このプロトコルは、 エシェリヒア大腸菌 の設計された株を使用し、標準的な実験装置のみを必要とする、無細胞遺伝子発現のための細菌リセートを生成するための迅速かつ簡単な方法を記述する。
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方法論記事
細菌無細胞リザートの迅速、手頃な価格、および単純な生産
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
無細胞遺伝子発現は、生物の合併症を伴わない生物学の力を提供する。このような遺伝子発現システムの多くは存在しますが、ほとんどは購入に非常に高価であり、また/または、効果的に生産するために特別な機器と細かく磨かれた専門知識を必要とします。このプロトコルは、標準的な実験室装置のみを使用し、最小限の処理を必要とする高レベルの遺伝子発現をサポートする細菌無細胞ライセートを生成する方法を記述する。この方法は、成長に影響を与えないが、簡単な凍結融解サイクルに続いて収穫された細胞ペレットを効率的に融解する内生リンジンを産生する大腸菌株を使用する。必要な唯一のさらなる処理は、細胞の破片の自己起質をクリアするために遠心分離に続く短いインキュベーションです。動的遺伝子回路は、収穫前に細胞内のClpXプロテアーゼの異種発現によって達成することができる。lacZ遺伝子を欠いた大腸菌株は、着色または蛍光読み出しを使用して高感度、無細胞バイオセンシングアプリケーションに使用できます。プロトコル全体は8-9時間しか必要としませんが、接種から完了までの実習作業は1〜2時間です。無細胞のライセートを得るためのコストと時間を削減することによって、この方法は、様々なアプリケーションのための無細胞遺伝子発現の手頃な価格を高める必要があります。
概要
無細胞ライセートにおける遺伝子発現は、生細胞1、2、3、4を使用する上で、いくつかの利点がある。ライセートは生化学的に簡単に改変でき、生細胞で達成することが有害または不可能な条件で使用することができます。遺伝子発現回路は、ホスト生物学的プロセスと競合したり、競合したりする必要は一つではなく、新しい遺伝子回路のテストはDNAを追加するのと同じくらい簡単です。これらの理由から、無細胞遺伝子発現は、バイオセンサー5、6から合成遺伝子回路7、8の迅速なプロトタイピング、人工細胞9の開発まで、様々な応用を見つけた。ほとんどの無細胞遺伝子発現は、高度に処理された細胞ライセートを利用し、一般的に長く複雑なプロトコル、特殊な装置、および/または感受性の高いステップを必要とし、ユーザとバッチ10,11....
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プロトコル
1. メディアとバッファを準備します。
- 2xYTPG培地を準備します。
- 62g 2xYT粉末、5.99gリン酸カリウム一塩基、13.93gのリン酸カリウム二塩基、および2Lに脱イオン水を混合する。
- 30分14の露出時間を持つ液体サイクル上のオートクレーブ。
- 1.1.2から2xYTP培地の400mLに、7.2 gのD-グルコース(デキストロース)を加え、溶解するまで混ぜます。
- 0.2 μmフィルターを通してフィルター滅菌します。
- S30A バッファを準備します。
- トリス-HCl(pH 7.7、50 mM最終濃度)、グルタミン酸カリウム(60mM最終)、グルタミン酸マグネシウム(14mM最終)を混合します。
- 10 M KOH を使用して pH を 7.7 に調整します。
- ソリューション 1 の準備 ( 表 1を参照)。
- 4-(2-ヒドロキイェチル)-1-ピペラジネタンスルホン酸(HEPES)を2mLの水で再懸濁します。
- KOH を使用して pH を 8.0 に調整します。
- 表 1から他のすべてのコンポーネントを追加します。 ....
