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方法論記事

大型動物モデルにおける前臨床試験のための細胞スタックにおけるアデノ関連ウイルスベクターの生成

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DOI:

10.3791/62727

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2021年6月30日

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1Department of Pathobiology, University of Guelph

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

ここでは、細胞スタックで増殖した付着HEK 293細胞とアフィニティークロマトグラフィー精製を用いた研究用AAVベクターの大規模生産に関する詳細な手順を提供する。このプロトコルは一貫して>1 x 1013 のベクターゲノム/mLを生成し、大規模な動物実験に適したベクター量を提供する。

要約

アデノ関連ウイルス(AAV)ベクターは、ヒトに対して承認された3つのAAV遺伝子治療を有する、最も臨床的に進行した遺伝子治療ベクターの一つです。AAVの新しいアプリケーションの臨床進歩は、マウスなどの小さな動物モデルから、犬、羊、非ヒト霊長類を含むより大きな動物モデルへの移行を伴う。AAVを大型動物に投与する際の制限の1つは、大量の高い抗長ウイルスの要件である。懸濁細胞培養はAAVベクター産生のためのスケーラブルな方法であるが、いくつかの研究ラボは、装置(例えば、バイオリアクター)を有するか、またはこの方法でAAVを生成する方法を知っている。また、AAV価は、接着性HEK293細胞と比較して、HEK293細胞の懸濁液で産生される場合に有意に低いことが多い。ここで説明する、セルスタックを用いて大量の高力素AAVを製造する方法を説明する。AAV を引き起す詳細なプロトコルと、ベクター純度を検証する方法についても説明します。最後に、羊モデルにおけるAAV媒介トランスジーン発現の代表結果を提示する。この最適化されたAAVベクターを接着細胞で大規模に生産するためのプロトコルは、分子生物学の研究室が、より大きな動物モデルにおける新しいAAV療法の試験を進めることを可能にする。

概要

アデノ関連ウイルス(AAV)ベクターを利用した遺伝子治療は、過去30年間で大きく進歩した1,2.先天性失明、血友病、および筋骨格系および中枢神経系の疾患を含む多様な遺伝性疾患の改善を実証し、AAV遺伝子治療を臨床研究の最前線に持ち込んだ3,4。2012年、欧州医薬品庁(EMA)は、LPL欠損症の治療のためにリポタンパク質リパーゼ(LPL)を発現するAAV1ベクターであるグリベラを承認し、欧州または米国のいずれかで遺伝子治療のための最初のマーケティング承認を受けました。それ以来、2つのAAV遺伝子治療、Luxturna6とZolgensma7は、FDAの承認を受けており、市場は2025年までに10〜20の遺伝子治療が予想され、今後5年間で急速に拡大すると予想されています 8.利用可能な臨床データは、AAV遺伝子治療が安全で、十分に許容され、有効性のあるモダリティであり、最も有望なウイルスベクターの1つであり、244以上の臨床試験が ClinicalTrials.gov に登録されていることを示しています。AAVベクターを含む臨床応用への関心の高まりは、大規模な動物モデルにおけるAAV療法の評価を容易にするために、堅牢でスケーラブルな生産方法を必要とします。

AAVベクターの生産の場合、2つの主な要件は、AAVゲノムとキャプシドです。野生型(wt)-AAVのゲノムは、長さ約4.7kbの一本鎖DNAである。wt-AAVゲノムは、ゲノムの両端に見られる反転末端反復(ITR)を含み、これは、包装にとって重要であり、repおよびcap遺伝子11とを含む。Repおよびcap遺伝子は、ゲノム複製に必要な、ウイルスキャプシドの組み立て、およびゲノムをウイルスキャプシドにカプセル化し、ウイルスゲノムから除去され、AAVベクター産生12のためのトランスで提供される。ウイルスゲノムからこれらの遺伝子を除去することにより、治療的トランス遺伝子およびプロモーターおよびポリAシグナルを含むすべての必要な調節要素の余地を提供する。ITRは、適切なゲノム複製およびウイルスカプセル化13、14を確実にするために、ベクターゲノムに残る。遺伝子導入発現の動態を改善するために、AAVベクターゲノムは自己相補的に設計することができ、AAVゲノム複製中の一本鎖から二本鎖DNA変換への変換の必要性を軽減するが、コーディング能力は〜2.4kb15に低下する。

AAVゲノム設計を超えて、カプシド血清型選択は、生体内2におけるAAVベクターの組織および細胞のトロピズムを決定する。組織トロピズムに加えて、異なるAAV血清型が異なる遺伝子発現動態16を示すことを示している。例えば、ジンガレッリら17は、異なるAAV血清型を低発現血清型(AAV2、3、4、5)に分類し、中程度の発現血清型(AAV1、6、8)、および高発現血清型(AAV7および9)を分類する。また、AAV血清型を遅発式(AAV2、3、4、5)または急速発症発現(AAV1、6、7、8、および9)に分類した。これらの異なる対流動性および遺伝子発現動態は、カプシドタンパク質におけるアミノ酸の変化、カプシドタンパク質形成、および宿主細胞受容体/共受容体18との相互作用によるものである。一部のAAVカプシドは、血管内投与後に血液脳関門を越える能力(AAV9)または持続性トランスジーン発現用の長生き筋細胞(AAV6、6.2FF、8、および9)19、20などの付加的な有益な特徴を有する。

