方法論記事

ライブ顕微鏡とオープンソースソフトウェアを用いた アスペルギルスニデュラン の成長率の定量分析

DOI：

10.3791/62778

⸱

2021年7月24日

 ,  ,  , 
1Microbial Molecular Genetics Laboratory, Institute of Biosciences and Applications, National Centre for Scientific Research, Demokritos (NCSRD), 2Light Microscopy Unit, Institute of Biosciences and Applications, National Centre for Scientific Research, Demokritos (NCSRD)

この記事について

サマリー

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透過光顕微鏡技術を用いたラベルフリーのライブイメージングプロトコルを提示し、水没培養物と固体培地の両方で、画像を撮影し、糸状菌 A.ニドゥラン の成長速度を分析し、定量化します。このプロトコルは蛍光顕微鏡法と共に使用することができる。

要約

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糸状菌のコロニー増殖は、主にヒファエ/ミセリアの上端成長速度の変化に依存し、コロニーサイズを比較することによって固化した培地上でマクロ的に推定される。しかし、異なる環境/成長条件下での遺伝的に異なる真菌株または株(pH、温度、炭素および窒素源、抗生物質など)の増殖速度を定量的に測定することは困難である。したがって、成長速度を定量化するための補完的なアプローチの追求は、真菌細胞の成長をよりよく理解するために必須となる。さらに、アスペルギルスspp.を含む糸状菌は、固体培地または水没培養物上のサブ空中条件下での成長と分化の明確な様式を有することがよく知られている。ここでは、水没培養物と固体培地の両方で生画像化を用いて、モデル菌 アスペルギルスニデュランの成長動態を解析するための定量的な顕微鏡的方法を詳述する。私たちは、ユーザーからの事前の画像解析の専門知識を必要としない方法で、オープンソース、バイオイメージ(フィジーなど)のためのフリーソフトウェアを使用して、再現可能で信頼性の高い方法で異なる真菌株の成長速度をキャプチャし、分析し、定量化します。

概要

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糸状菌は、酵素および抗生物質生産1、2、作物植物3、害虫昆虫4およびヒト3の病原体のための産業/農業用具として重要であること、社会経済的、生態学的に重要な大きな社会経済的、生態学的重要性を持つ。また、アスペルギルスニデュランなどの糸状菌は、遺伝学、細胞、進化生物学の研究や、ヒュファル拡張5の研究などの基礎研究のモデル生物として広く使用されている。糸状菌は、膜脂質/タンパク質の連続供給と延伸先端部の細胞壁のデノボ合成を通じて伸びる高度に偏光した生物である6。催眠先端の成長と極性維持における中心的な役割は、細胞骨格成分とゴルジ6、7、8の偏光分布を主に構成する高度に順序付けられた構造である「スピッツェンコルパー」(SPK)という特殊な構造です。

環境刺激/信号、水と空気の界面、光、CO2 濃度、栄養状態は、これらの金型9によって行われた発達上の決定に責任を負う。水没(液体)培養では 、A.ニデュラン の分化が抑圧され、ヒファル先端伸長6によって成長が起こる。栄養成長の間、無性胞子(コニディア)は、補助的な拡張によって発芽し、相互接続された催眠細胞、菌糸体の未分化ネットワークを形成し、栄養素および空間が利用可能である限り無限に増殖し続ける可能性がある。一方、固体培地の催眠のヒントは、栄養成長(発達能力)の定義された期間(発達能力)の後に、無性生殖が開始され、空気共生茎が菌糸体6の特殊な足細胞から伸びる。これらは、有利な環境条件下で成長を再開することができるハプロイドコニディア10 の長い鎖を生成するコニジオフォアと呼ばれる特殊な発達多細胞構造を生み出す。