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結果
代表的な結果は、構成的に発現するプラスミドからGFPを発現するために自己分解物を用いることによって観察され得る、ここでpBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500、およびGFP蛍光の時間経過をプレートリーダーに記録する(図1B)。プラスミドDNAの希釈系列は、1nM DNAでも強い発現を発見した。市販のライセートと比較して、オートリセートは、GFP時間経過の時間誘導体として計算された、より大きな総収率を生成し、より大きな最大生産率を達成することができる(図1C、D)。この方法を使用したその他の結果については、Didovykら12を参照してください。このプロトコルの障害ポイントは比較的少ないです。しかし、自己増殖物が細胞デブリを十分にクリアしないと、最適でない結果が得られる。最適な結果は、LYSATの各バッチに対してPEG-8000およびMg2+の濃度を最適化する必要があります(注2参照)。
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ディスカッション
ここで説明するプロトコルは、無細胞遺伝子発現に対して非常に活性な細菌ライセートを生み出す。鍵は、細胞内に内反するラムダファージを発現するプラスミドpAD-LyseRを運ぶ細胞を使用することです。これらの細胞は、内膜の透過化時に自分自身を溶分解するように増強され、単純な凍結融解サイクルを通じて得られた細胞壁への内層リンアクセスを可能にする。細胞は効果的に自分自身をライスするので、製品は自動調整と呼ばれます。細胞がリジングされた後、残りの唯一のステップは、細胞の破片の自己起量をクリアするためにインキュベーションと遠心分離です。
細菌のライセートを製造するための他の方法と比較して、このアプローチは、特に単純かつ迅速であるが、それは、まだそれは、ライセートの品質を犠牲にしません。このプロトコルは、生産文化を接種した後、わずか1〜2時間の実習で完了することができます。分子生物学の実験室のための完全に標準ではない装置の唯一の推奨部分は30,000×gを達成することができる遠心分離機 である。しかし、同等の品質の自動調整は、低速遠心分離機(
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開示事項
J.H.は、がん治療薬に焦点を当てたGenCirq Inc.の共同創設者です。彼は取締役会に在り、GenCirqに株式を持っています。
謝辞
著者らは、ザカリー・サンとリチャード・マレー(カリフォルニア工科大学)がプラスミドP_araBADガムを提供してくれたこと、亀井佳子(京都工業大学)が高速冷却遠心分離機を親切に提供してくれたことに感謝する。この研究は、国立衛生研究所とARO MURIプログラムからの助成金によって支えられ、一部は優秀な若い研究者のためのリーディングイニシアチブ、MEXT、日本によって支援されました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 2xYTメディア | EMD Millipore | 4.85008 | または同等の |
| 3-PGA | Sigma | Aldrich P8877または | 同等の |
| Amicon Ultra-15遠心フィルターユニット、3 kDaカットオフ | Millipore Sigma | UFC900308 | オプション、ライセートの濃縮に使用でき、 |
| アンピシリン | Sigma Aldrich | を濃縮する容量に適した濃縮器容量を選択できますA0166-5G | またはカルベニシリン、より安定したバリアント |
| ATP | Sigma Aldrich | A8937 | または同等の |
| cAMP | Sigma Aldrich | A9501 | または同等の |
| CoA | Sigma Aldrich | C4282 | または同等の |
| CTP | United States Biosciences | 14121 | または同等の |
| D-グルコース(デキストロース) | Fisher Scientific | AAA1749603 | または同等の |
| ジチオスレイトール(DTT) | Sigma Aldrich | D0632-1G | または同等の |
| 大腸菌BL21-ゴールド(DE3)は、pAD-LyseR | Addgene | 99244 | |
| E. coli BL21-Gold(DE3)およびDeltaを保有する。lacZ 搭載 pAD-LyseR | Addgene | 99245 | |
| フォリン酸 | Sigma Aldrich | F7878 | または同等の |
| GTP | United States Biosciences | 16800 | または同等の |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375-25G | または同等の |
| LB 培地 | Fisher Scientific | DF0446075 | または同等の |
| グルタミン酸 | マグネシウムSigma Aldrich | 49605-250G | または同等の |
| NAD | Sigma Aldrich | N6522 | または同等の |
| グルタミン酸カリウム | Sigma Aldrich | G1501-100G | または同等の |
| 水酸化カリウム(KOH) | Sigma Aldrich | 221473-25G | pHを調整するための |
| カリウム二塩基 | Fisher Scientific | BP363-500 | または同等品 |
| リン酸カリウム、一塩基性 | 、Fisher Scientific | BP362-500 | 、または同等の |
| スペルミジン | 、Sigma、Aldrich | 85558 | 、または同等の |
| Tris-HCl | 、Fisher Scientific | 9310500GM | または同等の |
| tRNAミックス | Roche | 10109541001 | または同等の |
| UTP | 、United States Biosciences | 23160 | 、または同等 |
参考文献
- Dudley, Q. M., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free metabolic engineering: biomanufacturing beyond the cell. Biotechnology Journal. 10 (1), 69-82 (2015).
- Smith, M. T., Wilding, K. M., Hunt, J. M., Bennett, A. M., Bundy, B. C. The emerging age of cell-free synthetic biology. FEBS Lette....
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