このプロトコルは、事前埋め込みEdU-ストレプトアビジン-ナノゴールド標識とChromEMTの組み合わせを採用した、構造的に保存されたクロマチンin in situにおける 複製部位の高解像度マッピングのための技術を提示する。
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方法論記事
電子断層撮影による超構造保存クロマチン中の複製ドメインのイメージング
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
細胞核におけるDNAフォールディングの原理と、基本的な遺伝子機能(転写、複製、分離など)の充足中に起こるその動的形質転換は、構造的に保存された核における特定のクロマチン遺伝子座の高分解能可視化に対する実験的アプローチの欠如のために、ほとんど理解されていないままである。ここでは、新たに合成されたDNAのEdU標識と、その後の標識検出とナノ金粒子のAg増幅、クロマチンのChromEM染色を組み合わせることにより、単層細胞培養における複製ドメインを その場で可視化するためのプロトコルを提示する。このプロトコルは、室温サンプル処理のためのクロマチンの最良の構造保存を提供する従来のグルタルアルデヒド固定と互換性のある、高コントラスト、高効率の埋め込み前標識を可能にします。事前埋め込み標識の別の利点は、切片化のために目的の細胞を予め選択する可能性である。これは、不均一な細胞集団の分析、ならびに複製部位におけるクロマチン組織の高分解能3D分析に対する電子断層撮影アプローチとの適合性、および複製後のクロマチン再配列および相間における姉妹染色分体偏析の分析にとって特に重要である。
概要
DNA複製は、細胞分裂中の遺伝情報の忠実なコピーと伝達に必要な基本的な生物学的プロセスです。高等真核生物では、DNA複製は厳しい時空間調節を受け、これは複製起点1の逐次活性化に現れる。同期的に起動する隣接するレプリケーション オリジンは、レプリコン2 のクラスターを形成します。光学顕微鏡のレベルでは、進行中のDNA複製の部位は、様々な数およびサイズの複製病巣として検出される。複製病巣は、標識されたDNA 3,4の複製タイミングに応じて細胞核内の空間分布の特定のパターンを示し、これは次に、その遺伝子活性と密接に相関している。空間と時間で厳密に順序付けられた明確に定義されたDNA複製配列のおかげで、複製標識は、複製プロセス自体の研究だけでなく、定義された転写活性および圧縮レベルを有する特定のDNAサブフラクションを区別するためにも、正確なDNA標識の強力な方法である。複製クロマチンの可視化は、通常、DNA複製機構の主要タンパク質成分の検出(免疫染色または蛍光タンパク質タグ5,6の発現による)または修飾DNA合成前駆体の組み込みによって行われる7,8,9,10 <....
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プロトコル
このプロトコルは、接着細胞用に最適化されており、HeLa、HT1080、およびCHO細胞株で試験されました。
1. 細胞標識と固定
- 酸洗浄されたカバースリップ上のプレートセルを3cmのペトリ皿に入れます。使用される細胞株に推奨される培地中の細胞を70%コンフルエントに増殖させる。
- EdU(5-エチニル-2'-デオキシウリジン)を10 mMストックから10 μM最終濃度に添加し、細胞をインキュベーター内に10分以上置きます(実験目的によって異なります)。短いパルス(最大2分)の場合は、10μM EdUを添加した予め加温した新鮮な培養培地でペトリ皿を準備し、EdUを細胞に直接加えるのではなく、その中にカバースリップを移します。
注:その後のすべてのステップは、特に明記されていない場合は室温で実行されます。 - 標識細胞を2.5%グルタルアルデヒドで固定し、25%ストックを100mMカコジル酸緩衝液で希釈して作りたて、1時間固定する。
メモ: 後続の EdU 検出ステップは、固定タイミングの影響を受けます。固定時間が長くなると、EdU ラベリングに悪影響を及ぼし、信号対雑音比が低くなる可能性があります。 - 5 mM MgCl2 を添加したPBSでサンプルを洗浄することによりグルタルアルデヒドを除去する(その後PBS*)。各洗浄について10分間....