本論文は、前臨床前の大型動物モデルで使用するための高純度、高力価、研究グレードのAAVベクターを製造するための費用対効果の高い方法を詳述することを目的とする。このプロトコルを用いたAAVの生産は、細胞スタックで増殖した接着ヒト胚性腎臓(HEK)293細胞へのデュアルプラスミドトランスフェクションを使用して達成される。さらに、この研究は、ヘパリン硫酸親和性クロマトグラフィー精製のプロトコルを記述し、AAV2、3、6、6.2FF、13、およびDJ21、22を含むヘパリン結合ドメインを含むAAV血清型に使用することができる。

AAV ベクターの製造には、多数のパッケージング システムが用意されています。これらの中で、RepおよびCap遺伝子およびアドヘルパー遺伝子(E1A、E1B55K、E2A、E4orf6、およびVA RNA)が1つのプラスミド(pHelper)内に含まれる2プラスミド共トランスフェクションシステムの使用は、一般的な3種プラスミド(トリプル)トランスフェクション方法よりも実用的な利点を有する24000年2400年の産生に対するコストの削減を含む。.遺伝子導入発現カセット(pTransgene)を含むAAVゲノムプラスミドは、ITRによって横にされ、かつ、〜4.7kbの長さを超えてはなりません。ベクター力差および純度は、トランスフェクション中の細胞傷害作用の可能性に起因するトランスジーンの影響を受ける可能性がある。ベクター純度の評価は、本明細書に記載される。この方法を用いて産生されたベクターは、それぞれ1x10 13 vg/mLを生み出し、マウス、ハムスター、およびオビン動物モデルで評価した。

表1: 必要なソリューションの構成プロトコル全体でさまざまなソリューションに必要なコンポーネントの割合やボリュームなどの必要な情報。 このテーブルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

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プロトコル

1. 細胞スタック中のHEK293細胞の二重プラスミドトランスフェクション

  1. 37°Cに設定されたビーズ浴中のHEK293細胞のクライオバイアルを解凍します。
    注:セルが解凍されている間、完全なDMEMを37°Cに完全に完全に保ち、冷温がメッキ時にセルに衝撃を与えないようにします。細胞の通過数が20未満の場合、最適な増殖とトランスフェクション効率を確保します。細胞がマイコプラズマフリーであることが証明されていることを確認します。
  2. 凍結バイアルのドロップワイズの内容物を、10 mLの完全なDMEMを含む15 mL円錐形チューブに移し、500 x g で細胞を遠心分離します。
  3. 培地を吸引し、次いでHEK293細胞を20mLの完全DMEMを再懸濁した。細胞を15cmのプレートに播種し、5%CO2で37°Cでインキュベートします。
  4. 1つの15cmプレートから細胞を3つに分割し、細胞培養チャンバーに播種します。
    1. 細胞が80%コンフルエントになったら、培地を吸引し、PBSの3mLでプレートを穏やかに洗浄して単層を破壊しないようにします。次に、PBSを吸引し、3mLのトリプシンを加える。
    2. 細胞がプレートから持ち上がるまで37°Cで2分間インキュベートし、プレートに7mLの完全なDMEMを加えてトリプシンを中和します。
    3. 500 x g で 5 分間遠心分離して、すべての培地と細胞を 15 mL チューブに集め、細胞をペレットにします。
    4. 上清を15mLチューブから吸引し、完全DMEMの3mLで細胞ペレットを再懸濁します。完全なDMEMの20 mLを含む各15 cmの版に1 mLを加える;プレートを穏やかに揺らし、細胞を均等に分配し、5%CO2で37°Cでインキュベートします。
  5. 細胞が80%コンフルエントになったら、ステップ1.4.1と1.4.2を繰り返します。50 mL円錐形チューブに上清を集め、管を穏やかに反転させて細胞が均質であることを確認します。
  6. 細胞サンプルの10 μLを10 μLのトリパンブルーで混合し、細胞カウンタで分析するために細胞計数スライドに混合物を加えて、細胞密度を決定します。
  7. 1 x 104細胞/cm2で細胞培養チャンバー(6360 cm2の表面積)を播種するために必要な細胞懸濁液と事前に温めた完全なDMEMの1 Lを混合する。細胞培養チャンバーに細胞混合物を注ぎ、穏やかに回転させて各単層(図1)に細胞を均等に分配し、5%CO2で37°Cでインキュベートします。
  8. 細胞培養チャンバーに加えて、1x104 細胞/cm2 の15cmプレートを合流性の基準としてプレートします。
  9. 〜65-hインキュベーションに続いて、基準プレートの合流性(理想的には〜80〜90%コンフルエント)を確認してください。
    注:37°Cで細胞培養チャンバーに追加するための完全なDMEMを完了します。

figure-protocol-1
図1:細胞の播種とトランスフェクションのための細胞スタックの操縦細胞スタックを播種する場合は、まずベントキャップの1つを取り除き、必要な量のHEK293セル(A)で1 Lの温め込まれた完全なDMEMを注ぐことから始めます。両方のベントキャップを締めて細胞とメディアを均等に分配し、すべてのメディアをベントキャップの1つでセルスタックの隅に持ち込み、その隅(B)に置き、セルスタックを側面(C)に置き、ベントポートが上になるようにセルスタックを90°(D)に変えます。セルスタックを通常の水平位置まで緩やかに下げ、セルスタックのすべてのチャンバーが完全にメディア(F)で覆われていることを確認します。トランスフェクションするとき、両方のベントキャップを緩め、古い媒体をゆっくりと廃液廃棄物容器に注ぎ、細胞の単層を乱さない流れにも(G)します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

