フローサイトメトリーによる品質管理痰解析

Summary

このプロトコルは、標準的なフローサイトメトリックプラットフォーム上の単一細胞懸濁液に痰を解離し、その後の細胞サブセットの特性を分類するための効率的な方法を説明する。

Abstract

肺の健康状態を理解するために細胞内容やその他の微小環境特徴を研究するために広く使用されている痰は、従来、細胞学ベースの方法論を用いて分析されている。スライドの読み取りには時間がかかり、高度に専門的な人員が必要であるため、そのユーティリティは限られています。さらに、広範な破片およびあまりにも多くの扁平上皮細胞(SIC)、または頬細胞の存在は、しばしば診断に不十分なサンプルをレンダリングする。対照的に、フローサイトメトリーは、破片やSICを同時に除外しながら、細胞集団のハイスループットのフェノタイピングを可能にします。

ここで提示されるプロトコルは、痰を単一細胞懸濁液に解き分け、抗体染色および細胞集団を固定し、フローサイトメトリクスプラットフォーム上でサンプルを取得する効率的な方法を説明する。デブリ、死細胞(SICを含む)および細胞ダブレットの排除を記述する格言戦略がここに提示される。さらに、この研究はまた、分化(CD)45正および負の集団のクラスターに基づいて生存可能な単一の痰細胞を分析し、造血および上皮系のサブセットを特徴付ける方法を説明する。また、サンプルが肺由来で唾液ではないことを示す証拠として、肺特異的マクロファージを同定することで、品質管理の尺度が提供される。最後に、この方法は、3つのフローサイトメーターで分析された同じ患者の痰プロファイルを提供することによって、異なるサイトメトリックプラットフォームに適用できることが実証されています。ナビオスEX、LSR II、および歌詞。さらに、このプロトコルは、関心のある追加の細胞マーカーを含むように変更することができる。フローサイトメトリックプラットフォーム上で全体の喀痰サンプルを分析する方法をここでは紹介し、肺疾患のハイスループット診断を開発するために痰を有効にします。

Introduction

フローサイトメーターのハードウェアとソフトウェアの技術的進歩により、多くの異なる細胞集団を同時に^1,2,3,4個同定することが可能^{になりました}。例えば造血細胞研究におけるフローサイトメーターの利用は、免疫系²および造血系⁵の細胞階層の理解を大幅に向上させ、また多数の異なる血液癌の診断的区別^を6,7,8に^導いた。ほとんどの喀痰細胞は造血起源^9,10,11であるが、血流サイトメトリーは診断目的で喀痰解析に広く適用されていない。しかし、いくつかの研究は、痰(細胞の最も重要なサブセット)における免疫細胞集団の評価が喘息および慢性閉塞性肺疾患(COPD)^12,13,14,15<....

Protocol

痰処理のすべてのステップは、適切な個人用保護具を備えた生物学的安全キャビネットで行われます。

1. 痰解離開始前の試薬製剤

1. 1%パラホルムアルデヒド(PFA)、氷上のサンプルあたり25 mLを解凍し、使用するまで冷たく保ちます。
   注意:PFAは吸入および皮膚接触によって有毒である。メーカーの指示に従って固定液を準備し、使用するまで25 mLアリコートで-20°Cで凍結します。
2. サンプルの重量に近いし、ステップ2.2のために十分な0.1%ジチオトレイトール(DTT)を解凍し、37°Cに持って来ます。 (DTTのアリコートは使用前に-20 °Cで保存する必要があります。
3. ステップ2.2のために37 °Cまで十分な0.5%N-アセチル-L-システイン(NAC)を持って来なさい。(NACは毎週新鮮にして、使用前に4°Cで保管してください。

2. 痰解離

1. 痰サンプルの重量を量って解離試薬の量を決定します。
   注: サンプルは、最初のウェイトが ≤3 g、>3 g が ≤8 g の場合は中程度、>が 16 g ≤ 場合は大きい、サンプルが >16 g の場合は特大である場合は小さいと見なされます。小、中、大、および超大の表示は、プロトコル全体で使用されます。解離や標識に必要な試薬の量は、痰サンプルの大きさによって異なります。

