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方法論記事

ニューラル様組織の工学的なマウス皮質アストロサイトの3Dバイオプリンティング

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DOI：

10.3791/62691

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2021年7月16日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo

この記事について

サマリー

ここでは、中枢神経系におけるアストロサイトの機能性と神経疾患や治療におけるグリア細胞を含むメカニズムを研究するために、神経様組織をバイオファブリケートするための3Dバイオプリン皮質アストロサイトの方法を報告する。

要約

アストロサイトは、神経の支持および機能性を含む中枢神経系(CNS)に不可欠な役割を持つグリア細胞である。これらの細胞はまた、神経損傷に応答し、変性事象から組織を保護するために作用します。アストロサイトの機能性の インビトロ 研究は、このような事象に関与するメカニズムを解明し、神経疾患を治療するための治療法の開発に貢献するために重要である。このプロトコルは、3Dバイオプリンティングアストロサイトを含むバイオインクによってアストロサイトに富んだ神経様組織構造をバイオファブリケートする方法を説明する。この研究では、押出ベースの3Dバイオプリンターを使用し、C57Bl/ 6マウスの脳皮質からアストロサイトを抽出した。バイオインクは、ゼラチン、ゼラチンメタクリロイル(GelMA)、フィブリノーゲンからなる生体材料溶液に皮質アストロサイトを最大3から混合して調製し、最適なバイオプリンティング条件を提示した。3Dバイオプリンティング条件は細胞ストレスを最小限に抑え、74.08%±細胞がバイオプリンティング直後に生存可能であったプロセス中のアストロサイトの高い生存率に寄与した。インキュベーションの1週間後、アストロサイトの生存率は3.00%±83.54%に有意に増加し、3D構築物が細胞増殖に適した微小環境を表すことを示している。生体材料組成物は、細胞結合および刺激された星状細胞の挙動を可能にし、細胞は特異的なアストロサイトマーカーの線維性酸性タンパク質(GFAP)を発現し、典型的な星状形態を有する。この再現性プロトコルは、細胞の天然微小環境に似たアストロサイトに富んだ3D神経様組織をバイオファブリケートする貴重な方法であり、アストロサイトの機能性と神経疾患に関与するメカニズムとの関係を理解することを目的とした研究者に有用である。

概要

アストロサイトは中枢神経系(CNS)の中枢細胞の中で最も豊富な細胞型であり、脳恒常性において重要な役割を果たす。神経細胞の永続的なサポートに加えて、アストロサイトは神経伝達物質の取り込みを調節し、血液脳関門の完全性を維持し、ニューロンシナプス発生1、2を調節する役割を果たします。アストロサイトはまた、CNS炎症に必須の役割を有し、アストロシタリ機能または反応性アストログリオーシス3、4に至る過程で脳の傷害に反応し、変性剤5に対する健康な組織の広がりを防ぐグリア瘢痕を形成する。この事象は、アストロサイトの遺伝子発現、形態、および機能6,7の変化をもたらす。したがって、アストロサイトの機能性を含む研究は、神経疾患を治療するための治療法の開発に役立ちます。

インビトロ モデルは神経損傷に関連するメカニズムを研究するために重要であり、皮質アストロサイトの正常な分離と2次元(2D)培養が確立されたが、このモデルは、ネイティブの細胞挙動を模倣し、脳の複雑さを再現する現実的な環境を提供することができない.2D条件では、機械的および生化学的支持が悪いこと、低細胞および細胞マトリックス相互作用、および基底-腹極性の欠如につながる細胞平坦化は、細胞のシグナル伝達ダイナミクスおよび細胞形態および遺伝子発現の変化をもたらす実験的結果に影響を及ぼし、治療10に対する応答性を損なう。したがって、より現実的な神経環境を提供する代替案を開発し、その結果をクリニックに翻訳することを目指することが重要です。