  1. ポリエチレンイミン(PEI)/DNA混合物を3:1(w/w)の濃度比で調製します。
    1. 475 μgの pTrangene と 1425 μg の pHelper を 40 mL の還元血清培地に加えて、50 mL の円錐形チューブに DNA 混合物を調製し、pHelper:pTrangene の 3:1 の比率を作成します。
      注: PEI/DNA混合計算機は 、表 2を使用して見つけることができます。
    2. 5.7 mL の PEI (1 g/L) を還元血清培地と DNA 混合物を滴下して加えます。その後、短時間で渦を、室温で10分間インキュベートする。
      注:PEI/DNAは室温でインキュベートするので、少し曇りになります。
  2. PEI/DNAインキュベーションの8分後、細胞培養チャンバーから培地を取り出します。
    注:細胞の流出を避けるために、メディアのスムーズな流れを維持するために、両方のオレンジ色のキャップを緩めることを確認してください。
  3. PEI/DNAを1 Lの完全なDMEMを加え、細胞培養チャンバーポートにゆっくりと注ぎます。液体をすべての行(図1)に均等に分配し、37°Cで72時間インキュベートし、5%のCO2を含む。

2 AAVの採取と、トランスフェクトしたHEK293細胞の化学液化

  1. 細胞培養チャンバーを激しく振って、取り外された細胞から媒体が濁って現れるまで細胞を取り除き、4本の500 mL遠心分離管に注ぎます。
  2. 4°Cで30分間18,000xgでチューブを遠心分離し、細胞をペレット化する。明確化した上清を1Lポリエチレンテレフタレートコポリエステル(PETG)ボトルに注ぎます。
    注:高速遠心分離機にアクセスできない場合は、12,000 x g で40分間遠心分離機を使用します。ペレット化された細胞は、この速度で固体でない可能性があり、上清を注ぐようにスライドします。
  3. 50 mL のリシスバッファーを用いた 500 mL 遠心分離管で細胞ペレットを再懸濁し、37 °C で 60 分間インキュベートします。
  4. チューブを18,000 x g で30分間遠心し、上清を同じ1 L PETGボトルに移します。ペレット化された細胞の破片を捨てます。
    注:すぐに明確化上清を浄化し、最大72時間4°Cで保存します。長期保存のため、-80°Cで保管してください。 -20°Cで保管しないでください。

3 ヘパリンアフィニティークロマトグラフィーによるAAVベクター精製

  1. 粗いライゼートを-80°Cから取り出し、一晩4°Cで解凍します。解凍したら、0.22 μMフィルターを使用して粗いライセートをフィルターします。
  2. 遠心濃縮器をパッシベーターするには、使用されているヘパリンセファローズカラムごとに遠心濃縮器に4mLのフィルター前処理バッファーを追加します。2-8時間室温で遠心濃縮器をパッシベート。精製ステップの直前に、パッシベーションを設定します。
  3. チューブとポンプをセットアップします(図2)。
    1. チューブを蠕動ポンプに入れ、1 M NaOHの20 mLを実行します。次に、50 mLの分子グレードの水を実行し、次に50 mLの基底DMEMを実行します。
    2. 5 mL ヘパリンセファローズカラムをチューブに取り付け、25 mL の基底DMEMを実行して防腐剤を除去します。
  4. 1~2滴の流量で、ろ過した粗なライセートを0.2 μM実行します。

figure-protocol-2
図2:AAV精製用の蠕動ポンプを設置 粗いライセートから、蠕動ポンプを通り、ヘパリンマトリックスカラムにチューブを実行します。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

注: この場合、列が危険にさらされ、AAV の溶出が防止され、気泡が発生したり、列が乾いて実行されたりしないようにしてください。乾燥した場合は列を破棄し、粗いライセートの残りの部分に新しい列を使用します。

