ここで、プロトコルは、 インビボ 腹腔内投与のためのナリンゲニン溶液の調製を提示する。ナリンゲニンは、ジメチルスルホキシド、トゥイーン80、および生理食塩水の混合物に完全に溶解します。ナリンゲニンの抗糖尿病性骨粗鬆症効果は、血糖値検査、酒石酸耐性酸性ホスファターゼ染色、および酵素結合免疫吸着アッセイによって評価されました。
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この記事について
サマリー
要約
化合物(ファイトケミカル)溶液の調製は、薬物スクリーニングなどの研究に適用する前に見過ごされていますが重要なステップです。化合物の完全な可溶化は、その安全な使用および比較的安定した結果のために必要です。ここでは、高脂肪食およびストレプトゾトシン(STZ)誘発糖尿病モデルにおけるナリンゲニン溶液およびその腹腔内投与を調製するためのプロトコルが例として実証される。少量のナリンゲニン(3.52〜6.69 mg)を使用して、エタノール、ジメチルスルホキシド(DMSO)、および生理食塩水(PS)で再構成されたDMSOとTween 80を含む溶媒への可溶化をテストしました。化合物の完全な可溶化は、溶液の色、遠心分離後の沈殿物の存在(2000 x g で30秒間)、または溶液を室温(RT)で2時間放置することによって決定されます。安定した化合物/ファイトケミカル溶液を得た後、 in vivo 研究に必要な化合物の最終濃度/量を溶媒のみ(PSなし)のストック溶液で調製し、必要に応じてPSで希釈/混合することができます。マウスにおけるナリンゲニンの抗糖尿病性骨粗鬆症効果(20 mg / kg b.w.、2 mg / mLでの腹腔内投与)は、血糖値、骨量(マイクロCT)、および骨吸収率(TRAP染色およびELISA)を測定することによって評価されました。.詳細な有機/植物化学溶液調製物を探している研究者は、この技術の恩恵を受けるでしょう。
概要
薬物スクリーニングのための植物化学物質の使用に関する研究の増加に伴い、それらの最適な効果を評価するために植物化学溶液を調製するアプローチは注目に値する。化合物1を調製する際には、溶解方法、投与量、濃度などの多くの側面を考慮する必要があります。
溶媒系溶解は、有機化合物調製1に広く用いられている。一般的に使用される溶媒には、水、油、ジメチルスルホキシド(DMSO)、メタノール、エタノール、ギ酸、トゥイーン、グリセリンなどが含まれます2。化合物を胃管投与する場合は、未溶解物質を含む懸濁液が許容されますが、静脈内投与には完全に溶解した溶質が重要です。.油性溶液、懸濁液、およびエマルジョンは毛細血管塞栓症を引き起こす可能性があるため、特に静脈内、筋肉内、腹腔内注射を投与する場合は、化合物調製用の水溶液が推奨されます3。
有効用量範囲は化合物間、および同じ化合物で治療された疾患間でも異なります。.有効用量および安全用量および濃度の決定は、文献および予備実験に依存する4。ここでは、化合物ナリンゲニンの調製が一例として実証される。
ポリフェノー....
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プロトコル
記載されている調査は、国家研究評議会の実験動物の世話と使用に関するガイドラインに準拠しており、上海中医薬大学の動物管理および使用委員会によって承認されました。実験を行う際には、安全のために白衣、使い捨てニトリル手袋、ゴーグルが必要です。
1. in vivo 応用に必要な溶媒の調製とナリンゲニンの推定
- 次の溶媒を準備します:Tween-80(最終濃度範囲:0.5%-1%)、DMSO、グリセリン(最終濃度範囲:15%-20%)、エタノール(最終濃度範囲:筋肉内注射用12%)22、および0.9%PS。
- 用量、マウスの数、および注射頻度に基づいて、必要なナリンゲニンの量を推定します。
- 10匹のマウス(C57BL/6、雄、5週齢、SPF)にナリンゲニンを週5日8週間投与するように注文します。マウスを特定の病原体のない(SPF)状態に保ちます。
注:腹腔内注射に必要な用量は20 mg / kg b.w.23です。 - 次の計算に基づいて160 mgのナリンゲニンを量ります:20 mg / kg x 0.02 kg /マウスx 10マウスx 5日/週x 8週間= 160 mg。
- 10匹のマウス(C57BL/6、雄、5週齢、SPF)にナリンゲニンを週5日8週間投与するように注文します。マウスを特定の病原体のない(SPF)状態に保ちます。
- 生体内に注射されるナリンゲニンの濃度を計算します。
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結果
高脂肪食給餌およびSTZ誘発糖尿病マウスの体重は、STZ治療後0〜8週間から対照群の体重と比較して減少することが見出された。ナリンゲニン投与マウスの体重減少は、4週目の非処置マウス(STZ群)と比較して有意であった。対照群およびSTZ群には、同じ容量のPSを投与した(表1)。糖尿病マウスの血糖値は、STZ誘導後1か月以内に劇的に上昇しました。その後、動物モデルが確立された2か月前に観察されたレベルに自動的に減少しました。ナリンゲニン処理は、1ヶ月と2ヶ月でそれぞれ血糖値を51.8%と34.8%低下させました(表2)。STZ誘発糖尿病マウスは、それぞれ骨量/組織体積(BV/TV)の減少(30.97%)と小柱数(Tb.N)(11.4%)によって示されるように、骨量減少を示した。これら2つのパラメータの値の変化は、ナリンゲニン治療が骨量減少を有意に救ったことを示唆しています(表3)。N.oc/Tb.Ar(骨梁面積当たりの破骨細胞数)で示される破骨細胞活性は、高脂肪食およびSTZ誘発糖尿病マウスで増加したが、対照モデルと疾患モデルの間に統計学的.......