糸状菌の成長を測定するために広く使用されている方法は、ペトリ皿に含まれる栄養寒天上の胞子を接種し、数日後にコロニーの直径をマクロコスコープで測定する。コロニーの直径/面積は、最も、心の成長速度の変化に依存し、コニディオフォア密度12に少ない、成長の値として使用されます。しかし、固体表面上に成長する真菌集団(コロニー)サイズを測定することは非常に適切であるが、それは決して最も正確な成長の尺度ではない。集団レベル平均(真菌コロニーサイズの平均)と比較して、単一細胞測定は、細胞集団の不均一性を捕捉し、細胞の新しいサブ集団、状態13、ダイナミクス、経路、ならびに細胞が内因性および環境変化に応答する生物学的メカニズムを同定することを可能にする14、15。タイムラプス顕微鏡による真菌細胞の増殖および表現型をモニタリングすることは、おそらく最も広く使用されている定量的単一細胞観察アプローチである。

ここでは、透過光顕微鏡技術(位相コントラスト、微分干渉コントラスト(DIC)、偏光顕微鏡など)を用いたラベルフリーライブイメージングプロトコルを詳述し、蛍光顕微鏡の併用とは無関係に、水没培養物と固体培地の両方でのA. ニドゥラン 株の極性成長を分析し定量することができる画像を取り込む。

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プロトコル

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1. 接種製剤

注: すべてのステップは、層流キャビネットの下で実行する必要があります。

  1. 目的の真菌株をストリークアウトし、無菌接種ループを使用したグリセロールストック(-80°C)から、検査された株に関連する適切な栄養要件を補った最小培地(MM)のプレートに[MM:10.0 g/Lグルコース、20 mL/L塩溶液(塩溶液:26 g/L KCl、26g/L MgSO4H、26g/L MgSO4H、 76 g/L KH2PO 4、2.0 mL/L クロロホルム)および 1 mL/L トレースエレメント (トレース要素: 40 mg/L Na2B4O7·H2O, 400 mg/L CuSO4,8 g/L ZnSO 4, 800 mg/L MnSO4,800 mg/L FePO4),1 M NaOHで pH を 6.8 に調整, 1 % (w/v) 寒天と必要なサプリメントを加えて 1 6とオートクレーブ] (図 1)。
    注:塩溶液、微量元素溶液およびサプリメントはオートクレーブされています。
  2. 37°Cで2〜3日間インキュベートする。
  3. 滅菌爪楊枝(または接種ループ)を使用し、少数のコニディアを移し、 単一のコロニーに優しく触れることで、完全な培地(CM)のプレートに[CM:10.0 g/Lグルコース、2.0 g/Lペプトン、1.0 g/Lカザアミノ酸、20 mL/L塩溶液、1 mL/L微量元素、5 mL/Lビタミン溶液(ビタミン溶液:ビタミン溶液:1.0g/Lグルコース)に 0.1 g/L リボフラビン、 0.1 g/L ニコチンアミド、 0.01 g/L p-アミノ安息香酸、 0.05 g/L ピリドキシン HCl、1.0 mg/L ビオチン、1 M NaOH で pH を 6.8 に調整し、1%(w/v) 寒天とオートベに記載されている必須サプリメントを加える4°Cの暗いびんにビタミン液を詰め、保存してください。
    注:真菌の成長が個々のコロニーを識別して分離するにはあまりにも密である場合は、単一のコロニーを得るために新しい寒天プレートに再ストリーク。
  4. 37°Cで3〜4日間インキュベートする。
  5. CM寒天プレート上で成長した結膜状の真菌コロニーの表面から1cmを掻き取ることによって、約2 x 106細胞/mLの円錐状懸濁液を得る、無菌爪楊枝を用いた(図S1)。
    注:必要に応じて、ヘモサイトメーターでコニディアを数えます。
  6. A.ニデュランの収穫コニディアは、コニディア塊の数を減らすために0.05%(v/v)Tween 80を含む1.0mLのオートクレーブ蒸留水を有する無菌1.5 mL遠心分離管で収穫する。
    注意:コニディアは、生存率の関連損失(A.アタナソプロスとV.ソフィアノプーロウ、未公開のデータ)の4°Cで最大2〜3週間保存することができます。しかし、心筋の腫れを防ぐために、心座の部分や栄養素を除去するために、耳間の懸濁液を濾過および/または洗浄することをお勧めします。