3次元(3D)細胞培養は、CNS11を含む器官および組織の忠実性の高い特徴を再現する、より高度なモデルを表す。グリア培養に関しては、3Dモデルは、アストロサイト形態、細胞基底-極性、および細胞シグナル伝達12,13の維持に寄与する。3Dバイオプリンティング技術は、細胞と生体材料を使用してネイティブ組織の構造と特性を再現することで、3D生体組織を制御された方法でバイオハブ化する強力なツールとして登場しました。この技術の使用は、結果予測の大幅な改善につながり、CNS14、15、16に適用される再生医療に貢献しています。

ここで説明するプロトコルは、皮質アストロサイトの分離と培養について詳述する。このプロトコルはまた、ラミニンを補充したゼラチン/ゼラチンメタクリロイル(GelMA)/フィブリノーゲンに埋め込まれたアストロサイトをバイオプリントする再現可能な方法を詳述する。本研究では、1 x106細胞/mLの密度で皮質アストロサイトを含む生体材料組成物を印刷するために、押出ベースのバイオプリンターを使用した。バイオプリンティングせん断応力は、印刷速度を制御することによって最小限に抑え、そして、アストロサイトは、プロセス後に高い生存率を示した。バイオプリント構築物を1週間培養し、アストロサイトはヒドロゲル内で広がり、付着し、生存し、星状形態を維持し、特異的マーカーグリア性フィブリラリー酸性タンパク質(GFAP)4を発現することができた。

この手順は、ピストン駆動押出ベースのバイオプリンターと互換性があり、異なるソースから得られたバイオプリントアストロサイトに使用することができます。ここで提案される3Dバイオプリントモデルは、健康組織のアストロサイト機能に関与するメカニズムの研究や、神経学的病理の進行や治療開発の理解など、幅広い神経工学用途に適しています。

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プロトコル

動物に関するすべての手順は、研究における動物の使用に関する国際的なガイドライン(http://www.iclas.org)に従い(http://www.iclas.org)、サンパウロ連邦大学研究倫理委員会(CEUA 2019/9292090519)によって承認されました。

1. マウスの脳解剖

  1. 冷たいハンクス緩衝塩溶液(HBSS)の10 mLを100mm培養皿に、1 mLを1.5 mLマイクロチューブに移します。動物1匹につき1本のマイクロチューブを用意する。
    注:文化料理とマイクロチューブの両方を氷の上に保管する必要があります。
  2. DMEM F12+ 10% 胎児血清 (FBS) 2% グルタミン、および 1% ペニシリンストレプトマイシン (P/S) を使用してアストロサイト培地を調製します。0.2 μm フィルターを使用してフィルター処理して、培地を殺菌します。
  3. C57Bl/6マウスの子犬(出生後1日目)を鋭利な操作ハサミを使用して切断して安楽死させる。鉗子を使用して、皮膚を引っ張り、頭蓋骨を露出させます。はさみと鉗子の両方が70%エタノールで殺菌されることを確認する。
  4. 鋭い湾曲した先端のはさみを使用して、頭蓋のマグナムから頭の上に頭蓋骨を切ります。
    注:脳の組織が損傷していないことを確認してください。
  5. エタノール70%で殺菌したヘラを使用して、脳を頭蓋腔から持ち上げ、10mLの冷たいHBSSを含む培養皿に入れる。
  6. 脳を含む培養皿を実体顕微鏡下に置き、2つの鈍い先端鉗子を使用して、髄液を脳から取り除く(図1)。
  7. ヘラを使用して脳の中央値線からそっと転がすことによって、脳の残りの部分から皮質を分離します。
  8. 両方の皮質を収集し、すぐに冷たいHBSSの1 mLを含む同じマイクロチューブにそれらを転送します。