  1. 粗ライゼットをすべてヘパリンカラムに積み込み、次の溶液を使用してカラムを洗浄します。
    1. Mg2+ とCa2+なしで1xハンクのバランス塩ソリューション(HBSS)の50 mLを使用して洗浄します。
    2. Mg2+ とCa2+なしでHBSSで0.5%N-ラウロイルスアルコシンの15 mLを使用して洗浄します。
    3. Mg2+ とCa2+なしでHBSSの50 mLを使用して洗浄します。
    4. Mg2+およびCa2+で50 mLのHBSSを使用して洗浄
    5. Mg2+とCa2+で200 mM NaCl / HBSSの50 mLを使用して洗浄します。
    6. Elute 5 x 5 mL (合計 25 mL) 300 mM の NaCl/HBSS の Mg2+ および Ca2+ を使用し、溶出を E1-E5 とラベル付けします(溶出は 5 mL)。
  2. 遠心濃縮器を使用してウイルスを濃縮する
    1. 前処理バッファーを含む遠心濃縮器を 900 x g で 2 分間回転させます。フロースルーを破棄します。
    2. Mg2+とCa 2+と遠心分離機で4 mLのHBSSで遠心濃縮器フィルターを1000 x gで2分間洗浄します。フロースルーを破棄します。
    3. 遠心濃縮器に溶出E2を追加します。1000 x g で 5 分間回転し、フロースルーを破棄します。
    4. E2を追加し終え、遠心濃縮器にE3を加え、濃縮ウイルスが約1mLになるまで5分間1000 x g で回転させます。
      注: ボリュームがフィルタのレベルより低いよう、ベクトルを遠心分離することは避けてください。E1、E4、またはE5を遠心濃縮器に集中させないでください。
    5. p200フィルターチップを使用して遠心濃縮器から濃縮ウイルスを除去し、滅菌1.5 mL遠心分離管に入れる。
    6. Mg 2+とCa 2+で200 μLのHBSSで遠心濃縮器をリンスし、残りのAAVをフィルタから取り外します。ピペットは、膜に付着したウイルスを取り除き、残りのウイルスと共に1.5 mL遠心管に入れるまで、何度も何度もピペットを上下に下げる。チューブをよく混ぜます。
    7. DNA抽出用のアリコート5μL、精製ベクターを-80°Cで保存します。
  3. 2M NaClの25 mLを使用してカラムを洗います。また、25mLのトリトンX-100を使用し、37°Cに予熱してカラムを洗浄した。次に、50mLの無菌dH2Oを用いてカラムを洗浄し、20%エタノールの25mLを使用して洗浄する。
  4. 貯蔵溶液であるため、カラム膜が20%エタノールで完全に飽和していることを確認してください。プラグを設けてカラムをシールし、4°Cで保管してください。
  5. チューブは1 M NaOHで保管してください。
    注:適切に洗浄した場合、ヘパリンセファローズカラムは5回まで再利用できます。

4 AAVゲノムDNA抽出

  1. 表 3 に記載されている反応ミックスを、DNase処理用PCRチューブに用意します。
コンポーネント容積
精製された AAV ベクター5 μL
10x DNase バッファ2 μL
DNase1 μL
ddH2O12 μL
最終ボリューム20 μL

表3:DNase処理マスターミックス式。 DNA抽出中のAAVウイルスベクターのDNase治療に必要な推奨成分および体積。

  1. PCRチューブを混合し、内容物をスピンダウンするためにパルスするPCRチューブをボルテックス。
  2. サーモサイクラーを使用して、37°Cで20分間インキュベートし、続いて75°Cで15分間インキュベートし、DNaseを加熱不活化します。
  3. 5 μLのプロテイナーゼ Kを加える。
  4. サーモサイクラーを使用して、50°Cで60分間インキュベートし、95°Cで30分間インキュベートしてプロテナーゼKを加熱します。
  5. 潜在的な汚染物質を除去するためにDNAクリーンアップキットを使用してください。
    注:このステップは、市販の血液および組織クリーンアップキット(材料表)を使用して実行されました。
    1. DNase/Proteinase K処理ベクターを含むPCRチューブにALバッファー(血液および組織クリーンアップキット、 材料表)を200 μL加えます。
    2. PCRチューブをボルテックスし、サーモサイクラーで10分間56°Cでインキュベートします。
    3. PCRチューブから回収管に座る無菌スピンカラムに液体をピペットします。
    4. 200 μLのエタノールを100%のエタノールをカラムに加え、ボルテックスで充分に混ぜます。
    5. 6,000 x g で1分間遠心分離機を使用し、流れを捨てます。
    6. 500 μL のバッファ AW1 (血液および組織クリーンアップ キット、 材料表)をスピンカラムに追加します。
    7. 6,000 x g で1分間遠心分離機を使用し、流れを捨てます。
    8. 500 μL のバッファ AW2 (血液および組織クリーンアップ キット、 材料表)をスピンカラムに追加します。
    9. 遠心分離機で15,000xgで3分間、流れを捨てます。
    10. スピンカラムを無菌1.5 mL遠心チューブに入れ、200 μLのバッファAE(血液および組織クリーンアップキット、 材料表)をスピンカラム膜に直接加えます。
    11. 室温で1分間インキュベートします。
    12. 遠心分離機は6,000 x gで1分間、DNAを溶出させる。
    13. DNAを-20°Cに保存します。

5 定量ポリメラーゼ連鎖反応とシミアンウイルス40(SV40)プローブによるAAVベクターゲノムの滴定

注: 外部DNA汚染を避けるために、フィルター処理されたピペットチップを使用してPCRフードですべてのqPCR作業を実行します。AAVゲノムがSV40ポリA配列をコードしない場合は、他の25に記載のITRに対してプローブを使用する。標準として選択されたプラスミドDNAにSV40ポリA配列が含まれていることを確認してください。

