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方法論記事

超微細構造解析および抗体染色のためのプラナリア卵巣解剖

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DOI：

10.3791/62713

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2021年9月10日

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1Stowers Institute for Medical Research, 2Howard Hughes Medical Institute, 3Department of Human Genetics, University of California Los Angeles

この記事について

サマリー

このプロトコルは、淡水プラナリアである Schmidtea mediterranea の卵巣を解剖するために取られた手順を示しています。解剖された卵巣は、抗体免疫染色や透過型電子顕微鏡による超微細構造解析に適合し、卵母細胞や体細胞の細胞生物学を研究することができ、これまでアクセスできなかったイメージングの深さと品質を提供します。

要約

生殖細胞へのアクセス性により、生殖細胞の発生、減数分裂、および組換えの研究が可能になります。淡水プラナリアの性的バイオタイプである Schmidtea mediterraneaは、 生殖細胞のエピジェネティックな仕様を研究するための強力な無脊椎動物モデルです。多数の精巣や雄性生殖細胞とは異なり、プラナリア卵子は、卵巣が2つしかなく、それぞれに5〜20個の卵子があるため、見つけて調べるのが比較的困難です。プラナリア体内のより深い局在化と保護上皮組織の欠如も、プラナリア卵巣を直接解剖することを困難にしています。

このプロトコルでは、簡単な固定ステップを使用して、これらの困難を克服するための下流分析のためのプラナリア卵巣の局在化と解剖を容易にします。解剖された卵巣は、透過型電子顕微鏡(TEM)による超微細構造検査および抗体免疫染色に適合します。このプロトコルで概説されている解剖技術はまた卵巣が異なるRNA干渉(RNAi)条件下で検査される遺伝子摂動実験を可能にする。このプロトコルによって達成される卵巣の無傷の生殖細胞への直接アクセスは、イメージングの深さと品質を大幅に改善し、卵母細胞生物学の細胞および細胞内調査を可能にします。

概要

プラナリアの解剖学的構造は、多くの組織1,2,3,4,5,6でTEMを使用して調べられています。しかし、卵巣や卵子にはほとんど注目されていません。卵子文献が不足しているのは、これらの細胞へのアクセスが困難であり、プラナリア卵子の生物学がほとんど未解明のままになっていることが一因です。分子ツールは、光学顕微鏡または蛍光顕微鏡を使用して、プラナリアの卵巣発達の多くの調節メカニズムを明らかにしました7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20 .これらの実験はすべて、全線虫または全線虫の組織学的切片で行われました。全線虫の抗体染色およびin situハイブリダイゼーションプロトコルには、広範な漂白、洗浄、および組織透明化のステップが含まれますが、これには時間がかかり、数日かかります。

ここで説明する方法の全体的な目標は、無傷で解剖されたプラナリア卵巣および卵子へのアクセス性を提供することであり、これにより漂白または組織学的切片作成の必要性がなくなり、抗体染色および in situハイブリダイゼーション における洗浄および組織清浄の時間が短縮されます。また、卵巣を切開することで、プローブや抗体の浸透性が向上し、光学顕微鏡や電子顕微鏡のイメージング深度と品質が向上します。解剖された卵巣と卵子へのアクセス性により、無傷の卵子全体を使用して細胞および細胞内の分解能で細胞生物学研究を行うことができます。解剖されたプラナリア卵巣に関する最近の研究では、TEMと共焦点顕微鏡法で初めてプラナリア卵母細胞の減数分裂が特徴付けられました21。この研究は、核膜小胞形成と呼ばれる減数分裂中の新しい現象の包括的な説明を提供しました。

ここでは、プラナリア卵巣の解剖における詳細な手順を紹介します。固定ステップは、解剖および下流の操作(すなわち、TEMおよび光学顕微鏡分析のための処理)のために卵巣細胞構造を保持するのに十分であった。ボディプランと組織構造の類似性を考えると、このプロトコルは、他のいくつかのPlatyhelminthes種(Dugesia属やPolycelis属など)の卵子とその核を研究するためにも広く役立つはずです。このプロトコルは、卵巣と卵子の直接観察を可能にする、その小さなサイズとほぼ透明な体の構造のために、Macrostomum lignanoにはおそらく無関係です22,23,24。卵巣を含む体領域は、一部の種(例えば、Dugesia ryukyuensis 9,25)でS. mediterraneaよりも光学的に区別しやすい(例えば、色素が濃いまたは色素が薄い)。これらの種の研究は、ここで紹介したS.mediterraneaの卵巣の位置を特定するためのガイドラインにあまり依存せず、固定および解剖条件を利用することができます。

