立つことができる。さらに、CLMによる送達の視覚的証拠は、DDS再設計を操縦し、薬物の治療上の利点を評価し、おそらく有害な生物学的事象(例えば、長引く期間のDDSの好ましくない局在化による組織毒性)を予測することさえできる。

ここで、デュアルバンドCLM系を有する生きたマウスにおけるリポソームの眼の生体分布を研究する方法について、ステップバイステップの手順を詳述する。この特定のCLMシステムは8フレーム/sの頻度の2色蛍光(緑および赤色の励磁レーザーは488 nmおよび660 nmで)をリアルタイムで検出できる。このプロトコルは、検出プローブを目の上に物理的に配置することにより、2%エバンスブルー(EB)染料で静脈内注射されたマウス(IV)での結膜下投与時の緑色蛍光リポソームの画像取得および分析を示す。EB色素は、赤い蛍光チャネルで血管形成構造を可視化するのに役立ちます。我々は、リン脂質POPC(すなわち、1-パルミトイル-2-オレロイルグリセロ-3-ホスホコリン)とフルオレセインタグリン脂質Fl-DHPE(すなわち、リン脂質を含む)で構成される100nm中性リポソームを評価する研究の代表的な結果を示す N-(フルオレセイン-5-チオカルバモイル)-1,2-ジヘキサ-デカノイルスン-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン) 95% POPC: 5% Fl-DHPE (図1B)).CLMは、EB染色された眼組織境界の線引きによって、15 μm軸方向および3.30 μmの横方向分解能で緑色のフルオレセインタグ付きリポソームを捕捉することができます。

ここに記載されているすべての方法は、SingHealth(シンガポール)の制度的動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されています。メスのC57BL/6 Jマウス(生後6~8週、18~20g)はシンガポールのInVivosから入手し、シンガポールのデュークNUS医学部の温度と光制御されたビバリウムに収容された。動物は、眼科および視覚研究における動物の使用に関する視覚・眼科研究協会(ARVO)のガイドラインに従って治療された。

注: 主な手順を強調表示するフローチャートを 図 2 に示します。

1. 造影剤の調製: エバンスブルー (EB) とリポソーム

1. 2%のEB色素溶液については、50mLの無菌生理食糸に1gのEBを溶解する。0.22 μmフィルターを使用して1.5 mLの無菌チューブにフィルターを入れ、室温で保存して後で使用します。
2. 緑色蛍光リポソームの場合は、POPC/Fl-DHPE(95:5)、クロロホルム/メタノール(2:1)を100 mLの丸底フラスコに加えます。40°Cで150rpmのロータリーエバポレーターを1時間使用し、0 ^mbar1 で真空を維持して薄い脂質膜を作ります。
   注:分布に対するリポソーム特性(例えば、サイズ、電荷、脂質飽和、脂質鎖長)の影響を比較する場合、Fl-DHPEまたは他の蛍光脂質の一定の割合を維持し、観察された結果が試験された特性の影響によるものであり、かつ大きな疎水性染料の可変負荷に起因していないことを確認します。
3. 脂質膜をリン酸緩衝生理食塩水(26.3mMの蛍光リポソームを達成するため)を40°Cで水和し、マルチラメラ小胞(MLV)を形成する。MLVをガラスシリンジにロードして、手動押し出し(0.08 μmの細孔サイズのポリカーボネートフィルターを使用して30回)、所望のサイズの100 nmを達成します。
   注: 水分補給の温度は、脂質の転移温度よりも高くなければなりません。
4. リポソームを0.22 μmの滅菌シリンジフィルターに通してフィルターします。動的光散乱システムを使用してリポソームの流体力学的直径(_DH)を確認します。

2. 生きたマウスにおけるEBおよびリポソームの投与

1. 結膜下注射の2時間前に尾静脈(2.5mg/kg)を介してEB IV(静脈内)でマウスを注入します。
2. 結膜下注射の場合、まず、十分な麻酔面を達成するために、誘導室で吸入を介して5%イオブルランを使用してマウスを鎮静させる。マウスを鼻コーンに移し、処置全体を通して加熱パッドの上でイオブルランの2%-2.5%で沈下を維持する。
3. 注射する目の近くのウィスカーをトリミングし、目に直接0.5%プロキシメタカイン塩酸塩溶液の局所麻酔薬の滴を植え付けます。
4. 蛍光リポソーム(Fl-DHPE:0.78 mg/kg)で10μLのガラスシリンジ(32G針付き)をロードし、注射前にシリンジ内のすべての気泡を払拭します。
   注:最大20 μLの注入は、^mice18,19の結膜下腔に収容できます。
5. トゥイザーを使用して、結膜を少し持ち上げ、結膜下腔にゆっくりと注入します(図1A)。逆流を防ぐために針をゆっくり引き出してください。蛍光リポソームで満たされた可視のブレブが形成されていることを確認します(図1C)。
6. 注射後に1%のフシズ酸を目に投与し、意識を取り戻すまでマウスを監視する。

