ニューラル様組織の工学的なマウス皮質アストロサイトの3Dバイオプリンティング

サマリー

ここでは、中枢神経系におけるアストロサイトの機能性と神経疾患や治療におけるグリア細胞を含むメカニズムを研究するために、神経様組織をバイオファブリケートするための3Dバイオプリン皮質アストロサイトの方法を報告する。

要約

アストロサイトは、神経の支持および機能性を含む中枢神経系(CNS)に不可欠な役割を持つグリア細胞である。これらの細胞はまた、神経損傷に応答し、変性事象から組織を保護するために作用します。アストロサイトの機能性の インビトロ 研究は、このような事象に関与するメカニズムを解明し、神経疾患を治療するための治療法の開発に貢献するために重要である。このプロトコルは、3Dバイオプリンティングアストロサイトを含むバイオインクによってアストロサイトに富んだ神経様組織構造をバイオファブリケートする方法を説明する。この研究では、押出ベースの3Dバイオプリンターを使用し、C57Bl/ 6マウスの脳皮質からアストロサイトを抽出した。バイオインクは、ゼラチン、ゼラチンメタクリロイル(GelMA)、フィブリノーゲンからなる生体材料溶液に皮質アストロサイトを最大3から混合して調製し、最適なバイオプリンティング条件を提示した。3Dバイオプリンティング条件は細胞ストレスを最小限に抑え、74.08%±細胞がバイオプリンティング直後に生存可能であったプロセス中のアストロサイトの高い生存率に寄与した。インキュベーションの1週間後、アストロサイトの生存率は3.00%±83.54%に有意に増加し、3D構築物が細胞増殖に適した微小環境を表すことを示している。生体材料組成物は、細胞結合および刺激された星状細胞の挙動を可能にし、細胞は特異的なアストロサイトマーカーの線維性酸性タンパク質(GFAP)を発現し、典型的な星状形態を有する。この再現性プロトコルは、細胞の天然微小環境に似たアストロサイトに富んだ3D神経様組織をバイオファブリケートする貴重な方法であり、アストロサイトの機能性と神経疾患に関与するメカニズムとの関係を理解することを目的とした研究者に有用である。

概要

アストロサイトは中枢神経系(CNS)の中枢細胞の中で最も豊富な細胞型であり、脳恒常性において重要な役割を果たす。神経細胞の永続的なサポートに加えて、アストロサイトは神経伝達物質の取り込みを調節し、血液脳関門の完全性を維持し、ニューロンシナプス発生^1、2を調節する役割を果たします。アストロサイトはまた、CNS炎症に必須の役割を有し、アストロシタリ機能または反応性アストログリ^{オーシス3、4}に至る過程で脳の傷害に反応し、変性剤⁵に対する健康な組織の広がりを防ぐグリア瘢痕を形成する。この事象は、アストロサイトの遺伝子発現、形態、および機能^6,7の変化をもたらす^。したがって、アストロサイトの機能性を含む研究は、神経疾患を治療するための治療法の開発に役立ちます。

インビトロ モデルは神経損傷に関連するメカニズムを研究するために重要であり、皮質アストロサイトの正常な分離と2次元(2D)培養が確立された^が、このモデルは、ネイティブの....

プロトコル

動物に関するすべての手順は、研究における動物の使用に関する国際的なガイドライン(http://www.iclas.org)に従い(http://www.iclas.org)、サンパウロ連邦大学研究倫理委員会(CEUA 2019/9292090519)によって承認されました。

1. マウスの脳解剖

1. 冷たいハンクス緩衝塩溶液(HBSS)の10 mLを100mm培養皿に、1 mLを1.5 mLマイクロチューブに移します。動物1匹につき1本のマイクロチューブを用意する。
   注:文化料理とマイクロチューブの両方を氷の上に保管する必要があります。
2. DMEM F12+ 10% 胎児血清 (FBS) 2% グルタミン、および 1% ペニシリンストレプトマイシン (P/S) を使用してアストロサイト培地を調製します。0.2 μm フィルターを使用してフィルター処理して、培地を殺菌します。
3. C57Bl/6マウスの子犬(出生後1日目)を鋭利な操作ハサミを使用して切断して安楽死させる。鉗子を使用して、皮膚を引っ張り、頭蓋骨を露出させます。はさみと鉗子の両方が70%エタノールで殺菌されることを確認する。
4. 鋭い湾曲した先端のはさみを使用して、頭蓋のマグナムから頭の上に頭蓋骨を切ります。
   注:脳の組織が損傷していないことを確認してください。
5. エタノール70%で殺菌したヘラを使用して、脳を頭蓋腔から....

結果

この研究は、3Dバイオプリンティング技術を用いて、層ごとの一次アストロサイトを含むゼラチン/GelMA/フィブリノーゲンバイオインクを堆積させる神経様組織の開発を目的とした。アストロサイトをマウスの子犬の大脳皮質(図1)から抽出して単離し、生体物質組成物に添加し、生きた3D構築物のバイオファブリケーションを可能にした。

コンピュータ支援設計(CAD)は、栄養素と酸素の拡散を促進することを目的として、1mmの細孔を持つ正方形の形状(0.6 x 0.6mm)の相互接続されたフレームとしてGコード(補足ファイル)を使用して開発されました。フレームは、各層の上に配置された6つの層で構成され、すべての層の90°の角度で変化した(図2Ai)。 設計された構造は、約5mmの高い(図2A ii)を有し、組織操作を可能にす.......