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結果
哺乳動物細胞核における複製病巣は、S期進行に応じて核内の分布の明確なパターンを示す。これらのパターンは、複製される遺伝子座の転写活性と相関する。ここで提示された方法は、かなり強い固定手順を利用するので、室温化学固定によって得られたクロマチンの最良の構造保存を提供する条件下でも、様々な転写状態におけるクロマチン遺伝子座の特異的検出に複製パルス標識を使用することはかなり簡単である。
品質管理手順は、このプロトコルの主要な手順を正常に完了することを保証することを目的としています。当初、成功したEdU標識は、蛍光標識されたアジドとのクリック反応によって確認されるべきであり、不均一な細胞集団が使用される場合の典型的な複製パターンを実証する(図2)。第2の重要なステップはストレプトアビジン標識であり、これはグルタルアルデヒド固定によって強く影響され得る。ストレプトアビジン結合効率の評価のために、ストレプトアビジン-ナノゴールドと同じ条件下でAlexaFluor-488-共役ストレプトアビジンを使用する(
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ディスカッション
ここで説明する方法には、以前に公開されたプロトコルに比べていくつかの利点があります。第一に、複製されたDNAを標識するためにClick-chemistryを使用することで、抗体によるBrdU検出のためのDNA変性の前提条件の必要性が排除され、クロマチンの超構造をよりよく保存できます。
第二に、グルタルアルデヒド固定および結合していないアルデヒド基の適切なクエンチ後に生成される二次リガンドとしてのビオチンの利用は、標的の化学修飾を最小限に抑え、内因性ビオチンによるバックグラウンドを低減しながら標識効率を向上させる。ビオチン - ストレプトアビジンはまた、蛍光標識されたストレプトアビジンの使用が手順の非常に早い段階で容易な品質管理を提供するので、汎用性を追加します。このプロトコルは、FluoroNanogold標識ストレプトアビジンの導入によってさらに単純化することができるが、我々の手元では、これらの試薬は、おそらくプローブのサイズが大きいため、ナノゴールド - ストレプトアビジンと比較して幾分高いバックグラウンドを与えた。
第.......
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開示事項
著者は開示するものは何もありません
謝辞
この作業は、RSF (助成金 #17-15-01290) と RFBR (助成金 #19-015-00273) によって部分的にサポートされました。著者らは、ロモノーソフ・モスクワ州立大学開発プログラム(PNR 5.13)とベロゼルスキー物理化学生物学研究所の相関イメージングにおけるニコン・センター・オブ・エクセレンスに、イメージング機器へのアクセスに感謝している。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 試薬 | |||
| 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) | サーモフィッシャー | A10044 | |
| 2-(4-モルフォリノ)エタンスルホン酸 (MES) | フィッシャーサイエンティフィック | BP300-100 | |
| AlexaFluor 555-アジド | テルモフィ | ッシャーA20012 | |
| オチンアジド | ルミプローブ | C3730 | |
| ウシ血清アルブミン | ボバー | LY-0080 | |
| DDSA | SPI-CHEM | 26544-38-7 | |
| DMP-30 | SPI-CHEM | 90-72-2 | |
| DRAQ5 | Thermo Scientific | 62251 | |
| エポキシ樹脂モノマー | SPI-CHEM | 90529-77-4 | |
| グルタルアルデヒド (25%、EMグレード) | TED PELLA, INC | 18426 | |
| アラビアゴム | ACROS Organics 258850010 | ||
| 塩化マグネシウム | Panreac | 141396.1209 | |
| NaBH4 | SIGMA-ALDRICH | 213462 | |
| NMA | SPI-CHEM | 25134-21-8 | |
| N-プロピルガレート | SIGMA-ALDRICH | P3130 | |
| PBS | MP Biomedicals | 2810305 | |
| 乳酸銀 | ALDRICH | 359750-5G | |
| ストレプトアビジン-アレクサフルオア 488 コンジュゲート | テルモフィッシャー | S11223 | |
| ストレプトアビジン-ナノゴールドコンジュゲート | ナノプローブ | 2016 | |
| テトラクロロオーリン酸 | SIGMA-ALDRICH | HT1004 | |
| トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン (トリス) | CHEM-IMPEX INT'L | 298 | |
| Triton X-100 | Fluka Chemica | 93420 | |
| Instruments | |||
| Carbon Coater | Hitachi | ||
| 銅シングルスロットグリッド | Ted Pella | 1GC10H | |
| Cy5 蛍光フィルターセット (Ex620/60 DM660 Em700/75) | Nikon | Cy5 HQ | 代替品:ツァイス、ライカ、オリンパス |
| ダイヤモンドナイフ ウルトラウェット 45o | ジアトモーム | DU | 代替品: テッド・ペラ |
| 蛍光顕微鏡 | ニコン | Ti-E | 代替品: ツァイス、ライカ、オリンパス |
| ハイチルトサンプルホルダー | Jeol | ||
| Rotator | Biosan | Multi Bio RS-24 | |
| EFTEMモードで200kVで動作する透過型電子顕微鏡、高傾斜ゴニオメーター付き | Jeol | JEM-2100 | 代替品:FEI、日立 |
| ピンセット | テッド・ペラ | 523 | |
| ウルトラミクロトーム | ライカ | UltraCut-E | 代替品:RMC |
| Software | |||
| Image acquisition | オープンソース | シリアルEM (https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/) | |
| 画像処理 | オープンソース | IMOD (https://bio3d.colorado.edu/imod/) |
参考文献
- Rivera-Mulia, J. C., Gilbert, D. M. Replicating large genomes: divide and conquer. Molecular Cell. 62 (5), 756-765 (2016).
- Méchali, M. Eukaryotic DNA replication origins: Many choices for appropriate answers. Nature Reviews Molecular and Cell Biology. ....
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再版と許可