3. CLMセットアップ

1. CLMシステムの電源を入れ、コネクタとスキャンプローブの遠位先端の両方がクリーンであることを確認します。
2. メーカーの指示に従って、光学式コネクタクリーナーを使用してスキャンプローブのコネクタをクリーニングします。
   1. 光学コネクタクリーナーのラチェット(しばしば色付き)を押して、クリーニングリボンを表示します。
   2. コネクタをクリーニング リボンに接続して、接触を維持しながら、コネクタをリボンに沿ってスライドさせます。
3. プローブの遠位先端(スキャンチップとも呼ばれる)をクレンジング液に浸し、続いてメーカーが提供するリンス溶液を洗浄します。綿の先端の塗布器はまた先端が非常に汚れている場合より徹底的なクリーニングのために使用することができる。
4. プローブをCLMシステムに接続します。[視野(FOV)]と、この時点での取得ファイルの場所を選択します。
   注:Fl-DHPEの蛍光検出が線形範囲内になるように、このステップでレーザー強度を調整します。レーザー強度は、異なる時点で撮影された画像間の比較のために一貫して保たれている。
5. 指示に従ってシステムを15分間ウォームアップし、校正キットを使用してメーカーの指示に従ってシステムをキャリブレーションします。
   注: キャリブレーション キットには、クレンジング ソリューション、リンス溶液、および内部校正用のフルオロフォア 488/660 nm 溶液の 3 つのバイアルがあります。キャリブレーション手順はシステムによってプロンプトされ、それに従う必要があります。
   1. クレンジングバイアルにチップを浸し、その後にリンスバイアル(各バイアルに5 s)を浸します。両方のチャンネルのバックグラウンド録画のために空中に置いておきます。
      注: このステップは、プローブの異なるファイバーからの背景値を正規化し、画像の均一性を保証するので非常に重要です。
   2. クレンジングバイアルにチップを浸し、その後にリンスバイアル(各バイアルに5 s)を浸します。プローブ内の異なる繊維からの信号値を正規化するために、5秒間フルオロフォア488nmバイアルにチップを浸します。
   3. クレンジングバイアルにチップを浸し、その後にリンスバイアル(各バイアルに5 s)を浸します。蛍光シグナルが3.5.2に記録されるまで、リンスバイアルにチップを浸します。消える。プローブ内の異なる繊維からの信号値を正規化するために、660 nmバイアルのフルオロフォアに先端を浸します。
      注:適切なキャリブレーションと最適な画質を実現するために、すべてのキャリブレーション手順に従ってください。
6. プローブのキャリブレーションが完了したら、プローブのバックグラウンド値ができるだけ低いかどうかを確認します。使用する CLM システムの場合は、背景値を 100 以下にしてください。値が100/定義されたユーザー値を超えている場合、またはプローブが汚れているように見える場合は、綿の先端アプリケーターとキャリブレーションでプローブのクリーニングを繰り返し実行します。これは、バックグラウンドノイズが同じ値の周りに保持されることを保証するためです。
   注: プローブ条件が類似していることを確認するには、最大バックグラウンド値(手順 3.6 で説明した 100 など)を定義することが重要です。これにより、異なるタイム ポイントで撮影した画像間で適切な定量的比較が可能になります。この値は、システムやプローブの条件によって異なる場合があります。
7. 動物温度コントローラ(ATC)のスイッチを入けます。ATC を 37 °C に調整します。 外科用ドレープで加熱パッドを覆い、加熱パッドのノーズコーンを固定します。
   注:画像撮影期間を通して動物が暖かく保たれるように、加熱パッドが付いているATCが必要です。
8. 解剖顕微鏡のスタンドを卓上に固定して固定します。顕微鏡の接眼部を回転させて調整し、ユーザーが座ったときにマウスの目を眼球を通して目を通して回転させ、調整します(動物を置いた後に調整を行います)。
9. 誘導チャンバーで5%イオブルランを使用してマウスを鎮静させます。動物が反応しなくなったらマウスを鼻コーンに移し、処置中に加熱パッドの上にいる間に2%-2.5%のイオブルランで沈下を維持する。
10. マウスのウィスカをトリミングし、麻酔薬0.5%のプロキシメタカイン塩酸塩溶液を目に植え付けます。
11. 目がきれいであることを確認するには、目の表面を洗浄するために生理液を数滴落とします。
12. マウスの目が0.67倍の倍率で直接焦点を合わせるように顕微鏡を調整します。
    注:必ず目を生理食塩水で潤滑してください。画像処理を通して目が潤滑されない場合、乾燥し、レンズが結晶化する原因となります。その結果、CLMイメージング中に、レンズはバックグラウンドの赤色蛍光を発する可能性があります。