  1. 在庫標準準備
    1. ストックプラスミドDNA標準(SV40ポリA配列を含むpTransgeneプラスミド)を最終濃度の10 μg/μLまで希釈し、6 μLアリコートで-20°Cで保存します。
    2. 以下のオンライン計算機26を使用して、プラスミドDNA標準に存在するコピー番号を決定する。
      注: 品質と正確な濃度を確保するために、市販ベンダーによって製造された標準に使用されるプラスミド DNA を使用します。新しく作成した標準に移行する際に、大量の標準(例えば、10 mL)を準備して、ブリッジングスタディを実施します。
  2. サンプルと標準試料の両方について 、表4 に記載されている以下の試薬ミックスを1.5 mL遠心分離管で調製します。
    注:マスターミックスの十分な超過を準備します。プライマー/プローブシーケンスについては 、表5 を参照してください。
コンポーネント容積
ユニバーサル qPCR マスターミックス (2X)10 μL
分子グレードの水4.5 μL
40x SV40ポリプライマー/プローブ0.5 μL
最終ボリューム15 μL

表 4: AAV 滴定の qPCR マスターミックスAAVウイルスベクターから抽出されたDNAのqPCRに必要な推奨成分および体積。

コンポーネント順序
フォワードプライマー5'-アグカタッカカカササアットタカカサ-3'
リバースプライマー5'-CCAGACATATAAAGATACATTATGAGT-3'
プローブ/56-FAM/アグキャットットット/禅/TTCACTGCTTタグGtGtTGtGtC/3IABkFQ

表5:SV40ポリADNA配列に対するプライマー配列。 qPCR滴定に使用されるプライマーおよびプローブの配列は、SV40 polyA配列を含むAAVウイルスベクターの特定の領域に結合する。

  1. ピペットマスターは、ミックスするために上下にミックス。
  2. 希釈プレートを設定します。
    1. 明確な96ウェルプレートを使用して、標準およびサンプル希釈液を調製し、45 μLの分子グレード水を列1(列1、3、5、7、9、および11)から始まる他のすべての列の各ウェルに加えます。
    2. 5 μL の標準をよく A1 に加え、ピペットを混ぜます。
    3. 新しいフィルターを適用したピペットチップを使用して、ウェルA1からB1までの1/10希釈を作成します。
    4. G1に到達するまで、一連の10倍の希釈を列の下に続けます。
    5. これは負のコントロールとして機能するので、H1 に追加しないでください。
    6. 第1サンプル(S1)をA3に加えて1/10希釈を行います。この混合物をピペットし、5 μLtoウェルB3を移す。この転送後にピペットチップを廃棄します。
    7. 新しいピペットチップで、よくB3で溶液を混合し、1/100希釈を形成します。5μLのこの混合物をよくC3に移し、移管後にチップを捨てます。
    8. 新しいピペットチップで、よくC3で溶液を上下にピペットして1/1000希釈を行います。チップを破棄します。
    9. 列 2、4、6、8、10、または 12 にサンプルを追加せずに、サンプルの希釈を続けます。
    10. すべてのサンプルを希釈したら、内容物をカラム1のウェルに混ぜ、20μLをカラム2に移します。
    11. 列 3、5、7、9、および 11 についてこの手順を繰り返して、各標準およびサンプル希釈の複製を作成します。プレートレイアウトについては 、図3 を参照してください。
      注: 図 3のプレート設定に従う場合、行 G と H で希釈されたサンプルは 1/10 および 1/100 希釈のみを持ちます。

figure-protocol-3
図3:qPCR AAV滴定用プレートレイアウト 青色は、標準のシリアル希釈の配置を示します。緑は、負のコントロールの配置を示します。紫色は、サンプルの希釈の配置を示す。各標準、負、またはサンプルはレプリケートで追加されます。標準の濃度の例が標準の希釈系列を示すために追加され、サンプル希釈液の配置がそれぞれのウェルに加えられた。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

  1. SV40ポリA検出ベースのqPCRによる滴定
    1. 白いセミスカート96ウェルqPCRプレートの各ウェルに15 μLのqPCRマスターミックスを加えます。
    2. 透明な96ウェルプレートから白セミスカート96ウェルqPCRプレートに各サンプルの5μLを移します。
    3. マルチチャンネルピペットを使用して、qPCRマスターミックスとサンプルを適切に混合します。
    4. プレートをシールフィルムで密封し、qPCRプレートを1500 x g で遠心分離します。
    5. 表6の推奨条件を使用して、プレートベースのリアルタイムPCR増幅および検出機器でqPCR反応を実行します。
節サイクル時間温度形容
プレインキュベーション1x5分95°CDNA変性。
増幅38倍15 s95°CDNAの増幅。異なるアニーリング温度を持つ代替プライマーを使用する場合、設定を変更することができます。
60 s60°C
冷却1x60 s40°Cプレート冷却。実行の終了。

表6:加水分解プローブベースのqPCR滴定のためのサーモサイクラープロトコル。 精製されたAAVベクターを抽出したDNAのプローブベースのqPCR滴定を使用するための推奨サーモサイクラープロトコル。