2. アストロサイトの孤立と文化

  1. 層流の下で、湾曲したマイクロハサミを使用して皮質組織を小さく切り、3倍上下にピペットを入れて1mLのHBSSで洗浄します。組織が落ち着くのを待ちます。HBSSを取り外し、新しいHBSSを追加して、このプロセスをさらに2回繰り返します。
  2. HBSSを取り除き、37°Cで0.05%トリプシンの1 mLで組織を5分間インキュベートします。
    注:この時点で、トリプシン消化だけで十分です。
  3. 15倍上下に軽くピペットを入れ、組織を機械的に解化します。
    注:組織の完全な解離は、懸濁度の増加と懸濁液中の組織の大きな断片の欠如によって観察される。
  4. 溶液を15 mLの円錐形チューブに移し、同量のFBSを加えてトリプシン活性を中和し、0.4μmの細胞ストレーナーフィルターで溶液をフィルタリングして解化されていない断片を除去します。
  5. フィルターを1mLのアストロサイト培地で洗浄し、ストレーナーを通過した細胞懸濁液を回収し、200xgおよび25°Cで5分間遠心分離する。 遠心分離後、上清を捨て、1mLのアストロサイト培養培地中にペレットを懸濁させた。
  6. 細胞懸濁液をT25培養フラスコに移し、培地の体積を3.5mLにし、37°Cおよび5%CO2で細胞をインキュベートする。
  7. 24時間後、細胞が接着していることを確認してください。その後、培地を交換し、3日ごとに交換します。
  8. 7日後、2mLの1xPBSで細胞を洗浄することにより、培養液からミクログリアおよびオリゴデンドロサイトを除去する。
  9. PBS溶液をアストロサイト培地に交換し、培養フラスコを一晩180rpmで軌道シェーカーに残します。
    注:アストロサイトは、約10〜12日間の文化でコンフルエント単層を形成します。

3. ゼラチンメタクリロイルの合成(GelMA)

  1. ブタ皮から得られたゼラチン10gを秤量し、溶液を完全溶解するまで240rpmおよび50°Cの加熱板で攪拌させることによりPBSの100mLに溶解する。
  2. フードの下に、低い機能化のためにメタクリル無水物(MA)の2mLを加え、ゼラチンエマルジョンを240rpmと50°Cで2時間撹拌します。
    注意:MAハザードステートメント:H302 + H332(飲み込んだり吸入した場合に有害)、H311(皮膚に接触する毒性)、314(重度の皮膚火傷および眼の損傷を引き起こす)、315(皮膚刺激を引き起こす) )、H317(アレルギー性皮膚反応を引き起こす可能性がある)、H318(重篤な眼の損傷を引き起こす)、331(吸入すると有毒)、H332(吸入すると有害)、H335(呼吸刺激を引き起こす可能性がある)。取り扱いガイドライン:P261(ほこり/煙/ガス/ミスト/蒸気/スプレーを吸い込むのを避ける)、P305 + P351 + P338 + P310(IF IN EYES:数分間水で慎重にすすいます。コンタクトレンズを外し、存在していて簡単に行うことができます。すぐにポイズンセンター/医師を呼び出す)、P301 + P312 + P330 (飲み込んだ場合:気分がよくな場合は毒センター/医師を呼び出します。口をすすいでください)。
    注:MAを非常にゆっくりと追加し、ドロップでドロップします。
  3. 予熱したPBS(50°C)の100mLでゼラチン-MA溶液を希釈し、200mLの最終体積を得て、240rpmと50°Cで10分間攪拌させます。
  4. 約20cmの透析膜(分子カットオフ12-14kDa)を切断し、脱イオン水に浸して柔らかくなるまで浸します。
    注:膜に脱イオン水を充填して、穴や欠陥がないことを確認します。
  5. 漏斗を使用して、ゼラチンMA溶液を膜に移す。
    注: 混合を許可するために、内部に余分なスペースを残して両側を閉じます。
  6. ゼラチンMA溶液を含む膜を透析用蒸留水2Lの容器に入れ、40°Cで5日間(500rpm)かき混ぜます。
    注:水の蒸発を避けるために容器を覆います。
  7. 蒸留水を1日に2回交換します。毎回、膜を裏返して均質化します。
  8. 5日目には、予熱した超純水(40°C)を透析したゼラチンMAに200mL混ぜ、40°Cで15分間かき混ぜます。
  9. ゼラチン-MA溶液を最大25 mLの円錐管に移し、チューブを-80°Cで2日間保持します。
    注:凍結乾燥を容易にするためにチューブを水平に保管してください。
  10. 凍結溶液を3〜5日間凍結乾燥し、乾燥したGelMAを湿度から保護して保存します。