4. CLMと獲得によるマウス目のライブイメージング

1. レーザーをオンにし、プローブを目の上に置き、取得の記録を開始し、 図3のアイマップに示された領域で目の蛍光を観察します。
   注: プローブの遠位端を持つペンのようにプローブを画像化する領域に直接保持します。
2. すべてのリージョンにフラグが設定され、ラベルが付いてきたら、録画を停止します。取得ファイルは、手順 3.4 で選択したファイルの場所に自動的に保存されます。
   注:ファイルは、個々の画像にエクスポートすることができ、ビデオファイルとして保存されます。記録が行われた正確なフレームでのプローブの位置を正確に知るために、眼球図に従ってフラグにラベルを付けます。

5. 画像解析

1. 同じCLM取得ソフトウェアを使用して、画像取得ファイルをエクスポートして、さらに分析します。[ファイル]をクリック |エクスポート して、エクスポート先の形式を選択します。Mkt形式のファイルは、検索テーブル(LUT)の調整を可能にし、CLMビューアソフトウェアを使用して画像ファイル形式にさらなるエクスポートを行います。
2. 蛍光強度を正確に比較するには、すべての画像ファイルをエクスポートする際に、各チャンネルに対して調整された同じ LUT を使用します。
   注:バックグラウンド蛍光測定値を最小限に抑えるために、コントロールマウスの(リポソームを注入しない)に対して最小および最大のLUT閾値を選択します。
3. 適切な画像処理ソフトウェア/フリーウェアプログラム(例えば、ImageJ)で画像を開きます。関心領域 (ROI) を描画します。
   注: ここでの ROI は、処理プログラムの対象地域を指します。ほとんどの場合、ROI は画像全体のスキャンになります。しかし、リンボを撮像する場合、プローブは手足の画像を別々に取得することはできません。したがって、 ROIは、図4に示すように、四肢領域の蛍光を「定量化」するために描かねなう必要があります。ROI の一貫性を保つには、すべてのイメージで同じ ROI を使用します。
4. 緑色蛍光の ROI 値を測定および記録します。スプレッドシートに値を入力します。ROI の平均値と蛍光強度 (a.u.) の値を集計します。

6. ヒストロジー評価

1. ローカルIACUCによって承認された方法を使用してマウスを安楽死させる。
2. 眼を欠核化し、一晩4%ホルムアルデヒドまたは10%ホルマリン溶液の1mLで目を固定します。
3. 余分な脂肪をトリミングし、最適な切断温度(OCT)化合物に目を埋め込み、少なくとも1日間-80°C冷凍庫で凍結し続けます。
4. 20°Cに保たれた切断温度でクライオスタットの厚さ5μmの切削切れセクション。 セクションをポリL-リジンコーティング顕微鏡スライドに移します。
   注: ヒストロジーは、DDS の分布の追加の検証として機能できます。しかし、CLMを使用して削減することを目指す動物の追加の最適化、技術的専門知識、犠牲が必要です。

このプロトコルは、結膜下注射によって投与される緑色蛍光リポソームの時空間的眼分布を評価するためのCLMの有用性を示す。CLM系のデュアルカラー機能(488nmおよび660nm励起波長)を利用するために、注入される100nm中性POPCリポソームを5%Fl-DHPE(組成および特性評価データを 図1Bに示す)でドープし、EBをIV注入して目のランドマークを識別した。高血管化されたエピスクレラと結膜の薄い層の存在は、強膜領域をEB(図4A、Sとラベル付け)で赤く染色することを可能にし、血管構造を含まない角膜(図4A、Cとしてラベル付け)は染色されず、黒く見える。これにより、蛍光イメージング中に両方の領域間で明確な分化が可能になります。

代表的な結果は、7日間にわたる分布研究(n=4匹のマウス)からである。1日目と3日目の画像の蛍光強度が高く(図5B)、より良い視覚化のためにピクセル強度が低下した。蛍光強度の実際の値は、グラフに反映されます(図6)。画像からの観察がリポソームからの蛍光によるものであり、フリー色素ではなく、リポソームから外れた可能性があることを確認するために、フルオレセイン(Fl)色素を注射したコントロールマウスが含まれていた(図5A)。