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プロトコル

1. 事前準備

  1. ワームを準備する:性的成熟を達成するために、週に2回、性的プラナリアに有機肝臓ペーストを与えます。
    注:一般的に、このようなワームは長さが1 cmより大きく、咽頭の開口部の後方に淋骨があります。
  2. 解決策を準備します。
    1. 以下の試薬を調製します:16%パラホルムアルデヒド(PFA)。50%グルタルアルデヒド(GA)水溶液;N-アセチル-L-システイン(NAC);1 x リン酸緩衝生理食塩水 (PBS): 137 mM NaCl、2.7 mM KCl、8 mM Na2HPO4、および 2 mM KH2PO4。
    2. 50% GA と 16% PFA を PBS で希釈し、2.5% GA と 2% PFA の最終混合物にします。16% PFA を PBS で希釈し、最終濃度 4% PFA にします。
    3. 5 gのNACを100 mLのPBSに溶解して、5%の作業溶液を作ります。

2.卵巣の収集

  1. 性的に成熟したワームを、室温の5分間、皿に5%NACで処理します。
    注意: 大きなワームは丸くなることがあります。ブラシまたはピペットチップを使用して、ワームを平らにすることができます。5%NACの使用量は最小限で、ペトリ皿の表面を覆うのに十分です。
  2. NACを新たに調製した4%パラホルムアルデヒド10mLに交換し、時々振とうしながら室温で1時間ワームを固定します。4% PFA を添加して 10 分後に解剖を開始し、ワームが固定されている間に 4% PFA で解剖を行います。
  3. 上皮の色素沈着を観察して、前頭神経節から尾に向かって伸びる軽い色素沈着の2本の線として現れる腹側神経索を見つけます。
  4. 卵巣を見つけます。
    注:卵巣は内側の神経索のすぐ隣にあります(図1A)。上皮の色素沈着に依存して、卵巣の位置を前後方向に特定します。理想的には、卵巣領域の腹側上皮の色素沈着は、周囲の領域よりも軽いです。一部の線虫では、腹側上皮の色素沈着が十分な信頼性を提供しません。これらのワームは、卵巣が十分に発達していない可能性があるため、廃棄できます。
  5. 推定卵巣が色素沈着によって位置を特定したら、卵巣の位置を確認します。
    注:まず、卵巣は橈側神経節の後方にあります。第二に、暗い色の精巣は卵巣の上の背側表面の外側にあります。卵巣は、最も前方の精巣の前にあります(図1B)。時々、精巣葉は卵巣のレベルまたは卵巣のわずかに前方に配置されています。
  6. 2つの外科用ナイフを使用して、2つの卵巣の後部と前部を切断し(図1C)、前方と後部のワームの破片を完全に取り除きます。一方のナイフを使用してワームを固定し、もう一方のナイフを使用してカットを行うために使用したナイフをクリーニングします。
  7. 卵巣断片の中央線を切って、2つの卵巣を分離します。フラグメントを裏返して、腹側を下にします。
  8. 背側組織を剥がして腸を露出させます(図1D)2対の先のとがったピンセット(タイプ5-SA)。
    注:ドーム型の卵巣は腸の枝の下にあります。
  9. ピンセットの先端または柔らかいブラシで腹側組織の上にある腸の枝をそっと取り除き、卵巣を露出させます(図1E)。
  10. 周囲の組織を切除して卵巣を取り出します(図1F、G)。
  11. 卵巣を取り出し、1.5mLのチューブに移して1mLのPBSで洗います。

3. TEMの固定

  1. 卵巣をPBSで10分間、穏やかに振って洗います。チューブを直立させ、卵巣を重力で底に沈めます。一度洗濯を繰り返します。
    注:卵巣が沈まない場合は、ミニベンチトップ遠心分離機(最大速度2000 × g)で15秒間穏やかに回転させます。
  2. PBSを2%PFA/2.5%GA/PBSに交換します。
  3. サンプルを室温で1時間、40rpmのシェーカーで固定します。
  4. サンプルを4°Cの固定液に一晩、40rpmのシェーカーで保管します。