4. バイオインク製剤

注:バイオインクの1 mLを得るためには、濾過中に損失が生じる可能性があるため、少なくとも3 mLの生体材料溶液を製造することをお勧めします。

  1. フィブリノーゲン溶液の調製
    1. 脱イオン水中に生理食塩水(NaCl 0.9%)を調製し、10mgの濃度の濃度を得るために10mg/mLの生理食塩水に牛血漿から10mgのフィブリノーゲンを溶解します。
      注:フィブリノゲンがガラスに吸い付くように、フィブリノーゲン溶液を調製するためにガラスフラスコを使用しないでください。
    2. フィブリノーゲンが完全に溶解するまで、溶液を37°Cで撹拌したままにしておきます。
      注:フィブリノーゲン溶解の場合は、37°Cのオーブン内に置かれた回転式システムを使用してください。 37°Cのホットプレート上のフィブリノーゲンの磁気攪拌(180rpm)も適している。この条件下では、10mg/mLフィブリノーゲンは溶解するのに約40分かかります。
  2. ゼラチン/ゲルマ溶液の調製
    1. 0.12gのゼラチンを秤量し、予熱したPBS(40°C)の1.9mLに加え、4%(w/v)ゼラチンの最終濃度を得る。溶解を促進するボルテックス。
    2. エマルジョンは完全に溶解するまで40°Cに保ちます。
    3. 0.06 gの凍結乾燥ゲルMAを秤量し、ゼラチン溶液に移し、2%(w/v)GelMAの最終濃度を得た。溶解を促進するボルテックス。
    4. 溶液を完全に溶解するまで40°Cに保ちます。
  3. アストロサイトを含むゼラチン/ゲルマ/フィブリノーゲンバイオインクの調製
    1. ピペット0.9 mLの10 mg/mLフィブリノーゲン溶液をゼラチン/GelMA溶液に移し、フィブリノーゲンの最終濃度3mg/mLを得た。
    2. 0.015 gの光導入剤(PI)を秤量し、ゼラチン/GelMA/フィブリノーゲン溶液に移して0.5%(w/v)PIの最終濃度を得る。チューブを上下に反転して溶液を混ぜ、40°Cで光から保護し、PIの劣化を防ぎます。
      注:4°Cで最大24時間ビオインをストックしてください。
    3. 層流下で、0.2 μmフィルターを使用して溶液を無菌15 mL円錐管にフィルターします。
      注:生体材料溶液は、ろ過を可能にするために37〜40°Cでなければなりません。
    4. 生体材料溶液980μLを15 mLの円錐チューブに移します。
    5. 生理食塩水にラミニンを希釈し、100 μg/mLのストック溶液を得る。
    6. ピペット20μLのラミニンを、バイオインを含むチューブに移し、2μg/mLラミニンの最終濃度を得る。
    7. 泡を避けて上下にピペットで軽く混ぜます。気泡が持続する場合は、200 x g で円錐管を2分間遠心する。ビオインキを細胞と混合するまで37°Cに保ちます。
    8. 0.05%トリプシンで5分間、一次アストロサイトをトリプシン化します。
      注:1から3の通路からアストロサイトを使用してください。
    9. 1:1の比率でFBSでトリプシン活性を中和し、細胞を15 mLの円錐形チューブに移します。200 x g で 5 分間遠心します。
    10. セルを数え、1 x 106 細胞を別の円錐形のチューブに移します。200 x g で 5 分間遠心します。
    11. 小容量(〜200μL)を残した上清を取り除き、円錐管の底部を軽くタップして細胞ペレットを吊り下げます。
    12. ゼラチン/GelMA/フィブリノーゲン溶液1 mLを細胞を含むチューブに移し、ピペットを上下に穏やかに上下して均質化し、1 x 106 細胞/mLの最終濃度を得る。