リポソームの減少(緑色蛍光シグナルの減少の代理による)は、経時の両方の四肢およびスクレラ領域で観察された。リポソームは、結膜下腔の側頭から上方領域に注入され(図3)、結膜下腔の他の領域に到達する前に、側頭および上側のスクラ(図4B)の上に自然に配置された。1日目の注射後、側頭炎で検出された蛍光は、側頭領域と優れた領域の両方で、四肢よりも最大6倍高かった(図6)。3日目と7日目までに、側頭領域のスクレア(1日目から3日目(1日目から3日目(1日目→3)から88%、3日目から7日目(→ 3日目)から7日目(3日目)から88%のリポソームが有意に減少し、1→3日目、日3→7のリポソームが有意に減少し、その後、1日目から3→7日目に減少した。 p<0.001)をそれぞれ示す(図6)。この減少は、結膜およびエピスクレラで見つかった血液および/またはリンパ管を通る眼クリアランス機構に起因した。リポソームはまた、強膜を介して拡散し、また、高度に血管化されている脈絡膜によってクリアすることができます。

リポソームは、手足の遅い方法でクリアしていることが判明しました.側頭肢および上肢について、注射後1日目から3日目までの蛍光シグナルの変化は有意ではなく、中性リポソームが四肢領域、特に角膜周辺に好みがあることを示す(図5B)。リンブス領域のリポソームは、3日目からクリアを開始しました(d3→7:時間<0.01の場合は-89%、優れた方が-53%(p<0.05)です)。7日目までに、リポソームの50%がまだ検出された上肢1Sを除くすべての四肢領域(p<0.05)から90%以上のリポソームがクリアされた(p>0.05)。これは、他の領域と比較した場合、上肢/角膜周辺(図5および図6)において中性リポソームの滞留時間が非常に高いことを示す。蛍光の最低量は、注射部位からの距離のために、すべての時点で鼻および下の領域で検出された(図6A、B)。

以前に報告された眼中のリポソームのクリアランスのより包括的な研究では、我々は、結膜下注射後に眼組織からリポソームをクリアすることができるいくつかの経路を議論した。リポソームは、高血管化された結膜、エピスクレラ、脈絡膜を介して全身循環およびリンパ球クリアランスによってクリアすることができるが、強膜を通る受動的な拡散によってより深い眼内組織に到達することもできる。流体の流れはまた、脂肪性メッシュワークまたはウベオスクレア流出を介してリポソームを輸送することができ、リポソームをスクレラに戻すことができます。涙を通して除去することも可能であり、注射部位の軽微な漏出は受動的拡散を通して角膜の浸透を可能にする可能性がある。

図1:目の中のリポソームの結膜下注射(A)緑色蛍光リポソームおよび結膜下注射のグラフィカル表現。(B)眼CLMイメージング用のFL-DHPEドープリポソーム製剤の組成および特性。(C)結膜下注射時にブレブを形成する緑色蛍光リポソーム。この図は、チャウS.Y.ら1の許可を得て適応されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図2:眼のCLM手順のタイムラインをクリックして、この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図3:CLMスキャンのアイマップ 領域1は四肢領域を指し、領域2はスクレラ領域を指す。ビデオと画像は1Tから反時計回りに撮影され、その後に2Tが同様の反時計回り方向に撮影されました。針は2Tから2Sに向けて注射用に挿入されたように、関心のある領域は主に1T、1S、2T、および2Sである。[挿入]は、マウスの目に対するプローブのサイズを示します。この図は、チャウS.Y.ら1の許可を得て適応されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図4:画像解析(A)蛍光タグリポソームのImageJ分析は、リポソーム存在のために四肢(L)および強膜(B)(B)に対して定義された対象領域(ROI)を用いて行った。肢に検出されるリポソームの可能な位置は、1)角膜周囲、2)リンブスまたは3)スクレラ周辺である。この図は、チャウS.Y.ら1の許可を得て適応されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図5:手足と鎖ラのコントラスト分布 リンブスでのコントラスト分布(1S:スーペリア、 1N:鼻、1I:下側、1T:側頭)およびスクレラ(2S:スーペリア、2N:鼻、2I:劣る、2T:各コホート(n=4)から7日間にわたる1つの代表的マウスの側頭領域(A)フルオレセイン(Fl)コントロール、(B)100nm中性リポソーム(POPC-100)赤い色はEB染色を示します。スケールバー= 50 μm(C) 撮影した画像は、より理解を深めるようアイマップ上に組み立てられます。この図は、チャウS.Y.ら1の許可を得て適応されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図6:7日間にわたるスクレラ(A)およびリンブス(B)領域における100nm中性POPCリポソームのクリアランス動態(n=4匹のマウス/グループ)。 平均蛍光強度は、2ウェイANOVAによって比較され、前回の時点に対して複数の比較が行われました。d1→3 および d3→7;*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図7:Fl-DHPEリポソームの注射後1日マウス眼の横断断面(5μm)の代表的な構成画像。 点線は、リポソームが観察される場所を示し、緑色で示されます。スケールバー= 500 μm. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

著者らは開示するものは何もない。