2. 寒天(固体)培地上で増殖する糸状菌のイメージング用製剤

注: '逆方寒天法17,18の変更されたバージョンが使用されます。

  1. 当初、ペトリ皿(Ø9 cm)15mLのMMの1%(w/v)寒天の上の数ポイントで、激しく渦状の円錐(約2 x 104セル/mL)の10 μLアリコートを見つける(図2)。
    注:「逆天寒天法」の変更されたバージョンを使用して、ヒファエの成長に明らかな有害な影響を及ぼすことがなく、何時間も真菌サンプルを画像化することが可能です。
  2. 実験培養を調査対象とする発達段階に従ってインキュベートする。
  3. 滅菌メスを使用してコロニーを含む寒天の≈0.8 mm2 ブロックをスライスします。
    注: スライスする寒天ブロックの寸法は、その後配置する機器の寸法によって異なります。現在の作品では、8つのウェルμスライドが使用されています(下記参照)。
  4. 生画像に適したカバースリップ付きのμスライドまたは同様の8室カバーグラスの井戸に寒天ブロックを反転して配置します。
    注:透過光顕微鏡が蛍光(標識)顕微鏡と組み合わせて使用される場合、寒天ブロックは、イメージングの直前に、生細胞染色を含む液体培地の液滴に反転させることができます。

3. 液体培地上で増殖する糸状菌のイメージング用製剤

  1. 適当なサプリメント(上記参照)を含む8ウェルμスライドのウェルμスライドのウェルに、激しく渦状の円錐状サスペンション(約2 x 104 細胞/mL)の10 μLアリコートを移す。
  2. 所望の温度で所望の時間をインキュベートする(図3)。
    注:透過光顕微鏡が蛍光(標識)顕微鏡法と組み合わせて使用される場合、液体培養物は実験19の間に任意の所望の時点で蛍光色素を添加できるという大きな利点を有する。

4. キャプチャ画像

メモ:顕微鏡の選択は、利用可能な機器によって異なります。いずれの場合も、顕微鏡のセットアップは、反転ステージ、環境室または少なくとも正確な温度制御を持つ部屋を含める必要があります。

  1. 温度記した顕微鏡室を37°C(特に示されていないか、または使用された真菌種に適していない限り)に予熱して、開始前に温度を安定させます。このチャンバーは、タイムラプス実験中に顕微鏡光学とサンプルステージの温度調節を可能にします。光学収差20 は、通常の浸漬油(23°Cで使用するように設計された)油が37°C以上で使用される場合に導入される点に注意してください。
    注:厳しい予算では、インキュベーションチャンバーは、段ボールと絶縁梱包材21 から、または3Dプリンタ22を使用して作ることができます。
  2. 顕微鏡、スキャナーの電源、レーザーパワー、コンピュータをオンにし、イメージングソフトウェアをロードします。μスライド(前に準備)を顕微鏡の段階に置き、焦点を合わせます。
  3. 画像解析中の成長測定を容易にするために、孤立/重複していない(または少なくとも過密ではない)細胞を含む視野を見つけます。サンプルあたり少なくとも50個の増殖セルをキャプチャして、堅牢な統計分析を可能にします。
  4. 希望の透過光顕微鏡アプローチを選択します。露光時間またはレーザー電力を低減し、ピクセルのドウェル時間および/またはピンホール径を増加させると、他の場所で説明するように、真菌細胞の光の切開を最小限に抑えるために、23、24。
  5. 所望の時間間隔で画像を取得し、時系列取得を開始する顕微鏡を設定します。
    注: 時間の経過に伴う焦点ドリフト(特に長い実験)を補正するには、熱ドリフト、多様なセルサイズ、および細胞運動のために、顕微鏡ソフトウェアで利用可能な場合はオートフォーカス戦略を使用します。