5. 架橋剤の調製

  1. トロンビン再構成
    1. 15 mL円錐管に0.1%(w/v)のウシ血清アルブミン(BSA)を用いた滅菌脱イオン水中のトロンビン100 U/mLのストック溶液を準備します。マイクロチューブの在庫は-20 °C。
      注:トロンビンはガラスに吸い込むので、ストック液を準備したり、アリコートを保管したりするためにガラスのフラスコを使用しないでください。
  2. トロンビン-CaCl2 溶液の調製
    1. ピペット100 μLのトロンビンストック溶液を、8.9 mLの無菌脱イオン水を含む50 mLの円錐状チューブに移し、1 U/mLトロンビンの最終濃度を得た。
    2. 脱イオン水で10%(w/v)CaCl2溶液を調製し、0.2 μmフィルターを使用して滅菌します。
    3. 10%CaCl2溶液の1.1mLをトロンビンを含む円錐管に移し、最終比1:9(クロンビンに対するCaCl2)を得た。
      メモ:実験で使用するボリュームでクロスリンカーソリューションを準備し、ストレージを避けてください。

6. 押出しベースのバイオプリンターを用いたバイオプリンティングアストロサイトを含むバイオインク

  1. 神経組織の設計
    1. Gコードを使用する:X軸とY軸上の各バイオプリント線の間の距離の1mm、Z軸(各線の間に0.2mm)の6層の間の距離を持つ6 x 6 mm(正方形)のグリッドを構築します。押し出し(E)を0.01mmに設定し、Z軸の新しい層ごとに0.001 mmを増加させます。印刷速度(F)を400 mm/min(補足情報)に設定します。
  2. バイオプリンターのセットアップ
    1. 15分間紫外線に機械を露出させ、エタノール70%で拭き取ります。
    2. 電源スイッチを使用して、バイオプリンターの電源を入れます。USBケーブルでコンピュータにコンピュータを接続します。制御ソフトウェアを開いてバイオプリンターに接続し、ファイル設計をロードします。
  3. バイオプリンティングシリンジの調製
    1. アストロサイトを含むゼラチン/GelMA/フィブリノーゲンバイオインクを1,000 μLピペットを使用して5 mLプラスチックシリンジに移します。
      注:バブルの形成を避けるためにゆっくりと転送します。
    2. 滅菌22G鈍い針を注射器に接続します。
      メモ:注射器は4°Cで2分間放置します。
    3. シリンジをバイオプリンターのプリントヘッドに接続し、バイオインクを手動でフラッシュして残りの気泡を取り除きます。
  4. バイオプリンティング
    注:バイオプリンティングは、ラミナーフードの外側で行われました。
    1. バイオプリンターテーブルに35mmの培養皿を置き、針の動きを可能にするために、培養皿表面から0.1mm離れた場所に針を置きます。
      注:各バイオプリンティングに35mmの培養皿を1つ使用してください。
    2. 印刷ボタンを押します。
    3. バイオプリンティングが終わったら、注射器が皿から離れるようにしてください。次に、培養皿を閉じ、架橋処理に備えます。
      メモ:1つの構成体のバイオプリンティングは約1分と10 sかかります。
  5. バイオプリント構造と培養物の架橋
    1. GelMA架橋用の2 x 60 s(上下)の場合は、2 mW/cm2 の UV 光の下に培養皿を置きます。
    2. 層流の下で、生殖不能のへらを使用して24ウェルプレートにバイオプリント構造を移す。
    3. 500 μLのトロンビン/CaCl2 溶液を加え、30分間放置してフィブリン架橋を可能にします。
    4. 架橋液を取り出し、2 mLのPBS 1xで洗浄します。次いで、PBSを1mLのアストロサイト培養培地に置き換え、37°Cおよび5%CO2でインキュベートする。3日ごとにメディアを変更します。

