フローサイトメトリーによる品質管理痰解析

Summary

このプロトコルは、標準的なフローサイトメトリックプラットフォーム上の単一細胞懸濁液に痰を解離し、その後の細胞サブセットの特性を分類するための効率的な方法を説明する。

Abstract

肺の健康状態を理解するために細胞内容やその他の微小環境特徴を研究するために広く使用されている痰は、従来、細胞学ベースの方法論を用いて分析されている。スライドの読み取りには時間がかかり、高度に専門的な人員が必要であるため、そのユーティリティは限られています。さらに、広範な破片およびあまりにも多くの扁平上皮細胞(SIC)、または頬細胞の存在は、しばしば診断に不十分なサンプルをレンダリングする。対照的に、フローサイトメトリーは、破片やSICを同時に除外しながら、細胞集団のハイスループットのフェノタイピングを可能にします。

ここで提示されるプロトコルは、痰を単一細胞懸濁液に解き分け、抗体染色および細胞集団を固定し、フローサイトメトリクスプラットフォーム上でサンプルを取得する効率的な方法を説明する。デブリ、死細胞(SICを含む)および細胞ダブレットの排除を記述する格言戦略がここに提示される。さらに、この研究はまた、分化(CD)45正および負の集団のクラスターに基づいて生存可能な単一の痰細胞を分析し、造血および上皮系のサブセットを特徴付ける方法を説明する。また、サンプルが肺由来で唾液ではないことを示す証拠として、肺特異的マクロファージを同定することで、品質管理の尺度が提供される。最後に、この方法は、3つのフローサイトメーターで分析された同じ患者の痰プロファイルを提供することによって、異なるサイトメトリックプラットフォームに適用できることが実証されています。ナビオスEX、LSR II、および歌詞。さらに、このプロトコルは、関心のある追加の細胞マーカーを含むように変更することができる。フローサイトメトリックプラットフォーム上で全体の喀痰サンプルを分析する方法をここでは紹介し、肺疾患のハイスループット診断を開発するために痰を有効にします。

Introduction

フローサイトメーターのハードウェアとソフトウェアの技術的進歩により、多くの異なる細胞集団を同時に^1,2,3,4個同定することが可能^{になりました}。例えば造血細胞研究におけるフローサイトメーターの利用は、免疫系²および造血系⁵の細胞階層の理解を大幅に向上させ、また多数の異なる血液癌の診断的区別^を6,7,8に^導いた。ほとんどの喀痰細胞は造血起源^9,10,11であるが、血流サイトメトリーは診断目的で喀痰解析に広く適用されていない。しかし、いくつかの研究は、痰(細胞の最も重要なサブセット)における免疫細胞集団の評価が喘息および慢性閉塞性肺疾患(COPD)^12,13,14,15などの疾患の診断および/またはモニタリングに大きな助けとなる可能性があることを示唆している。さらに、フローサイトメトリーに使用できる上皮特異的マーカーの存在は、痰、肺上皮細胞における細胞の次の最も重要なサブセットの尋問を可能にする。

異なる組織起源の多くの異なる細胞集団を分析する能力に加えて、フローサイトメーターは比較的短い期間で多数の細胞を評価することができる。それに比べて、スライドベースの細胞学的なタイプの分析には、多くの場合、高度に専門性の高い人員や機器が必要です。これらの分析は、作業集約的であり、分析される痰サンプルの割合に過^ぎない。

3つの重大な問題は、フローサイトメトリーにおける痰の広範な使用を制限する。最初の問題は、痰のコレクションに関連しています。痰は、肺から口腔に粘液を排出するハフ咳を通して収集され、その後、コレクションカップに唾を吐く。粘液は口腔内を通過するので、SEC汚染の可能性が高い。この汚染は検体分析を複雑にしますが、この研究で示されるように、フローサイトメトリックプラットフォーム上で問題が容易に修正されます。

誰もが自発的に痰を作り出すことができるわけではありません。したがって、いくつかの装置は、非侵襲的な方法で痰の収集を支援するために開発された¹⁷。ネブライザーは、そのような装置の1つであり、信頼性の高い痰サンプル18,19,20を生成することが示されている。ネブライザーは、非侵襲的に痰を収集する非常に効果的な方法であるが、その使用はまだ専門の人員²¹を有する医療施設での設定を必要とする。対照的に、肺フルート^22,23,24やacapella16,25などのハンドヘルドデバイスは、非常にユーザーフレンドリーであるため、自宅で使用することができます。これらの補助装置は安全で費用効果が高い。