5. 画像解析

注: このセクションでは 、A. ニデュランの成長率を測定するためのタイムラプス顕微鏡画像の処理の重要な手順について説明します。画像の開く、視覚化と処理は、オープンソースのImageJ / フィジーソフトウェア25で達成されます。

  1. プラグイン|を使用してフィジーに画像をインポートします。バイオフォーマット|デフォルト設定のフィジーメニューのバイオフォーマット輸入者(図 4A)。
    メモ:バイオフォーマットインポーターが画像キャリブレーションを正しく認識しているかどうかを確認してください。上部の情報フィールドの画像ウィンドウに表示されるピクチャー寸法は、元の画像の寸法と等しくなければなりません (図 4B)。Shift + Pキーを押して、ImageJ/Fiji ソフトウェアのイメージ プロパティを表示および変更します。
  2. 必要に応じて、異なるフレーム間の照明補正にヒストグラムマッチング26 を使用||を調整する漂白剤補正|ヒストグラムマッチング) (図 4C)
  3. 必要に応じて、SIFTアルゴリズム(プラグイン|登録|SIFT を使用した線形スタックの位置合わせ(画像スタックの位置合わせまたは一致を行う)(図4D)。必要な変換メニューから [翻訳] を選択すると、x-y ドリフトを修正できます。
    注:他のプラグインは、イメージスタビライザー(https://imagej.net/Image_Stabilizer)やStackReg(http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/)などのイメージスライスのスタックを整列するためにも使用できます。
  4. 傾斜したものを避けて、カバースリップに平行に成長するヒファエを選択します。極性延長によって伝播するヒファエを選択し、ヒファエが横方向および/または尖形の分岐を提示するのを避けてください。
  5. MTrackJ (プラグイン|を使用します。MTrackJ)プラグインは、成長する催眠のヒントを追跡します (図 4E)27.トラックを追加するには、ツールバーの[追加]ボタンを選択し、マウスの左クリックを使用して、最初のポイントを催眠先端に配置します。時系列は自動的に次のフレームに移動します。追跡処理を完了するには、最後のポイントでマウスをダブルクリックします (または Esc キーを押します) (図 4F)。最初の時間枠で別の目的のポイント(すなわち、催眠先端の成長)に移動し、別の催眠の成長速度を測定することによって手順を再開します。
    注:MTrackJをインストールするには、https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/ に記載されている手順に従ってください
  6. MTrackJ ダイアログボックスの測定ボタン (図 4G)をクリックして、出力テーブルを開きます。トラックの測定値を保存する (ファイル |目的のファイル形式(csvなど)に保存し、それらを分析してプロットします(図4H)。
    注: [ムービー ] ボタンを選択すると、画像とトラックの進行状況を示すムービーが作成されます。

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結果

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このプロトコルに従って、フィラメント菌 A.ニドゥランの異なる成長/発達段階に対応する様々な画像をキャプチャし、分析しました。この調査で提示されたデータは、フィジーのソフトウェアを使用して処理および分析されました。測定値はcsvファイルとして保存され、統計的に分析され、パンダ、numpy、statsmodel、matplotlib、seabornなどのソフトウェアライブラリを使用して、商業統計ソフトウェアおよび/またはPythonプログラミング言語を使用してグラフとして準備されました。詳細は、引用されたオリジナル出版物に記載されています。

集団の応答を解釈するためには、集団内の主要パラメータの不均一性を決定し、生理学的に異なる亜集団28を効率的に同定することが重要である。図5は、azhA ΔngnAΔ変異株の成長を示し、2つの遺伝子における軸受欠失は、その生成物が、毒性植物性L-アゼチジン

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ディスカッション

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経度経過顕微鏡による真菌細胞の増殖および表現型をモニタリングすることは、リアルタイムおよび定量的に細胞行動を評価し、特定の薬物治療および/または遺伝的介入が時間の経過とともに検出可能な細胞増殖または表現型の違いをもたらすかどうかを正確に判断するための強力なアプローチです。