4. TEM用試料処理

  1. 卵巣をPBSで3回、それぞれ10分間洗浄します。
  2. 卵巣を二重蒸留水(ddH2O)でそれぞれ10分間3回洗浄します。
  3. 卵巣を2%水性OsO4 に室温で1〜2時間、または4°Cで一晩後固定します。
    注:このステップでは、サンプル容器をパラフィルムで密封する必要があります。逆浸透処理水で2%OsO4 を調製します( 材料の表を参照)。
  4. サンプルをddH2Oで3回、各10分間すすぎます。
  5. 卵巣を2%酢酸ウラニル水溶液(UA)で4°Cで一晩染色します。
    注:UA溶液は使用前にろ過する必要があります。 一括 染色中は光を避けてください。逆浸透処理水で2%OsO4 を調製します( 材料の表を参照)。
  6. サンプルをddH2Oで4回、穏やかに攪拌しながら、それぞれ10分間すすぎます。
  7. 等級付けされたエタノールシリーズ(30%、50%、70%、95%、および各溶液100%、10分を2回)で卵巣を脱水し、次にプロピレンオキシドで2回のインキュベーション(10分)で平衡化します。
  8. レジンを浸潤させるには、サンプルを50%プロピレンオキシド/50%液体エポキシ樹脂混合物に4°Cで一晩インキュベートします。 100%エポキシ樹脂をサンプルに浸透させ、3回(各1時間)交換し、穏やかに攪拌します。
  9. 卵巣を100%エポキシ樹脂に埋め込み、60°Cで48時間重合します。

5. 超微量切開術

  1. ブロックトリミングと光学顕微鏡によるサンプルチェック
    1. サンプルブロックをカミソリの刃でピラミッド型にトリミングします。
    2. 厚さ1〜2μmの切片をガラスナイフまたはダイヤモンドナイフで切断します。
    3. 切片を水滴でスライドに移し、ホットプレート上でスライドを加熱し、水分蒸発時に切片が平らになってスライド表面に付着するまで加熱します。
    4. 切片を1%トルイジンブルーOの滴で覆い、ホットプレートで~10秒間加熱します。スライドを流水ですすぎ、乾かします。通常の光学顕微鏡で切片を確認します。
  2. 極薄切片の切断、収集、および染色後。
    1. 厚さ50〜70nmの極薄切片をダイヤモンドナイフで切り取ります。ナイフウォーターボートからセクションをメッシュまたはシングルスロットの銅グリッドに移します。
    2. 切片を2% UAで8分間染色します。ddH2Oを30秒間実行してグリッドを洗浄します。
    3. 切片を1%鉛溶液で6分間染色します。ddH2Oをランニング中に切片を1分間洗浄し、風乾します。

6. データの収集と分析

  1. 適切なソフトウェア(デジタル顕微鏡写真など)を使用してTEMデータを収集します(詳細については 、材料の表 を参照してください)。
  2. スコープを80kVで操作します。真空の準備ができたら、サンプルグリッドをスコープに挿入します。
  3. メニューの[ライト]をクリックして、ビームをオンにします。自動露出時間が~1秒になるまで、左側のコントロールパッドの強度ノブを回します。Start Acquireをクリックして、最終的な画像を取得します。
  4. オープンソースの画像処理、モデリング、ディスプレイ(IMOD)パッケージを使用して、3次元EMモデルを構築します。