7. アストロサイトの生存率の評価

  1. バイオプリントアストロサイトの生存率
    1. スパチュラを使用して、バイオプリントコンストラクトを35mm培養皿に移します。
    2. 1mLの1x PBSで構成体を洗浄します。
    3. ライブ/デッド試薬の100 μLをコンストラクトに堆積させ、37°Cで30分間保ち、光から保護します。
    4. ライブ/デッド試薬を取り出し、1mLの1x PBSで洗浄します。
    5. サンプルをヘラを使用して共焦点皿に移し、画像取得のために488および570 nmの励起を使用して共焦点顕微鏡の下で構築物内の細胞を観察する。
      注: コンストラクト内のセル全体を視覚化するには、10 倍の倍率を使用します。
    6. サンプルが平らに座っていることを確認します。必要に応じて、サンプルの上にカバースリップを置き、平坦性を高めます。
      注:イメージング中は、コンフォーカルディッシュが十分に密閉されていることを確認して、サンプルが乾燥するのを防ぎます。
    7. 計算ソフトウェアを使用して、実行可能(緑)とデッド(赤)の数を計算します。
  2. 2Dアストロサイト文化の生存可能性
    1. 35mm共焦点皿に種子0.5 x 106アストロサイト(通路1-3)を入れ、アストロサイト培地を加え、37°Cおよび5%CO2でインキュベートする。
    2. 細胞がコンフルエントである場合は、培養培地を取り出し、1mLの1x PBSで洗浄します。
    3. ライブ/デッド試薬の200 μLを堆積させ、37°Cで30分間、光から保護します。
    4. ライブ/デッド試薬を取り出し、1mLの1x PBSで細胞を洗います。
    5. デジタルカメラと結合された共焦点顕微鏡に皿を取り、イメージ獲得のための488および570 nmの励起を使用する。
    6. 計算ソフトウェアを使用して、実行可能(緑)とデッド(赤)の数を計算します。

8. アストロサイトの免疫染色

  1. 3Dバイオプリントアストロサイトのグリア線維性酸性タンパク質(GFAP)染色
    注:他の細胞マーカーの存在を調べるには、それに応じて一次抗体を変更してください。
    1. ウェルから培地を取り出し、3倍PBSの1mLで構造を洗浄します。
    2. 構造が完全に覆われるまで、PBSに4%パラホルムアルデヒド(PFA)を加え、4°Cで2時間放置します。
    3. PFAを取り出し、3倍PBSの1 mLで構造を洗浄します。
      メモ:この手順は、PBSで4°Cで保存した場合、数ヶ月間一時停止することができます。PBSの蒸発を避けるために、ウェルプレートが密封されていることを確認してください。
    4. サンプルをグリシン 0.1 mol/L で 5 分間処理します。
    5. 1mLの1x PBSで5分間洗浄します。
    6. 試料を、軌道撹拌下で25°Cで0.1%トリトンX-100と10%FBSを1時間含有するPBSで透過化します。
    7. 一晩4°Cで鶏抗GFAP(一次抗体希釈1:500)でコンストラクトをインキュベートします。
    8. 一次抗体を吸引し、1 mLのPBSで5分間、3回洗浄します。
      注:一次抗体は、4°Cで保存すると数回再利用することができます。
    9. アレクサフルオール488コンジュゲート抗鶏(二次抗体希釈1:500)と1 μg/mL DAPIを眼窩撹拌下で25°Cで1時間インキュベートします。
      注: サンプルを光から保護してください。
    10. サンプルを1mLのPBSで5分間、3回洗浄します。
    11. コンストラクトを35mmコンフォーカル皿に移します。
      注:サンプルが乾燥するのを防ぐために、皿が十分に密封されていることを確認してください。
  2. 2Dアストロサイト培養のグリア性フィブリリン酸性タンパク質(GFAP)染色
    1. 35mm共焦点皿に種子0.5 x 106アストロサイト(通路1-3)を入れ、アストロサイト培地を加え、37°Cおよび5%CO2でインキュベートする。
    2. 細胞がコンフルエントである場合は、培養培地を取り出し、1mLの1x PBSで洗浄します。
    3. ステップ 8.1.2 から 8.1.10 を繰り返します。
  3. アストロサイト細胞骨格染色
    1. ステップ 8.1.1 から 8.1.6 を繰り返します。
    2. PBSに蛍光共役ファロイジン溶液50μg/mLの200 μLを加え、構築物にDAPIを1 μg/mL加えます。
    3. 25°Cで1時間、軌道撹拌下でインキュベートし、試料を光から保護します。
    4. サンプルをPBS 1 mLで5分間3回洗浄し、ヘラを使用してコンフォーカル皿にコンフォーカルディッシュにコンフォーカルディッシュに移します。
      注:サンプルが乾燥するのを防ぐために、皿が十分に密封されていることを確認してください。