私たちにとって、アカペラは肺^flute16よりも一貫して良い結果を与えたので、アカペラ装置は痰のコレクションのために選ばれました。痰を使用する主な目的は、肺癌検出テスト¹⁶を開発することであるため、3日間の採取サンプルが決定されました。3日間のサンプルは、1日または2日間のサンプル^26,27,28と比較して肺癌検出の可能性を高めることが示されている。しかしながら、痰の収集の他の方法は、異なる目的のために好ましいかもしれない。ここで説明した痰の収集方法とは異なる場合は、フローサイトメトリクス分析に使用される各抗体または色素を注意深く評価することをお勧めします。異なる喀痰の収集方法がフローサイトメトリーの標的タンパク質にどのような影響を与えるかについては、ごくわずかなデータが利用できます。

第二の問題は、主にフローサイトメトリーに関連する診断に痰を使用するための熱意を減衰させる、細胞数である。問題は、信頼性の高い分析に十分な生存細胞の収集です。2つの研究は、非侵襲的な方法によって収集された痰サンプルが、補助装置の助けを借りて、臨床診断または研究研究で利用できる十分な生存細胞を含み^、16,24を示した。しかし、これらの研究はいずれもフローサイトメトリーに関する細胞数の問題に取り組まないようにした。

このプロトコルの基礎となる研究では、各研究部位に対して承認された制度ガイドラインに従って、肺癌を発症する危険性が高い参加者から喀痰サンプルを採取した。リスクの高い参加者は55年から75年の間と定義され、30パック年を吸い、過去15年以内に禁煙しなかった。患者は、メーカーの指示に従ってアカペラ装置を使用する方法を示^された29 、自宅で3日間連続して痰を採取した。サンプルは最後のコレクションまで冷蔵庫に保管していました。最終採取日に、サンプルは冷凍コールドパックで一晩実験室に出荷されました。サンプルは、受け取った日に単一の細胞懸濁液に処理された。この喀痰収集法により、信頼性の高いフローサイトメトリック解析のために十分以上の生存細胞が得られます。

最後に、以前の細胞数問題に関連して、痰細胞をそのマス状環境からどのように放出させるかという問題である。細胞を生存可能に保ち、フローサイトメーターを詰まらせない単一細胞懸濁液を作り出す方法は?Pizzichini et ^al.30およびMillerら³¹の初期の研究に基づいて、このプロトコルは、フローサイトメトリック分析に適した単一の細胞懸濁液への痰処理のための容易で信頼性の高い方法を記述する。この方法は、フローサイトメトリ^32,33,34の定評のあるガイドラインを用いて、喀痰中の造血細胞および上皮細胞を同定し、計器設定、品質管理措置、および流体細胞測定プラットフォーム上で痰分析を標準化する分析ガイドラインを提供するための効率的な抗体標識戦略を開発しました。

Protocol

痰処理のすべてのステップは、適切な個人用保護具を備えた生物学的安全キャビネットで行われます。

1. 痰解離開始前の試薬製剤

1. 1%パラホルムアルデヒド(PFA)、氷上のサンプルあたり25 mLを解凍し、使用するまで冷たく保ちます。
   注意:PFAは吸入および皮膚接触によって有毒である。メーカーの指示に従って固定液を準備し、使用するまで25 mLアリコートで-20°Cで凍結します。
2. サンプルの重量に近いし、ステップ2.2のために十分な0.1%ジチオトレイトール(DTT)を解凍し、37°Cに持って来ます。 (DTTのアリコートは使用前に-20 °Cで保存する必要があります。
3. ステップ2.2のために37 °Cまで十分な0.5%N-アセチル-L-システイン(NAC)を持って来なさい。(NACは毎週新鮮にして、使用前に4°Cで保管してください。