7. 抗体染色

  1. 解剖した卵巣を1.5 mLのマイクロチューブで洗浄(ステップ2.16)し、0.5% Triton X-100(PBST)を添加した1 mLの1x PBSを添加します。チューブをシェーカーに置き、40rpmで10分間攪拌します。チューブをラックに立てると、卵巣が重力によって沈みます。洗浄液を新しいPBSTと交換し、2回繰り返します。
  2. 2 μg/mL のプロテイナーゼ K と 0.1% ドデシル硫酸ナトリウムで組織を PBST 室温で 10 分間消化します。
  3. 消化された卵巣をPBSTで3回、10分間洗浄します。
  4. 卵巣をPBST中の10%ウマ血清と室温で1時間インキュベートします。
  5. 一次抗体をブロッキング溶液(PBS中の10%ウマ血清と0.5%Triton X-100)で1〜100希釈します。卵巣を一次抗体と1回4°Cで一晩、穏やかに振とうしながらインキュベートします。
  6. 卵巣をPBSTで3回、各洗浄で10分間洗浄します。
  7. 卵巣を二次抗体と併用し、4°Cで一晩、穏やかに振とうしながらインキュベートします。すべての二次抗体をブロッキング溶液で1:300に希釈します。
  8. PBSTで卵巣を3回洗浄し、1回目と3回目の洗浄が10分間続くことを確認します。2回目の洗浄で、PBSTで1:300希釈のHoechst 33342で卵巣核を室温で30分間染色します。
  9. 卵巣をスライドに取り付けます。
    注:退色防止封入剤は、蛍光シグナルを延長するために使用できます。

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結果

ここで提示された方法は、Guoらによって説明されています.21。解剖を成功させるための鍵は、卵巣の色素沈着と位置ガイドを正しく特定することです。この方法の戦略は、広範な位置から特定の位置に移動することです。まず、これを達成するために、背側と腹側の色素沈着パターンに頼ります(図1A、B)。卵巣が存在する腹側色素沈着は、5% NAC 治療と 4% PFA 固定後に白くなります。使用したワームで色素沈着の区別がはっきりしない場合は、別のワームを使用することをお勧めします。

次に、無関係な組織を段階的に切り取ります(図1C-E)。卵巣が露出したら(図1E)、周囲の組織を切除することができます。採取された卵巣は、複数の体細胞型を含み、卵巣の完全性を維持し、超微細構造解...

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ディスカッション

プラナリア卵巣を解剖するためのこれらの固定ベースの手順は、卵子の減数分裂だけでなく、卵巣の発達と再生の理解を促進します。卵子とその体細胞支持細胞のサイズは、20μmから50μmの範囲です。解剖ベースの方法は、切片化またはホールマウントベースの方法では達成できない無傷の単一卵巣細胞へのアクセスを提供します。このプロトコルは、無傷のプラナリア卵巣の解剖学的構造と卵母細胞細胞生物学の研究を容易にします 細胞および細胞内の解像度で。

これらの手技には固定が必要なため、PFAベースの実験にしか適用できません。他の非PFA固定法(メタノールなど)でも卵巣解剖が可能になる場合があります。与えられた線虫が適度な大きさの卵巣を発達させない場合 遺伝子摂動実験では、従来の全線虫法が好まれる可能性が高い。

プロトコルの最も重要なステップは、卵巣を適切に特定し、細かい解剖を行うことです。卵巣がよく発達した性的に成熟したプラナリアは、卵巣のすぐ下の腹側上皮の色素沈着が...

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開示事項

著者は何も開示していません。

謝辞

この研究は、ハワード・ヒューズ医学研究所(LKおよびASA)とヘレン・ヘイ・ホイットニー財団(LHG)の支援を受けました。

この原稿の基礎となるオリジナルデータは、以下のStowers Original Data Repositoryからアクセスできます http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1628

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
16% パラホルムアルデヒド電子顕微鏡 科学15710EM グレード
2% 水性 OsO4電子顕微鏡科学19152
50% グルタルアルデヒド電子顕微鏡科学16320EM グレード
デジタル顕微鏡Gatan Inc.バージョン2.33.97.1、TEMデータ収集
エポン樹脂電子顕微鏡科学14120812キット、液体、エポキシ樹脂を埋め込む
エタノールテッドペラ19207変性
ヘキスト 33342サーモフィッシャーサイエンティフィックH3570
馬血清シグマH1138
酢酸鉛電子顕微鏡 科学
MilliQ 水逆浸透処理水
N-アセチル-L-システインSigmaA7250
パラフィルムシグマP7793
プロロングダイヤモンド退色防止封入剤サーモフィッシャーサイエンティフィックP36965
プロピレンオキサイド電子顕微鏡 Sciences75569EM グレード
 プロテイナーゼ Kサーモフィッシャーサイエンティフィック25530049
トルイジンブルー O電子顕微鏡 科学92319
透過型電子顕微鏡FEIテクナイ G2 スピリット BioTWIN
酢酸ウラニル電子顕微鏡 科学541093
6080564

参考文献

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