9. 共焦点イメージング

  1. 画像撮影用のデジタルカメラ(359、488、および570 nm励起)と結合された共焦点顕微鏡に皿を取ります。
  2. 全体のビジュアライゼーションには 10 倍、拡大したセルの画像には 40 または 63 倍の倍率を使用します。
    メモ:サンプルが平らに座っていることを確認してください。必要に応じて、サンプルの上にカバースリップを置き、平坦性を高めます。

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結果

この研究は、3Dバイオプリンティング技術を用いて、層ごとの一次アストロサイトを含むゼラチン/GelMA/フィブリノーゲンバイオインクを堆積させる神経様組織の開発を目的とした。アストロサイトをマウスの子犬の大脳皮質(図1)から抽出して単離し、生体物質組成物に添加し、生きた3D構築物のバイオファブリケーションを可能にした。

コンピュータ支援設計(CAD)は、栄養素と酸素の拡散を促進することを目的として、1mmの細孔を持つ正方形の形状(0.6 x 0.6mm)の相互接続されたフレームとしてGコード(補足ファイル)を使用して開発されました。フレームは、各層の上に配置された6つの層で構成され、すべての層の90°の角度で変化した(図2Ai)。 設計された構造は、約5mmの高い(図2A ii)を有し、組織操作を可能にす...

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ディスカッション

3Dバイオプリンティング技術は、脳23を含む天然組織22に構造的および生理的に類似した精製構造の工学を可能にするバイオファブリケーション代替手段として浮上している。神経様組織のバイオファブリケーションは、生体外の天然の微小環境モデリングを可能にし、CNS11に影響を及ぼす多くの疾患の開発および治療に関連する細胞および分子機構を理解するための重要なツールである。神経機能におけるグリア細胞の重要な役割のために、皮質アストロサイトは、脳発達24、生体分子輸送25、神経突起伸長26、および脳様組織バイオファブリケーション14など多くの研究で使用されてきた。

アストロサイトの3D培養を設計する方法は、以前に報告されました, 異なる生体材料と足場...

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開示事項

著者らは開示する矛盾はない。

謝辞

この研究はサンパウロ研究財団(FAPESP)、助成金番号2018/23039-3および2018/12605-8によって支えられました。国家科学技術開発評議会(CNPq)、助成金数465656/2014-5および309679/2018-4;高等教育人材の向上のための調整 (CAPES), 金融コード 001.