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ディスカッション
植物化学溶液の調製は、 インビボでのその適用の基礎である。このプロトコルでは、ナリンゲニン溶液の調製は、エタノール、DMSO、Tween 80、および0.9%PSなどの異なる溶媒を使用することによって実証されました。完全に溶解した状態の溶液は、室温で長時間放置し、 その後、in vivoで使用する前にろ過して、さらに監視する必要があります。
溶媒測定は、このプロトコルの重要なステップです。化合物を溶解するための多くの溶媒オプションがあり、そのうちエタノール、DMSO、およびPSが最も広く使用されています。エタノールは、その高い極性特性のために多くの水不溶性化合物を溶解することができ、水素結合を可能にし、したがって極性物質と非極性物質の両方を溶解する。さらに、エタノールの濃度は、植物化学物質の性質を決定し得る。たとえば、75重量%のエタノール/水溶媒は、ポリフェノールの最高の収率を抽出するのに最適であると考えられており、最も強い抗酸化特性を持っています26。別の研究では、ポリフェノール抽出物が抗酸化特.......
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開示事項
著者は開示するものは何もありません。
謝辞
この研究は、中国国家自然科学財団(81973607および81573992)の支援を受けました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL マイクロチューブ | Corning Science (Wujiang) Co. | 23218392 | 保持液 |
| 自動脱水機 | ライカマイクロシステムズ(上海)有限公司 | ライカ ASP 300S | 脱水サンプル |
| 血糖値テストストリップ | ジョンソン&ジョンソン(中国)医療機器有限公司 | ||
| 遠心分離機 | MIULAB | ミニッツ遠心分離 | 溶液 |
| 脱水機 | カマイクロシステムズ(上海)貿易有限公司 | ライカ ASP300S | 脱水 |
| DMSO | Sangon Biotech (Shanghai ) Co.,Ltd. | E918BA0041 | 共溶媒 |
| ELISAアッセイキット | Elabscience Biotechnology Co.,Ltd | マウスCOL1(コラーゲンI型) ELISAキット:E-EL-M0325c マウス CTX I ELISA キット: E-EL-M0366c マウス PICP ELISA キット: E-EL-M0231c マウス PINP ELISA キット: E-EL-M0233c | |
| エタノール絶対 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd. | 10009218 | Co-Solvent |
| Ethylene glycol monoethyl ether | Sangon Biotech (Shanghai ) Co.,Ltd. | A501118-0500 | |
| エチレンジアミン四酢酸(EDTA) | ノファーム化学試薬(株 | 10009617 | Decalcification |
| Filter | Merck Millpore (株) | Millex-GP、0.22 µm | フィルター溶液 |
| 氷酸 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10000218 | TRAP |
| グルコースメーター | ジョンソン&ジョンソン(中国)医療機器有限公司 | ワンタッチUltra Vue | :COJJG8GW |
| グラインダー | 京新実験技術 | 組織溶解器-24 | |
| マトキシリン | 南京建城バイオエンジニアリング研究所 | D005 | |
| インスリン注射器 | 上海カンタレイ医療機器有限公司 | 0.33 mm x 13 mm, RW LB | 腹腔内注 |
| L-(+) 酒石酸 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 100220008 | TRAP 染色 |
| 顕微鏡 | OLYMPUS | sz61 | 観察 |
| ミクロトーム | Leica Microsystems (Shanghai) Trading Co. | ライカ RM 2135 | セクション |
| ミニ遠心分離機 | Hangzzhou Miu Instruments Co., Ltd. | Mini-6KC | 遠心分離機 |
| ナフトール AS-BI リン酸 | SIGMA-ALDRICH | BCBS3419 | TRAP 染色 |
| ナリンゲニン | 江蘇 永建製薬 Co.,Ltd | 102764 | 溶質 |
| パラフィン包埋ステーション | ライカ マイクロシステムズ (上海) Co. | ライカ EG 1150 H、ライカ EG 1150 C | Embed サンプル |
| パラロサニリンベース | BBI Life Sciences | E112BA0045 | TRAP 染色 |
| ピペット | eppendorf | 2–20 µL、100–1000 &マイクロ;L、20–200 µL | transferre 液体 |
| プレートリーダー | BioTek Instruments USA, Inc. | BioTek CYTATION 3 イメージング リーダー | ELISA |
| Resin | Shanghai Yyang Instrument Co., Ltd. | 汚 | 中性のbalsam TRAP |
| .,Ltd | A6E1323 | 溶媒 | |
| テートナトリウムの無水Sinopharm | 化学試薬Co.、株式会社 | Merck-1.06268.0250 | 250g | のトラップ |
| 染色の亜硝酸ナトリウム | Sinopharmの化学試薬Co.、株式会社 | 10020018 | |
| Tween-80 | 汚すTRAPのSangon Biotech(上海)Co.、株式 会社。 | E819BA0006 | 乳化剤 |
| ジルコニアビーズ上海 | jingxin実験技術 | 11079125z 454g | 研削 |
参考文献
- Stoye, D. Solvents. Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry. , Wiley Online Library. (2000).
- Bouchard, D., et al. Optimization of the solvent-based dissolution method to sample volatile organic compound vapors for compound-specific iso....
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再版と許可
