このプロトコルは、グルタチオン結合ドナービーズとGST融合TPR-モチーフコシャペロンおよびアクセプタービーズとHsp90由来ペプチドを結合してタンパク質とタンパク質相互作用を調べるための技術を提示する。この技術を用いて、Hsp90-FKBP51またはHsp90-FkbP52相互作用を破壊する小分子をスクリーニングし、強力で選択的なHsp90-FKBP51相互作用阻害剤を同定しました。
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この記事について
サマリー
要約
ヒートショックタンパク質90(Hsp90)-コカペロン相互作用を標的とすると、Hsp90依存性細胞内プロセスを特異的に調節する可能性が得る。Hsp90のC末流で保存されたMEEVDペンタペプチドは、コシャペロンのテトラトリコペプチド反復(TPR)モチーフとの相互作用を担う。FK506結合タンパク質(FKBP)51およびFKBP52は、異なる機能を有するステロイドホルモン依存性疾患に関与する2つの類似したTPR-モチーフコシャペロンである。したがって、Hsp90とFKBP51またはFKBP52との間の相互作用を特異的に遮断する分子を同定することは、いくつかのヒト疾患に有望な治療可能性を提供する。ここでは、Hsp90とそのパートナーのコシャペロンFKBP51とFKBP52との相互作用をプローブするための増幅された発光近接均質アッセイのプロトコルについて説明する。まず、TPRモチーフ含有タンパク質FKBP51およびFKBP52をグルタチオンS-トランスファーゼ(GST)タグ付けされた形態で精製しました。GST融合TPR-モチーフタンパク質を有するグルタチオン結合ドナービーズと、Hsp90の10-mer C末端ペプチドと結合したアクセプタービーズを用いて、均質な環境下でタンパク質とタンパク質相互作用を調査した。このアッセイを使用して、Hsp90-FKBP51またはHsp90-FKBP52相互作用を破壊する小分子をスクリーニングし、強力で選択的なHsp90-FKBP51相互作用阻害剤を同定しました。
概要
分子シャペロンは、タンパク質のフォールディング、輸送、分解など、タンパク質ホメオスタシスに寄与します。彼らはいくつかの細胞プロセスを調節し、癌や神経変性疾患などの多数の疾患にリンクされています1.ヒートショックタンパク質90(Hsp90)は、その機能がATP加水分解によって駆動される立体構造変化に依存し、その共シャペロン2によって媒介されるクライアントタンパク質と結合する最も重要なシャペロンの1つである。治療目標としてHsp90の明らかな可能性にもかかわらず、その機能を微調整する大きな課題を表しています。N末端ATP結合領域を標的としたいくつかのHsp90阻害剤は臨床試験で評価されているが、いずれもマーケティングのために承認されていない3。明確に定義されたリガンド結合ポケット4の欠如のために、Hsp90のC末端領域を標的にすることは、限られた成功を持っていた4.近年、低分子によるHsp90-コカペロン相互作用の破壊が代替戦略5として検討されている。Hsp90-コカペロン相互作用を標的とすることは、一般的な細胞ストレス応答を引き出すものではなく、細胞内プロセスを特異的に調節する可能性を提供する。Hsp90のC末流で保存されたMEEVDペンタペプチドは....
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プロトコル
注 : このプロトコルの概要を 図 2に示します。
1. GST-FKBP51およびGST-FKBP52の発現と精製 (図2A)
-
プラスミド
注:画像コンソーシアムから、ヒトFKBP51(クローンID:5723416)およびヒトFKBP52(クローンID:7474554)のcDNAクローンを取得します。- バミヒとXhoI制限部位でpGEX6-1ベクターにオーバーハングし、クローンを含むプライマー(前方;5'GGATATATACTGATGCGAAGGT-3'、逆;5'CTCCTCTATTTCTCTCTCTCTCCACCAC CAC CAC-3')を用いてヒトFKBP51 DNAを増幅する。
- プライマーを用いたPCR(フォワード;5'GAATCATGACAGGCGAGATG-3'、逆;5'-CTCGAGCTATTTCTCTCTCTCCACCAC CAC CAC-3')を含むエコRIとXhoIがオーバーハングし、エコRI/ XhoI制限部位でpGEX6-2ベクターにクローン化することにより、ヒトFKBP52 DNAを増幅する。
注: PCR 反応のセットアップと条件を 表 1 および 表 2に....
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結果
アッセイでは、Z'因子とS/B比はそれぞれ0.82と13.35(図3A)であり、当社のアッセイは、高スループットスクリーニングに対して堅牢で信頼性が高いことを示しています。その後、それを使用して小さな分子質量化合物をスクリーニングしました。 図3B は、選択された小分子とのシャペロンコカペロン相互作用の用量依存的阻害(D10)を示す。D10の線量応答曲線は、IC50 の値が計算された非線形回帰分析によって生成されます。D10は、Hsp90-GST-FKBP51およびHsp90−GST-FKBP52 PPIの両方に用量依存性阻害を示す。しかし、IC50 の値は異なっています:Hsp90のためのIC50 - GST-FKBP51相互作用は65 nMであるのに対し、Hsp90- GST-FKBP52相互作用の場合、完全な阻害は最も高い化合物濃度(100 μM)で達成されなかったが、そのIC50 は30μM>推定される。これらの結果は.......