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
3Dバイオプリンター3Dバイオテクノロジーソリューション押出ベースのバイオプリンター
鈍い先端の鉗子インテグラ・ミルテックス6--30脳解剖用鉗子 以前に滅菌された
牛血清アルブミンSigma-Aldrich9048-46-8プロテアーゼフリー、脂肪酸フリー、基本的にグロブリンフリー
CaCl2Sigma-Aldrich10043-52-4
細胞培養フラスコフィッシャーサイエンティフィック156340培養フラスコT25
細胞ストレーナーニング社352340細胞ストレーナー40µm
共焦点顕微鏡ライカ共焦点 TCS SP8 顕微鏡とオリンパス FluoView 300 共焦点システム
円錐管Thermo Scientific339651、33965215 mL および 50 mL の滅菌チューブ
DAPIAbcam ab224589DAPI 染色液
DMEM/F12Gibco;ライフテクノロジーズコーポレーション12500062DMEM/F-12 50/50、1X(ダルベッコのMod。Eagle's Medium/Ham's F12 50/50 Mix) と L-グルタミン
Dyalisis チューブSigma-AldrichD9527分子量カットオフ = 14 kDa
エタノールFisher Scientific64-15-5試薬グレード
胎児ウシ血清Gibco;ライフテクノロジーズコーポレーション12657011研究用グレード
フィブリノーゲンSigma-Aldrich9001-32-5ウシ血漿由来フィブリノーゲンクリスタリン粉末
ゼラチンSigma-Aldrich9000-70-8ブタ皮由来ゼラチン粉末
GlycineSigma-Aldrich56-40-6グリシン粉末
ハンクス緩衝塩溶液 (HBSS)Gibco;ライフテクノロジーズ株式会社14175095カルシウム、マグネシウム、フェノールレッド
L-グルタミンSigma-Aldrich56-85-9L-グルタミン結晶粉末
LamininSigma-Aldrich114956-81-9Laminin 1-2 mg/mL L in 50 mM Tris-HCl
Live dead kit Cell Imaging kitThermo ScientificR37601生細胞の緑色蛍光(ex/em 488 nm/515 nm)。死細胞の赤色蛍光 (ex/em 570 nm/602 nm)
無水メタクリルSigma-Aldrich760-93-0GelMA調製用
マイクロチューブコーニング社MCT-150-C1.5mL
NaClSigma-Aldrich7647-14-5
針 22GフィッシャーサイエンティフィックNC1362045滅菌鈍い針
操作はさみインテグラ ミルテックス05--02脳解剖用のシャープハサミ 以前に滅菌された
パラホルムアルデヒドSigma-Aldrich30525-89-4パラホルムアルデヒド粉末
ペニシリン/ストレプトマイシンギブコ;ライフテクノロジーズコーポレーション15070063ペン連鎖球菌 (5,000 Units/mL Penicillin; 5,000 ug/mL Streptomycin)
ペトリ皿Corning Incorporated430591, 43058835 mm and 100 mm
PhalloidinAbcamab176753iFluor 488 試薬
PhotoinitiatorSigma-Aldrich106797-53-92-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-メチルプロピオフェノン
リン酸緩衝液生理食塩水(PBS)Gibco;ライフテクノロジーズコーポレーション10010023PBS 1 x、培養グレード、カルシウムなし、マグネシウムなし
ポリ-L-リジンSigma-Aldrich25988-63-0ポリ-L-リジン臭化水素酸塩 mol wt 30,000-70,000
一次抗体Abcamab4674GFAPへのニワトリポリクローナル
二次抗体Abcamab150176Alexa fluor 594 抗ニワ
トリヘラミルテックV973-70ナンバー 24 セメント スパチュラ 以前に滅菌された
実体顕微鏡フィッシャーブランド3000038脳解剖用顕微鏡
シリンジ 5 mLBD1222C84滅菌シリンジ
シリンジ フィルター 2 & マイクロ;mフィッシャーサイエンティフィック09-740-105滅菌用ポリプロピレンフィルター
トロンビンSigma-Aldrich9002--04-4ウシ血漿からのトロンビンクリスタリン粉末
Triton X-100Sigma-Aldrich9002-93-1ラボグレード
トリプシン-EDTAGibco;ライフテクノロジーズコーポレーション15400054トリプシンノフェノールレッド 1 x PBS
Versene 溶液Gibco で希釈;ライフテクノロジーズコーポレーション15040066PBS
ウェルプレートThermo Scientific144530滅菌済み 24 ウェルプレート
コース

参考文献

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