注: qPCR AAV 滴定ワークシートについては 、表 7を参照してください。

  1. AAVゲノムコピー番号を決定するためのデータ解析。
    1. スプレッドシートデータセル(表7A)に、標準およびサンプル希釈液の両方に対して実行されるqPCRから得られた濃度値を記入します。
    2. 表7Aの濃度値を使用して、標準曲線を生成する(表7B)。
      注: 標準曲線は、R2効率とともに自然対数 (y = ln (x) + b) として表示されます。標準曲線は、100% に近い効率と R2が 1.0 (≥0.99) に近い値である必要があります。
    3. このオンライン計算機27を記入して、斜面の効率を記入してください。
      注: 90%~110%の効率は許容されます。qPCR の効率がこの範囲外の場合は、qPCR を再実行します。
    4. 表7Aの濃度値を用いて、各サンプルの希釈を平均化し、各サンプルの標準偏差を求める(表7C)。
      注: サンプル希釈の平均から離れた標準偏差が複数のサンプルから希釈を除外します。
    5. 各希釈の平均濃度を用いて、希釈率を掛け、5で割って各サンプルのベクターゲノム(vg)/μLを得る(表7C)。
    6. 各サンプルの濃度の平均値に 80,000 を掛けて各サンプルの vg/mL を計算します (表 7C)。
    7. 各希釈の平均vg/mLを各サンプルの最終的なvg/mLを生成する(表7C)。
      注:ユーザーは、各希釈の平均濃度を因子5で割って、qPCRを実行する場合に各ウェルにロードされる5μLを考慮して、vg/μLの濃度を生成する必要があります。各サンプルの平均濃度値からvg/mLへの遷移を考慮した係数80,000の要因。まず、各サンプルの濃度値の平均を2倍にして一本鎖ゲノムを占める必要があり、プライマープローブセットは正感覚、一本鎖DNA(ssDNA)のみを定量化し、AAVゲノムは正と負の感覚ssDNA25,28の間におよそ1:1の比率で存在する。各サンプルの濃度値の平均は、5 μLの精製ベクター(セクション 4.1)から抽出されたDNAの200 μL(セクション 4.6.12)までのサンプル希釈を考慮して、x40 を乗算する必要があります。最後に、各サンプルの濃度値の平均を x1000 を掛けて vg/μL から vg/mL に変換する必要があります。

6 ベクトルの品質と純度の評価

  1. 品質管理 - ウェスタンブロット
    1. 12%のSDSページゲルを調製します。
    2. ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行う。
      注:井戸ごとに6 x 1010の10 vgのサンプルをロードしてください。
    3. タンパク質をポリビニリデンジフルオリド(PVDF)膜に移します。
    4. PVDF膜を遮断する
      1. 転写装置から膜を取り出し、0.1%PBSTでリンスし、緩いアクリルアミドを除去する。
      2. 膜を、室温で1時間以上、または4°Cで一晩ブロック溶液に入れる。
        注意:ブロッキングバッファーは、さらに2%のヤギの血清を補うことができます。
    5. 一次抗体によるインキュベーション
      1. ブロッキング緩衝液をデカントし、1:200希釈時に抗AAVマウスモノクローナル抗体である一次抗体を添加する。
      2. 4°Cで一晩インキュベートする。
      3. 一次抗体をデカントし、攪拌で室温で5分間0.1%PBSTで5回洗浄します。
    6. 二次抗体によるインキュベーション
      1. 洗浄液をデカントし、HRPコンジュゲート二次抗体を添加し、ブロッキング緩衝液中で1:7500で希釈し、攪拌で室温で1時間インキュベートする。
      2. 二次抗体をデカントし、攪拌で室温で5分間0.1%PBSTで5回洗浄します。
      3. 攪拌で室温でPBSで最終洗浄を行います。
    7. 強化された化学発光(ECL)基質を用いてタンパク質を検出します。
    8. ゲルを画像化してウイルスタンパク質(VP1、VP2、VP3サブユニット)を可視化する(図4)。

figure-protocol-4
図4:AAVカプシドタンパク質を示すウェスタンブロット。 レーン A;MWラダー、レーンB;AAV6.2FF-hIgG01、レーンC;AAV6.2FF-hIgG02, レーン D;AAV6.2FF-hIgG03、およびレーンE;AAV6.2FF-hIgG04. 6 x 1010 各 AAV6.2FF-hIgGの各々のレーンにロードされた。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

  1. 純度制御 - SDSページとクマシーステイン
    1. ステップ 6.1.1 および 6.1.2 から説明したように SDS-PAGE ゲルおよびサンプルを準備します。
    2. ゲルを1時間または一晩、穏やかな攪拌で固定液に固定します。最初の1時間に1回、固定ソリューションを変更します。
    3. ゲルを2-4時間の染色液に穏やかな攪拌で染色する。
    4. 脱染色溶液を用いてゲルをデステインする。ゲルの背景が完全に脱染されるまで、デステイン溶液を数回補充します(4-24時間)。
    5. デス染色ゲルを保存液中に保管します。
    6. このゲルを画像化して、クマシー染色液で染色されたすべてのタンパク質を可視化します。

figure-protocol-5
図5:クマシー染色ゲル レーン A;MWラダー、レーンB;AAV6.2FF-hIgG01、レーンC;AAV6.2FF-hIgG02, レーン D;AAV6.2FF-hIgG03, レーン E;AAV6.2FF-hIgG04, レーン F;AAV6.2FF-hIgG05、およびレーンG;AAV6.2FF-hIgG06. 6 x 1010 各 AAV6.2FF-hIgGの各々のレーンにロードされた。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