本研究では 、A.ニドゥランにおける胚芽管およびヒファージ先端の成長のダイナミクスを含む真菌の発達を測定し、定量的に分析するための信頼性の高い生細胞イメージング方法論が説明された。時間の経過に伴う形態変化を監視することは、透過光顕微鏡技術を使用して、ストレス、死んでいるか死んでいる細胞を特定するのに非常に役立ちます。単一細胞レベルでのこのような動的プロセスの詳細な知識は、細胞の混合集団内で不均一性を評価することを可能にし、長期の視点で、細胞が内因性および環境信号に応答する経路および詳細なメカニズムの同定を可能にする。

この方法の利点の1つは、細胞の固有の光屈折特性を使用して染料/ラベルを導入することなく画像コントラストを作成するラベルフリー...

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開示事項

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著者らは開示するものは何もない。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究の一環として、運営プログラム「競争力、起業家精神、イノベーション」(NSRF 2014-2020)が出資する「研究・イノベーション基盤の強化」の活動の下で実施されるプロジェクト「基本的生物学的プロセスの視覚化と監視のためのギリシャ研究インフラ(BioImaging-GR)」(MIS 5002755)が支援し、ギリシャとEUが共同出資しました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
µ-スライド 8 ウェル同上80826イメージング スライド
4-アミノ安息香酸メルクA9878
azhAΔ ngnAΔ遺伝子型:zhAΔ::p yrGAf; ngnAΔ::p yrGAf; pyroA4 pantoB100 / 参考文献:Laboratory collection, Athanasopoulos et al., 2013
Bacto Casamino AcidsGibco223030
BiotinMerckB4639
ChloroformMerck67-66-3
Copper(II) sulfate pentahydrateMerckC8027
グルコースメルクG8270
GraphPad プリズム 8.0GraphPad ソフトウェア統計ソフトウェア
ImageJNIH画像処理および分析ソフトウェア
接種ループメルクI8263-500EA
鉄(III) リン酸メルク1.03935
ライカ アプリケーションスイートXライカマイクロシステムズ顕微鏡ソフト
硫酸マグネシウム七水和物メルク63138
硫酸マンガン(II) 一水和物メルクM7899
顕微鏡 ライカ TCS SP8ライカマイクロシステム
ニコチンアミド(ナイアシンアミド)Supelco47865-U
ペプトンミリポア68971
微生物培養用シャーレKISKERG090
塩化カリウムメルクP4504
リン酸カリウム一塩基性メルクP5655
塩酸ピリドキシンメルクP6280
クオリ - 微量遠心チューブ、1.7mL、DNase-、RNase、パイロジェンフリー、滅菌KISKERG052-S
Quali - 微量遠心チューブ、2.0 mL、滅菌KISKERG053-S
Quali - 標準チップ、面取り、100-1000 µLKISKERVL004G
Quali - 標準チップ、面取り、1-200 & マイクロ;LKISKERVL700G
Quali マイクロボリューム ヒント、DNase-、RNase フリー、0,1-10 µL /クリアキスカーGC。ヒント。B
リボフラビン (B2)Supelco47861
メス刃 NO. 11OdontoMed2011S2771
塩化ナトリウムメルクS7653
水酸化ナトリウムメルクS8045
四ホウ酸ナトリウム十水和物メルクS9640
VS151 (PilA-GFP および H1-mRFP)遺伝子型:pyrG89;pilA::sgfp::AfpyrG+ argB2 nkuAΔ::argB+ pyroA4 hhoA::mrfp::Afribo+ riboB2 / 参考文献:Laboratory collection, Biratsi et al., 2021
WTGenotype: nkuAΔ::argB; pyrG89; pyroA4;pyrG89 /参照:TN02A3 -FGSC A1149
酵母抽出物ミリポア70161
ZnSO4

参考文献

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