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ディスカッション
ここでは、Hsp90とTPR-モチーフコシャペロン、特にFKBP51およびFKBP52との相互作用を阻害する小分子をスクリーニングするためのアッセイを用いたプロトコルについて説明する。高いZ'スコア(>0.8)は、ハイスループット形式の堅牢性と信頼性を示しています。結果は1時間以内に得ることができ、少量のビーズ、タンパク質および化合物が必要とされる。さらに、このプロトコルは、関心のある任意のHsp90 / Hsp70 - TPR-モチーフコシャペロン相互作用に容易に拡張することができる。Hsp90のいくつかのTPR-モチーフコシャペロンは、アルツハイマー病から自己免疫疾患、癌などに至るまで、様々なヒト障害に関与してきました。ここで説明するプロトコルは、高い医学的重要性のシャペロンコカペロン相互作用を阻害する小分子のハイスループットスクリーニングのための in vitro 堅牢で安価なアッセイを提供する。
さらに、TPRドメインを標的とし、Hsp90との相互作用を阻害する薬物は、標的に対する親和性だけでなく、他のTPR-モチーフタンパク質に対する選択性についても評価.......
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開示事項
著者は利益相反を報告しません。
謝辞
この研究は、スウェーデン研究評議会(2018-02843)、ブレイン財団(Fo 2019-0140)、カロリンスカ研究所、ガンバーとヨーゼフ・アノール財団、マグヌス・ベルクヴァルス財団、ガンとベルティル・ストーネス財団、トレ・ニルソンズ医学研究財団、トレ・ニルソンズ財団からの助成金によって支えられました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 384ウェルプレート | パーキンエルマー | 6008350 | アッセイ容量 25 ml |
| アミコン 10.000 MWCO 遠心分離ユニット | ミリポア | UFC901008 | 濃縮タンパク質 |
| アンピシリン | Σ | A0166 | 抗生物質 |
| バクテリア シェイカー ユニマックス 1010 | ハイドルフ | 培養細菌 | |
| ヒト用 cDNA クローン FKBP51 | 出典 BioScience | クローンID:5723416 | pCMV-SPORT6ベクター |
| ヒトFKBP52用cDNAクローン | 出典 BioScience | クローンID:7474554 | pCMV-SPORT6ベクター |
| Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C602003 | One Shot BL21 Star (DE3) |
| データ解析ソフト | GraphPad Prism | 9.0.0 | データ解析 |
| ソフト | Excel | 解析データ | |
| DMSO | Supelco | 1.02952.1000 | 薄化合物 |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | 調製液 |
| EDTA | Calbiochem | 344504 | 超音波処理中のタンパク質分解を防ぐ |
| グルタチオン | シグマ | G-4251 | 溶出GSTタグ付きタンパク質 |
| グルタチオンドナービーズ | パーキンエル | マー6765300 | ドナービーズ |
| GSTトラップカラム | Cytiva (GE Healthcare) | 17528201 | GSTタグ付きタンパク質の精製 |
| イソプロピル-&β;-D-チオガラクトシド | サーモフィッシャーサイエンティフィック | R0392 | タンパク質発現の誘導 |
| LBブロス (ミラー) | Sigma | L3522 | 微生物増殖培地 |
| PCR装置 | BIO-RAD | S1000 サーマルサイクラー | 増幅/PCR |
| PD-10カラム | Cytiva (GE Healthcare) | 17085101 | 溶液交換 |
| pGEX-6P-1 ベクター | Cytiva (GE Healthcare) | 28954648 | プラスミド |
| pGEX-6P-2 ベクター | Cytiva (GE Healthcare) | 28954650 | プラスミド |
| プレートリーダー | Perkin Elmer | EnSpire 2300 マルチラベルリーダー | アルファプレートリーダー読み取り |
| ソフトウェア | Perkin Elmer | EnSpire Manager | プレートリーダーソフトウェア |
| プレートリーダーソフトウェアプロトコル | Perkin Elmer | Alpha 384-well 少量 | このプロトコルを使用してプレートを読み取ります |
| PMSF | Sigma | P7626 | 超音波処理中のタンパク質分解を防ぐ |
| プロテアーゼ阻害剤カクテル | Sigma | S8830 | 超音波処理中のタンパク質分解を防ぐ |
| アジ化ナトリウム | Sigma | S2002 | 防腐剤として |
| シアノ水素化ホウ素ナトリウム(NaBH3CN) | シグマ | 156159 | |
| アミノ酸714-724に対応する10個のアミノ酸ペプチドNH2-EDASRMEEVD-COOH | Hsp90 C末端ペプチド | ||
| アクセプタービーズの未反応部位をブロックする | |||
| Tween-20 | Sigma | P1379 | ビーズの凝集を防ぐ |
| 超遠心分離機 Avanti J-20 XP | Beckman Coulter | 遠心分離機でバクテリア細胞ペレットを得る | |
| 超音波細胞かく乱物質 | Microson | Sonicate 細胞にタンパク質を放出させる | |
| 非抱合型アクセプタービーズ | パーキン・エルマー | 6762003 | アクセプタービーズ |
| XCell SureLock Mini-Cell and XCell II Blot Module | Invitrogen | EI0002 | SDS-PAGE |
参考文献
- Muchowski, P. J., Wacker, J. L. Modulation of neurodegeneration by molecular chaperones. Nature Reviews Neuroscience. 6 (1), 11-22 (2005).
- Eckl, J. M., Richter, K. Functions of the Hsp90 chaperone system: lifting client....
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再版と許可