2. 痰解離

1. 痰サンプルの重量を量って解離試薬の量を決定します。
   注: サンプルは、最初のウェイトが ≤3 g、>3 g が ≤8 g の場合は中程度、>が 16 g ≤ 場合は大きい、サンプルが >16 g の場合は特大である場合は小さいと見なされます。小、中、大、および超大の表示は、プロトコル全体で使用されます。解離や標識に必要な試薬の量は、痰サンプルの大きさによって異なります。
2. 小さなサンプルを清潔な50 mL円錐形チューブ、中程度のサンプルを清潔な250 mLプラスチック製使い捨てボトルに、または大型の超大型サンプルを、清潔な500 mLプラスチック製の使い捨てボトルに移します。0.5%のNACと0.1%DTTの4 mL/gサンプル重量の1 mL/gサンプル重量を加えます。
3. 最高速度(15sの場合)で渦を起こしてから、室温(最高速度)で15分間揺れ動きます。
4. NAC と DTT を中和するために、4 つの量のハンクのバランス塩溶液 (HBSS) (サンプル + 試薬の総量に基づく) でサンプルを希釈します。最高速度で素早く渦を、最高速度で5分間室温で揺れ動く。
5. 100 μm ナイロンメッシュセルストレーナーを通して、1つ以上の50 mL円錐遠心分離チューブにセルサスペンションをフィルターして、単一細胞懸濁液を作成します。
6. 4°Cで10分間800xgで細胞を遠心分離する。 上清を吸引し、1本の15mL円錐状チューブに入ったペレットを全て結合し、同じ条件でHBSSでペレットを洗浄します。
7. 細胞ペレットを、痰サンプルの初期重量によって決定されるバッファーの体積で再懸濁する。
   メモ:小さなサンプルは、HBSSの250 μLで再懸濁されます。中程度のサンプルは、HBSSの760 μLで再懸濁されます。大きなサンプルと超大型サンプルは、1460 μLのHBSSで再懸濁されます。
8. トリパンブルーを使用してライブ/デッドセルカウントのための細胞サスペンションのアリコートを取ります。
   メモ:小さなサンプルの場合は5μLを使用してください。中型、大、または特大サンプルの場合は、10 μL を使用します。
   1. 0.4%のトリパンブルーの30 μLと痰希釈の10 μLを混合して、1:40の最終サンプル希釈を達成します。細胞数のためのヘモサイトメーターの計数室にロードします。
      メモ: セル数が小さすぎる場合や、セル数が多すぎて正確な数を得るには、最終的な希釈を調整する必要があります。痰細胞とSECsや破片を正しく区別するためのGuiotら.²⁰ のコンサルティングを強く推奨します。これは、正確なセル数に不可欠です。
9. 超大型サンプルから、合計から50 x ¹⁰⁶ 個のセルを取り出し、HBSSを十分に追加して新しいチューブに追加して、合計体積1700 μLを作成します。
   注: プロトコルの残りの部分については、このサンプルを大きなサンプルと考えてください。残ったサンプルは廃棄するか、または他の目的のために使用することができる。

3. 抗体と生起性染料染色

1. 抗体と染色染料の選択
   注: 表 1 は、このプロトコルで使用されている抗体および生存率染料と、それらが識別する細胞集団を示しています。
   1. 痰セルを含むチューブにラベルを付けます(ラベルについては 表2 を参照)。
   2. 未染色細胞とチューブとアイソタイプコントロールを有するチューブとサンプルチューブに5mLフローサイトメトリーチューブ(使用されるフローサイトメーターと互換性がある)を使用してください。血液および上皮管サンプルに15 mL円錐形チューブを使用してください。
      注:これらのサンプルは、抗体染色および固定に続いてフローサイトメトリーチューブに移されます。
2. 補償管にラベルを付けます(表3)。
   注:使用されているフローサイトメーターと互換性のある5 mLフローサイトメトリーチューブを使用してください。
3. 表 2 および 表3に示すように、それぞれHBSS、抗体および/または色素の量を痰細胞チューブおよび補償管に加える。
   注:細胞または補償ビーズを追加する前にすべてのチューブにバッファー(HBBS)、抗体、および染料を追加して、すべてのチューブの染色時間が一貫していることを確認してください。
4. 表2に記載されている痰細胞容積量をアッセイチューブに加えます。
5. 表 3 に示すように、補正ビードを補正管に追加します。
6. 氷の上のすべてのチューブ(アッセイおよび補償チューブ)を、光から保護し、35分間インキュベートします。その後、氷冷HBSSと遠心分離機を4°Cで800xgで10分間充填 します。
7. 補償管の場合、ペレットにできるだけ近い上清を吸引し、ペレットをフリックして緩めます。
8. 0.5 mLの冷たいHBSSを補償管に加え、4°Cの氷の上に保管し、フローサイトメトリー分析に必要になるまで光から保護します。
9. 遠心分離後の非染色アイソタイプ、血液、上皮管から上皮管を吸引し、チューブをフリックしてペレットを緩めた。