Results

このプロトコルは、臨床検査室を念頭に置いて開発されました。プロトコルの開発中に焦点は、シンプルさ、効率、および再現性でした。痰の処理における最も時間のかかるステップは、細胞を数えることであることがわかった。したがって、プロトコルは、時間を失うことなく細胞数とは無関係に喀痰処理および細胞標識を行うことができるように設定される。正確な細胞数は、妨げられない実行のためにサンプルを適切に希釈するために必要であり、抗体標識インキュベーション期間中に得ることができます。

このプロトコルは、最適な細胞標識に使用する抗体/色素の量を示すものとして、細胞数の代わりに痰重量測定を使用します。しかし、痰サンプルの重量には大きな変動があります。分析された126個のサンプルのうち、重量は0.57gから38.30gの範囲で、 図1A は痰重量と細胞収率の相関が強くないことを示している。したがって、サンプルは4つのカテゴリに分かれていました。サンプルの重量の中央値は、小さいサンプルの場合は2.1g、中サンプルの場合は5.0g、大サンプルの場合は11.2.......

Discussion

痰の細胞含有量は、多くの場合、多くの破片³⁷を伴う広い範囲の細胞の多種多様を含む。さらに、喀痰分析には、サンプルが口腔³⁸の代わりに肺から採取されることを確認する品質管理が必要である。したがって、血液の場合ほどフローサイトメトリーによって痰を分析することは簡単ではなく、例えば、はるかにクリーンで均質な細胞懸濁液を放出する。このプロトコルは、特定のサイズのビーズを使用して計器の設定を提供して、最小および最大の細胞集団の両方を検出できるようにするため、破片、細胞の塊、SECsおよび他の死んだ細胞を汚染するゲージ戦略、そして最後に、痰サンプルが主に唾液ではなく肺からのものであることを保証するための品質管理措置である。

プロトコルには、指摘する価値のある痰を扱う上で重要なステップがあります。まず、細胞収量は、プロトコルの痰解離部分のステップ2.5で使用されるナイロンセルストレーナーの数によって大きな影響を受けることができます。複数のストレーナーは、ストレーナーの詰まりのためにあまりにも多くの細胞.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% パラホルムアルデヒド Flow-Fix	Polysciences	25037
100 µM nylon cell strainers, Falcon #352360	Fisher Scientific	08-771-19
3 M NaOH	EMD	SX0593-1
50 mL 円錐形ファルコンチューブ	Fisher Scientific	14-432-22
Alexa488 抗ヒト CD19	BioLegend	302219
Alexa488 抗ヒト CD3	BioLegend	300415
Alexa488 抗ヒトサイトケラチン	BioLegend	628608
Alexa488 PanCK, CD3, and CD19 アイソタイプ	BioLegend	400129
BV510 抗ヒト CD45	BioLegend	304036
CD66b FITC アイソタイプ	BD Biosciences	555748
CompBead Plus Compensation ビーズ	BD Biosciences	560497
Corning ポリスチレンディスポアブル 滅菌ボトル 250 mL	フィッシャーサイエンティフィ	09-761-4
ニングポリスチレン使い捨て滅菌ボトル500mL	ッシャーサイエンティフィック	09-761-10
CS&Tビーズ	BDバイオサイエンス	655051
DTT	フィッシャーサイエンティフィック	BP172-5
FITC 抗ヒト CD66b	GeneTex	GTX75907
固定可能な生存率 染色	BDバイオサイエンス	564406
FlowCheck	ベックマンコールター	A69183
FlowSet	ベックマンコール	ターA69184
HBSS	フィッシャーサイエンティフィック	14-175-095
NAC	Sigma-Aldrich	A9165
NISTビーズ、05 & MU;M	Polysciences	64080
NIST ビーズ, 20 μM	Polysciences	64160
NIST ビーズ、30 μM	Polysciences	64170
PE 抗ヒト CD45	BioLegend	304039
PE-CF594 抗ヒト EpCAM	BD Biosciences	565399
PE-CF594 CD206/EpCAM アイソタイプ	BD Biosciences 562292
PE-CR594 抗ヒト CD206	BD Biosciences	564063
クエン酸ナトリウム二水和物	EMD	SX0445-1
トリパンブルー溶液、0.4%	フィッシャーサイエンティフィック	15250061