  1. 代替純度制御アッセイ - HEK293宿主細胞タンパク質検出ELISA
    1. メーカーの指示に従って、ELISA経由でHEK293ホスト細胞タンパク質検出を行います。
      注: 精製された rAAV サンプルには、5 x 10-2 および 1 x 10-3 の 希釈を使用してください。TMBをウェルに加えたら、光から離れてインキュベートします。線形回帰は、結果の分析には使用できません。
    2. ポイントツーポイント解析、三次スプライン、または4パラメータロジスティックフィット法を実行して、未知の濃度を補間し、希釈係数を掛けて元のサンプル濃度を決定します。

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結果

小さなげっ歯類モデルから大型動物モデルへの翻訳と最終的な臨床応用は、大きな動物をトランスデュースし、治療効果を達成するために必要な大量のAAVに大きな課題を提示します。合理的に設計されたAAV6.2FFキャプシドの導入効率を比較するために、以前はAAV63と比較してマウス筋細胞における導入効率の101倍の増加を実証し、マウス、ハムスター、および子羊はすべてヒトモノクローナル抗体(hIgG)を発現するAAV6.2FFを投与した。AAV6.2FF-hIgG発現ベクターには、CASIプロモーター4、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節要素(WPRE)、およびSV40ポリA配列が含まれていた。6週齢の雌BALB/c(n=4)マウスを40μLでAAV6.2FF-hIgGの1 x 10 11vgを1 x10 11vg投与し、hIgGモニタリングのためのAAV投与後0日目、7日、14日、21日、28日目に血液を採取した。生後4週間のシリアのハムスター(女性2人と男性2人)は、40μLでAAV6.2FF-hIgGの1 x10 ...

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ディスカッション

本論文で説明する組換えAAV(rAAV)ベクターの製造は、分子生物学の研究室や施設の大部分に見られる一般的な材料、試薬、および装置を使用しています。本論文は、高品質 のインビトロ および インビボ グレードrAAVを読者が生産することを可能にする。とりわけ、rAAV製造のためのこのプロトコルは、塩化セシウム精製を含むより退屈なプロトコルと比較して、効率的であり、超遠心分離の使用を回避する。HEK293細胞がトランスフェクションされると、精製されたAAVは5営業日以内に使用する準備ができています。

rAAVの製造および精製プロセスの間に、多くのステップは、ベクターの純度および最終力剤に影響を与えることができます。最初の最も重要なステップは、HEK293細胞の健康であり、これはベクター力素に直接影響を及ぼします。HEK293細胞のような他の細胞タイプまたはシステムとは対照的にHEK293細胞を使用することは、HEK293細胞が絶え間ない細胞増殖のための堅牢な細胞ネットワークを作り出すプレートおよび細胞のプラスチックコーティングに付着する能力が高い点で...