4. 1%パラホルムアルデヒド(PFA)による固定

1. 未染色の、アイソタイプ、血液、および上皮管に冷たい1%PFA(現在では解凍されるべき)を加える。2 mLを非染色およびアイソタイプチューブに、血液および上皮管に10 mLとした。
2. 氷上のチューブをインキュベートし、1時間光から保護します。30分後に最高速度で素早く渦を起たします。
3. 氷冷HBSSでチューブを充填します。次いで、遠心管を4°Cで1600xgで10分間10分間用 いた。
4. 細胞ペレットを邪魔することなくできるだけ多くの上清を吸引し、指でチューブをフリックして細胞を緩めます。
5. 200 μL のコールド HBSS を、未染色およびアイソタイプのチューブに追加します。
6. 総細胞数に従って血液および上皮管の再懸濁のためのHBSSの容積を計算する。
   注: 再懸濁液量 = 0.15 x [総セル数(痰解離のステップ 8)/¹⁰⁶]。特大サンプルのセル数として 50 x ¹⁰⁶ を使用します。
7. フローサイトメトリー分析が行われるまで、氷上の光から4°Cで保護されたすべてのサンプルおよび補償チューブを保管してください。
   注: このプロトコルは、24 時間を超えるストレージのテストは行っていません。

5. フローサイトメーターでのデータ取得

1. 使用しているフローサイトメーターに対して適切な起動手順を適用します。
   注:プロトコルのこのセクションでは、フローサイトメーターを操作する人は、特に光学系および流体システムの安定性のチェック、光散乱および蛍光強度を標準化するための技術、および正しい補償行列の計算と適用を含む日常的な手順に関して、利用可能な機器の使用に関する訓練を受けていることを前提としています。
2. 国立標準技術研究所(NIST)ビーズを混合して、前方散乱電圧と側面散乱電圧を設定して、ビーズを軸に近づけずにプロット全体に分散するようにNISTビーズを配置します。
   注:このステップは、取得後の分析をゲートすることにより、5 μm未満の破片を確実に除去するために重要です。使用するフローサイトメーターによっては、最小のビーズがしきい値(LSR IIまたはリリックを使用する場合)または高い識別子(Navios EXフローサイトメーターを使用)で除外されないことに注意してください。Navios EXでは、フォワードとサイドの散乱には2のゲイン、前方散乱には236、サイドスキャッタには250の電圧が使用されました。LSR IIでは、順方向散乱電圧165、側散乱電圧190を使用した。
3. 流量を中(LSR II)または高(Navios EX)に設定します。
   メモ:ほとんどの機器の中流量または高流量は、痰管の獲得に使用できます。流量が遅すぎたり、サンプルが希薄化しすぎると細胞が沈降し、望ましくない渦が増える可能性があることに注意することが重要です。したがって、ステップ4.6で計算されたリサスペンション体積に付着すると、迅速に取得できるが、機械を詰まらせない細胞密度をもたらすはずである。
4. 散乱パラメータと蛍光パラメータに使用する各パラメータの電圧を調整して、細胞集団をスケールに配置します。それに応じて電圧を調整する方法のガイダンスとして、格言戦略との数字を使用してください。
   注: 必要なすべてのパラメータが取得前のパラメータ選択ウィンドウで選択されているか、データが取得されないことを確認してください。
5. 最初に未染色痰サンプルのデータを取得し、次いでアイソタイプ染色サンプル、次に血液管および上皮管を取得する。
   注:細胞懸濁液が集中しすぎて、フローサイトメーターが詰まることなくサンプルを実行できない場合、サンプルはHBSSでさらに希釈される可能性があります。

