ここでは、shRNAのレンチウイルス伝達を用いて樹状細胞(DC)の開発に関与する潜在的な転写因子をスクリーニングするためのプロトコルを提供し、 インビトロ DC分化のための安定したノックダウン細胞株を得る。
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この記事について
サマリー
要約
樹状細胞(DC)は、自然免疫応答と適応免疫応答を結ぶ重要な抗原提示細胞です。DC は異種であり、従来の DC (cDC) とプラズマサイトイド DC (pDC) に分割できます。cDCは、ナイーブT細胞に抗原を提示し、活性化することを専門としています。一方、pDCはウイルス感染中にI型インターフェロン(IFN-I)を大量に産生する可能性がある。DC の仕様は、骨髄 (BM) の DC 前駆物質の初期段階で発生し、転写因子 (TF) のネットワークによって定義されます。たとえば、cdc は ID2 を高度に表現し、pDC は E2-2 を高度に表現します。DC のサブセットが増えるため、DC 開発を制御する特定の TF を理解することに関心が高まっています。ここでは、短いヘアピンRNA(shRNA)を含むレンチウイルスを不死化造血幹細胞および前駆細胞(iHSPCs)ラインに送達することにより、 インビトロで DC分化に不可欠なTFをスクリーニングする方法を確立します。選択および インビトロ 分化後、安定したノックダウン細胞株のcDCおよびpDC電位は、フローサイトメトリーによって分析される。このアプローチは、 インビトロの前駆物質からDC運命を支配する可能性のある遺伝子を同定するためのプラットフォームを提供します。
概要
DC は、自然免疫と適応性イミュニティ1の主要なレギュレータです。DC は、主に 2 つの機能的に異なる集団、すなわち pDC と cDC に分類されます。さらに、cdc は 2 つのサブセット、すなわち、タイプ I とタイプ II cDC または cDC1s と cDC2s をそれぞれ 2 から構成します。pDCは、マウス3,4におけるCD11cのBST2、Siglec-H、および中間レベルを発現し、炎症およびウイルス感染時に大量のIFN-Iを分泌することができる細胞である5。また、その堅牢なIFN-I産生能により、全身性エリテマトース(SLE)6を含む自己免疫疾患の進行に重要な役割を果たしていると考えられています。cDC1sは、マウス7におけるXCR1、CD8a、CLEC9AおよびCD103の表面発現によって定義され、抗原クロスプレゼンテーションを通じて細胞傷害性CD8+T細胞(CTLs)の活性化および分極化に特化し、細胞内病原体および癌に応答してI型免疫を始める8,9。
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プロトコル
レンチウイルスの取扱いは、国立台湾大学医学部環境衛生学科の規制に従って行われます。
1. 不死化造血幹細胞および前駆細胞株(iHSPCs)の調製
- 100 ng/mL FL および 1 μM βエストラジオールを含む完全な RPMI 1640 培地で iHSPC 細胞株を維持します。
- 3日ごとに1:10の比率で細胞を通過させる。
注:10%のウシ胎児血清(FBS)、5 x 10-5 M βメルカプトエタノール、および10 μg/mLのゲンタマイシンを補うことによって完全なRPMI 1640培地を作ります。組換えマウスFLも市販されている。
2. レンチウイルス導入
- 100 ng/mL FL、1 μM βエストラジオール、8 μg/mL ポリブレンを含む完全な培地の1 mLの12ウェルプレートで1 x 105 細胞/ウェルの密度でiHSPCsをプレートします。
注:ポリブレンの濃度は細胞の種類に依存し、通常は4〜8 μg/mLの範囲です。 - 100の感染の多重度(MOI)で各ウェルにshRNAを運ぶレンチウイルスを加える。
注意:レンチウイルスベクターは、pLKO.1-PLKO.1-POマイシン選択マーカーを有する(図1
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結果
レンチウイルスベクターpLKO.1-Poの地図を示す(図1)。 iHSPではLacZ(非標的対照)、Tcf4、およびId2に対してレンチウイルス発現shRNAを送達した後、RT-qPCRによって確認されたノックダウン効率は、shLacZ iHSPCsと比較してshTcf4 iHSPCsでTcf4の発現が低下したことを明らかにした(図2A)。一方、shId2 iHSPCsでは、shLacZ iHSPCsコントロールと比較して、Id2の発現低下も認められた(図2B)。shLacZ、shTcf4、およびshId2 iHSPCs細胞株は、FLとインビトロでpDCおよびcDCに分化された。shLacZ iHSPCsの5日間.......