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開示事項

サラ・K・ウートンは、AAV6.2FFキャプシドの米国特許US10806802B2の発明者です。

謝辞

アミラ・D・Rghei,ブレナ・A・Y・スティーブンス,シルビア・P・トーマス,ジェイコブ・G・E・イェーツは,オンタリオ獣医大学学生奨学金とオンタリオ州大学院奨学金の受給者でした。アミラ・D・ルガイは、学生シップを加速するミタクの受領者でした。この研究は、カナダ保健研究所(CIHR)プロジェクトグラント(#66009)とSKWへの共同健康研究プロジェクト(NSERC提携)助成金(#433339)によって資金提供されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.22 以上 μ;mフィルターミリポアシグマS2GPU05RE
0.25%トリプシンフィッシャーサイエンティフィックSM2001C
1-ブタノールサーモフィッシャーサイエンティフィックA399-4注意。層流フードの下で使用します。手袋を着用してください
10チャンバーセルスタックCorning3271
1L PETGボトルサーモフィッシャーサイエンティフィック2019-1000
30%アクリルアミド/ビス溶液バイオ・ラッド1610158
96ウェルスカートプレートFroggaBioFS-96
粘着プレートシールサーモフィッシャーサイエンティフィック08-408-240
過硫酸アンモニウム (APS)Bio-Rad161-0700注意.層流フードの下で使用します。手袋を着用
血液と組織クリーンアップキットQiagen69506のセクション4.6でDNAクリーンアップに使用します
。層流フードの下で使用します。手袋を着用してください
細胞培養皿Greiner bio-one700023215 cm プレート
培養コニカルチューブサーモフィッシャーサイエンティフィック33965015 mL コニカルチューブ
培養コニカルチューブフィッシャーサイエンティフィック1495524050 mL コニカルチューブ
ダルベッコのモディファイドイーグルミディアム (DMEM) with 1000 mg/L D-グルコース、L-グルタミンCytiva ライフサイエンスSH30022.01
ECL Western Blotting SubstrateThermo Fisher Scientific32209
エタノールグリーンフィールドP016EA95希エチルアルコール(95% vol) をセクション 3.7.4 で 20%、セクション 6.1.1.1 で 70%
シ胎児血清 (FBS)サーモフィッシャーサイエンティフィックSH30396.03
氷酢酸フィッシャーサイエンティフィックA38-500注意。層流フードの下で使用します。手袋を着用してください
グリセロールフィッシャー サイエンティフィBP229-1
グリシンフィッシャー サイエンティフィBP381-500
HBSS (Mg2+ および Ca2+モフィッシャー サイエンティフィSH302268.02
HBSS (Mg2+ および Ca2+モフィッシャーサイエンティフィックSH30588.02
HEK293細胞アメリカ組織培養コレクションCRL-1573受領後、メーカーに記載されているように細胞と培養を解凍しますのプロトコル。細胞の継代が最小限に抑えられ、順調に成長したら、将来のためにサブフラクションをアリコートで凍結し、液体窒素で保存します。常に継代番号30より下のセルを使用してください。培養細胞を30回以上継代した後は、保存されているアリコート
HEK293宿主細胞タンパク質ELISAキットCygnus TechnologiesF650Sメーカーのs instructions
ヘパリン硫酸塩カラムCytiva Life Sciences17040703
KimwipeThermo Fisher ScientificKC34120
 L-グルタミン (200 mM)サーモフィッシャーサイエンティフィックSH30034.02
大容量遠心分離チューブ サポートクッションコーニングCLS431124サポートクッションは、遠心分離機ローターが適切なVボトムクッションを持っている場合を除き、大容量遠心チューブで使用する必要があります
大容量遠心チューブコーニングCLS431123-6EA500 mL 遠心分離チューブ
MgCl2 サーモフィッシャーサイエンティフィ7791-18-6
マイクロ遠心チューブフィッシャーサイエンティフィック05-408-1291.5 mL マイクロ遠心チューブ、使用前に滅菌
モレキュラーグレード ウォーターCytiva ライフサイエンスSH30538.03
N-ラウロイルサルコシンナトリウム塩シグマ アルドリッチL5125注意。手袋を着用する
NaClサーモフィッシャーサイエンティフィBP35810
オプティメム、減量血清中サーモフィッシャーサイエンティフィック31985070
パスツールピペットフィッシャーサイエンティフィック13-678-20D使用前に滅菌
する PBS(10x)サーモフィッシャーサイエンティフィ70011044細胞に使用するために1倍に希釈します
ペニシリン-ストレプトマイシン溶液Cytiva Life SciencesSV30010
pHelper プラスミドDe novo 設計またはプラスミドリポジトリから取得NA
ピペット盆地サーモフィッシャーサイエンティフィック13-681-502滅菌ピペット盆地を購入
ポリエチレングリコール tert-オクチルフェニルエーテル (トリトン X-100)サーモフィッシャーサイエンティフィック9002-93-1注意。手袋を着用する
ポリエチレンイミン(PEI)Polyscience24765-1をフォローしてください'1L溶液を生成するための指示。0.22μmフィルターと4°Cで保存します。C
ポリプロピレンセミスカートPCRプレートFroggaBioWS-96
ポリソルベート 20 (Tween 20)サーモフィッシャーサイエンティフィックBP337-100注意。手袋を着用する
ポリフッ化ビニリデン(PVDF)膜Cytiva Life Sciences10600023鉗子を使用して操作します。手袋を着用してください。
一次抗体Progen65158
Protein LadderFroggaBioPM008-0500
Proteinase KThermo Fisher ScientificAM2546
pTrangene プラスミドDe novo デザインまたはプラスミドリポジトリから取得NA5.0のAAV滴定と互換性があるためには、ゲノムにSV40 polyAが含まれている必要があります
ポンプチューブコールパーマーRK-96440-14チューブの長さを最適化し、フラクションE1-E5
RQ1 Dnase 10 反応バッファーPromegaM6101セクション4.0
RQ1 RnaseフリーDnasePromega M6101
サンプル希釈剤Cygnus TechnologiesI700HEK293ホスト細胞タンパク質ELISAキット
で使用するために別途購入する必要があります二次抗体、HRPサーモフィッシャーサイエンティフィックG-21040
スキムミルクキソイドLP0033B
ドデシル硫酸ナトリウム (SDS)サーモフィッシャーサイエンティフィック28312注意。層流フードの下で使用します。手袋を着用してください
水酸化ナトリウム(NaOH)サーモフィッシャーサイエンティフィックSS266-4
SV40 polyAプライマープローブIDT表Xの配列を使用して、合成のためにIDTから引用します
テトラメチルエチレンジアミン(TEMED)サーモフィッシャーサイエンティフィック15524010注意。層流フードの下で使用します。手袋を着用してください
トリスベースフィッシャーサイエンティフィックBP152-5
トリパンブルーバイオ・ラッド1450021
ウルトラフィルターミリポア シグマUFC810024ウルトラ4 遠心 10K デバイスは、
細胞溶解用の分子量カットオフ ユニバーサルヌクレアーゼサーモフィッシャーサイエンティフィック88702
ユニバーサル qPCR マスターミックスNEBM3003L
Whatman ペーパーミリポア シグマWHA1001325
&β;-メルカプトエタノールフィッシャー サイエンティフィ21985023注意。層流フードの下で使用します。手袋を着用
注意: 危険な化学物質の使用に関するガイドラインについては、材料表を参照してください。
してください プロトコルブロモフェノールブルーフィッシャーサイエンティフィックB392-5注意 ウック ック サーック サーから培養を再開することをお勧めします ック ック ック メーカー セクション オを備えているため、使用する必要があります ック してください

参考文献

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