Results

このプロトコルは、臨床検査室を念頭に置いて開発されました。プロトコルの開発中に焦点は、シンプルさ、効率、および再現性でした。痰の処理における最も時間のかかるステップは、細胞を数えることであることがわかった。したがって、プロトコルは、時間を失うことなく細胞数とは無関係に喀痰処理および細胞標識を行うことができるように設定される。正確な細胞数は、妨げられない実行のためにサンプルを適切に希釈するために必要であり、抗体標識インキュベーション期間中に得ることができます。

このプロトコルは、最適な細胞標識に使用する抗体/色素の量を示すものとして、細胞数の代わりに痰重量測定を使用します。しかし、痰サンプルの重量には大きな変動があります。分析された126個のサンプルのうち、重量は0.57gから38.30gの範囲で、 図1A は痰重量と細胞収率の相関が強くないことを示している。したがって、サンプルは4つのカテゴリに分かれていました。サンプルの重量の中央値は、小さいサンプルの場合は2.1g、中サンプルの場合は5.0g、大サンプルの場合は11.2...

Discussion

痰の細胞含有量は、多くの場合、多くの破片³⁷を伴う広い範囲の細胞の多種多様を含む。さらに、喀痰分析には、サンプルが口腔³⁸の代わりに肺から採取されることを確認する品質管理が必要である。したがって、血液の場合ほどフローサイトメトリーによって痰を分析することは簡単ではなく、例えば、はるかにクリーンで均質な細胞懸濁液を放出する。このプロトコルは、特定のサイズのビーズを使用して計器の設定を提供して、最小および最大の細胞集団の両方を検出できるようにするため、破片、細胞の塊、SECsおよび他の死んだ細胞を汚染するゲージ戦略、そして最後に、痰サンプルが主に唾液ではなく肺からのものであることを保証するための品質管理措置である。

プロトコルには、指摘する価値のある痰を扱う上で重要なステップがあります。まず、細胞収量は、プロトコルの痰解離部分のステップ2.5で使用されるナイロンセルストレーナーの数によって大きな影響を受けることができます。複数のストレーナーは、ストレーナーの詰まりのためにあまりにも多くの細胞...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% パラホルムアルデヒド Flow-Fix	Polysciences	25037
100 µM nylon cell strainers, Falcon #352360	Fisher Scientific	08-771-19
3 M NaOH	EMD	SX0593-1
50 mL 円錐形ファルコンチューブ	Fisher Scientific	14-432-22
Alexa488 抗ヒト CD19	BioLegend	302219
Alexa488 抗ヒト CD3	BioLegend	300415
Alexa488 抗ヒトサイトケラチン	BioLegend	628608
Alexa488 PanCK, CD3, and CD19 アイソタイプ	BioLegend	400129
BV510 抗ヒト CD45	BioLegend	304036
CD66b FITC アイソタイプ	BD Biosciences	555748
CompBead Plus Compensation ビーズ	BD Biosciences	560497
Corning ポリスチレンディスポアブル 滅菌ボトル 250 mL	フィッシャーサイエンティフィ	09-761-4
ニングポリスチレン使い捨て滅菌ボトル500mL	ッシャーサイエンティフィック	09-761-10
CS&Tビーズ	BDバイオサイエンス	655051
DTT	フィッシャーサイエンティフィック	BP172-5
FITC 抗ヒト CD66b	GeneTex	GTX75907
固定可能な生存率 染色	BDバイオサイエンス	564406
FlowCheck	ベックマンコールター	A69183
FlowSet	ベックマンコール	ターA69184
HBSS	フィッシャーサイエンティフィック	14-175-095
NAC	Sigma-Aldrich	A9165
NISTビーズ、05 & MU;M	Polysciences	64080
NIST ビーズ, 20 μM	Polysciences	64160
NIST ビーズ、30 μM	Polysciences	64170
PE 抗ヒト CD45	BioLegend	304039
PE-CF594 抗ヒト EpCAM	BD Biosciences	565399
PE-CF594 CD206/EpCAM アイソタイプ	BD Biosciences 562292
PE-CR594 抗ヒト CD206	BD Biosciences	564063
クエン酸ナトリウム二水和物	EMD	SX0445-1
トリパンブルー溶液、0.4%	フィッシャーサイエンティフィック	15250061