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ディスカッション
レンチウイルスベースのshRNAベクターは、ウイルスによる細胞への導入による遺伝子サイレンシングに使用されることが多く、宿主ゲノムへの安定的な統合が可能です。しかし、様々な細胞種における様々な導入効率を考慮する必要があり、この問題を克服するために多くのアプローチがとられている。
ポリブレンは、細胞膜上の電荷を中和し、それによって細胞へのビリオンの結合を増強することができるポリカチオンポリマーである20。これは、トランスダクション速度を高めるための効果的な方法ですが、過剰な量を追加する場合、一部の細胞タイプにも有毒です。この場合、ポリブレンの毒性を試験し、異なる細胞内の濃度を最適化することが必要である。プロタミン硫酸は、カチオン性化合物であり、細胞生存率を高めるための代替アプローチである可能性がある21。さらに、感染の同じ日に完全な培地をリフレッシュすると、伝達後の生存率を表す値を改善することができる。
ほとんどのshRNA送達シス.......
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開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
Tz-Ling Chen博士の技術サポートに感謝しています。私たちは、shRNAレンチウイルス(http://rnai.genmed.sinica.edu.tw)を提供してくれた国立RNAiコア施設(台湾のアカデミア・シニカ)に感謝します。この研究は、台湾の科学技術省(MOST 108-2320-B-002-037-MY3およびMOST 109-2320-B-002-054-MY3)によって支援されました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 抗体 | |||
| APC/Cy7抗マウスCD11c抗体 | バイオレジェンド | 117324 | (クローン:N418) |
| FITC抗マウス/ヒトCD11b抗体 | バイオレジェンド | 101206 | (クローン:M1/70) |
| PE抗マウス/ヒトB220抗体 | バイオレジェンド | 103208 | (クローン:RA3-6B2) |
| 細胞培養 | |||
| 1.5mLマイクロチューブ | ExtraGene | TUBE-170-C | |
| 12ウェル組織培養プレート | ファルコン | 353043 | |
| ウシ胎児血清(FBS) | コーニング | 35-010-CV | |
| RPMI 1640 中型 | gibco | 11875-085 | |
| <ストロング>試薬 | |||
| &β;-エストラジオール | シグマ・アルドリッチ | E2758-250MG | |
| β-メルカプトエタノール (β-ME) | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| FACS バッファー | 自家製 | 処方: 1xPBS+0.5 %FBS+0.1%NaN3 | |
| >Flt3 リガンド (FL) | 自家製 | ||
| ポリブレン | Sigma-Aldrich | TR-1003-G | |
| ピューロマイシン | Invivogen | ant-pr-1 | |
| TRIsure | BIOLINE | BIO-38032 | |
| shRNA (Taregt sequence/clone ID) | company | ||
| shId2 (GCTTATGTCGAATGATAGCAA/TRCN0000054390) | RNAiコンソーシアム(TRC) | ||
| shLacZ(CGCGATCGTAATCACCCGAGT/TRCN0000072224) | RNAiコンソーシアム(TRC) | ||
| shTcf4(GCTGAGTGATTTACTGGATTT/TRCN0000012094) | RNAiコンソーシアム(TRC) |
参考文献
- Steinman, R. M., Witmer, M. D. Lymphoid dendritic cells are potent stimulators of the primary mixed leukocyte reaction in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 75 (10), 5132-5136 (1978).
- Guilliams, M., et al.
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再版と許可