ディスカッション

3Dバイオプリンティング技術は、脳²³を含む天然組織²²に構造的および生理的に類似した精製構造の工学を可能にするバイオファブリケーション代替手段として浮上している。神経様組織のバイオファブリケーションは、生体外の天然の微小環境モデリングを可能にし、CNS11に影響を及ぼす多くの疾患の開発および治療に関連する細胞および分子機構を理解するための重要なツールである。神経機能におけるグリア細胞の重要な役割のために、皮質アストロサイトは、脳発達^24、生体分子輸送^25、神経突起伸長^26、および脳様組織バイオファブリケーション¹⁴など多くの研究で使用されてきた。

アストロサイトの3D培養を設計する方法は、以前に報告されました, 異なる生体材料と足場.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
3Dバイオプリンター	3Dバイオテクノロジーソリューション		押出ベースのバイオプリンター
鈍い先端の鉗子	インテグラ・ミルテックス	6--30	脳解剖用鉗子 以前に滅菌された
牛血清アルブミン	Sigma-Aldrich	9048-46-8	プロテアーゼフリー、脂肪酸フリー、基本的にグロブリンフリー
CaCl2	Sigma-Aldrich	10043-52-4
細胞培養フラスコ	フィッシャーサイエンティフィック	156340	培養フラスコT25
細胞ストレーナー	ニング社	352340	細胞ストレーナー40µm
共焦点顕微鏡	ライカ		共焦点 TCS SP8 顕微鏡とオリンパス FluoView 300 共焦点システム
円錐管	Thermo Scientific	339651、339652	15 mL および 50 mL の滅菌チューブ
DAPI		Abcam ab224589	DAPI 染色液
DMEM/F12	Gibco;ライフテクノロジーズコーポレーション	12500062	DMEM/F-12 50/50、1X(ダルベッコのMod。Eagle's Medium/Ham's F12 50/50 Mix) と L-グルタミン
Dyalisis チューブ	Sigma-Aldrich	D9527	分子量カットオフ = 14 kDa
エタノール	Fisher Scientific	64-15-5	試薬グレード
胎児ウシ血清	Gibco;ライフテクノロジーズコーポレーション	12657011	研究用グレード
フィブリノーゲン	Sigma-Aldrich	9001-32-5	ウシ血漿由来フィブリノーゲンクリスタリン粉末
ゼラチン	Sigma-Aldrich	9000-70-8	ブタ皮由来ゼラチン粉末
Glycine	Sigma-Aldrich	56-40-6	グリシン粉末
ハンクス緩衝塩溶液 (HBSS)	Gibco;ライフテクノロジーズ株式会社	14175095	カルシウム、マグネシウム、フェノールレッド
L-グルタミン	Sigma-Aldrich	56-85-9	L-グルタミン結晶粉末
Laminin	Sigma-Aldrich	114956-81-9	Laminin 1-2 mg/mL L in 50 mM Tris-HCl
Live dead kit Cell Imaging kit	Thermo Scientific	R37601	生細胞の緑色蛍光(ex/em 488 nm/515 nm)。死細胞の赤色蛍光 (ex/em 570 nm/602 nm)
無水メタクリル	Sigma-Aldrich	760-93-0	GelMA調製用
マイクロチューブ	コーニング社	MCT-150-C	1.5mL
NaCl	Sigma-Aldrich	7647-14-5
針 22G	フィッシャーサイエンティフィック	NC1362045	滅菌鈍い針
操作はさみ	インテグラ ミルテックス	05--02	脳解剖用のシャープハサミ 以前に滅菌された
パラホルムアルデヒド	Sigma-Aldrich	30525-89-4	パラホルムアルデヒド粉末
ペニシリン/ストレプトマイシン	ギブコ;ライフテクノロジーズコーポレーション	15070063	ペン連鎖球菌 (5,000 Units/mL Penicillin; 5,000 ug/mL Streptomycin)
ペトリ皿	Corning Incorporated	430591, 430588	35 mm and 100 mm
Phalloidin	Abcam	ab176753	iFluor 488 試薬
Photoinitiator	Sigma-Aldrich	106797-53-9	2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-メチルプロピオフェノン
リン酸緩衝液生理食塩水(PBS)	Gibco;ライフテクノロジーズコーポレーション	10010023	PBS 1 x、培養グレード、カルシウムなし、マグネシウムなし
ポリ-L-リジン	Sigma-Aldrich	25988-63-0	ポリ-L-リジン臭化水素酸塩 mol wt 30,000-70,000
一次抗体	Abcam	ab4674	GFAPへのニワトリポリクローナル
二次抗体	Abcam	ab150176	Alexa fluor 594 抗ニワ
トリヘラ	ミルテック	V973-70	ナンバー 24 セメント スパチュラ 以前に滅菌された
実体顕微鏡	フィッシャーブランド	3000038	脳解剖用顕微鏡
シリンジ 5 mL	BD	1222C84	滅菌シリンジ
シリンジ フィルター 2 & マイクロ;m	フィッシャーサイエンティフィック	09-740-105	滅菌用ポリプロピレンフィルター
トロンビン	Sigma-Aldrich	9002--04-4	ウシ血漿からのトロンビンクリスタリン粉末
Triton X-100	Sigma-Aldrich	9002-93-1	ラボグレード
トリプシン-EDTA	Gibco;ライフテクノロジーズコーポレーション	15400054	トリプシンノフェノールレッド 1 x PBS
Versene 溶液	Gibco で希釈;ライフテクノロジーズコーポレーション	15040066	PBS
ウェルプレート	Thermo Scientific	144530	滅菌済み 24 ウェルプレート

コース