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方法論記事

出芽酵母サッカロミセスセレビシエにおけるサブソキアドタンパク質の局在化の評価

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DOI:

10.3791/62853

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2021年7月19日

 ,  ,  , 
1Departamento de Genética e Biologia Evolutiva, Instituto de Biociências, Universidade de São Paulo

この記事について

サマリー

最近の進歩にもかかわらず、多くの酵母ミトコンドリアタンパク質は依然としてその機能が全く知られていません。このプロトコルは、タンパク質の分子機能の解明の基礎であったタンパク質の局所的な局在を決定するための、シンプルで信頼性の高い方法を提供します。

要約

酵母ミトコンドリアプロテオームの特徴付けの最近の進歩にもかかわらず、かなりの数のタンパク質の局所的な局在は依然として不可解である。ここでは、ミトコンドリアタンパク質機能解明の基本的なステップと考えられる酵母ミトコンドリアタンパク質の副組織化機能の局在を決定するための堅牢かつ効果的な方法について述べた。この方法は、非常に純粋な無傷のミトコンドリアを得ることを含む最初のステップを含む。これらのミトコンドリア製剤は、次に、低張性ショック(腫脹)およびプロテナーゼK(プロテアーゼ)によるインキュベーションからなる亜分画プロトコールを受ける。腫脹の間、外のミトコンドリア膜は選択的に破壊され、プロテイナーゼKが膜間空間コンパートメントのタンパク質を消化することを可能にする。並行して、膜タンパク質のトポロジーに関する情報を得るために、ミトコンドリア製剤は、最初に超音波処理され、次いで炭酸ナトリウムによるアルカリ抽出を行う。最後に、遠心分離後、これらの異なる治療からのペレットおよび上清画分は、SDS-PAGEおよびウェスタンブロットによって分析される。局所的局在化と、関心のあるタンパク質の膜トポロジーは、そのウェスタンブロットプロファイルを既知の標準と比較することによって得られる。

概要

ミトコンドリアは、生物エネルギー、細胞代謝、およびシグナル伝達経路において重要な役割を果たす真核細胞の重要なオルガネラである1。これらのタスクを適切に実行するために, ミトコンドリアは、その構造と機能を担当するタンパク質と脂質のユニークなセットに依存しています。.出芽酵母サッカロミセス・セレビシエは、ミトコンドリアプロセスおよび他のオルガネラ2の研究のためのモデルシステムとして広く使用されています。酵母の8つのタンパク質についてのミトコンドリアゲノムコード;ミトコンドリアタンパク質の大部分(99%)は、細胞質リボソームに翻訳された核遺伝子によってコード化され、その後、高度なタンパク質輸入機によって正しいサブコションコンパートメントに輸入されます3,4,5。したがって、ミトコンドリアの生生成は、核ゲノムとミトコンドリアゲノムの両方の協調発現に依存する6,7。ミトコンドリア生検における欠損を引き起こす遺伝子変異は、ヒト疾患8,9,10と関連している。

過去20年間で、高精製ミトコンドリアを標的としたハイスループットプロテオミクス研究は、酵母ミトコンドリアプロテオームの包括的な特性化をもたらし、少なくとも900タンパク質11,12,13,14から構成されると推定されています。これらの研究は貴重な情報を提供したが、4つのミトコンドリアサブコンパートメントにおける各タンパク質のサブオーガネラの局在、すなわち、外膜(OM)、膜間空間(IMS)、内膜(IM)、およびマトリックスが依然として必要である。この質問は、2つの小さなミトコンドリアサブコンパートメント(OMおよびIMS)15,16のプロテオミオミ全体の研究で部分的に対処された。最近では、Vögtleと共同研究者は、酵母におけるサブコションドリアルタンパク質分布の高品質なグローバルマップを生成することで大きな前進を遂げた。著者らは、SILACベースの定量的質量分析、異なるサブコセンドローム分画プロトコル、およびOMおよびIMSプロテオームからのデータセットを組み合わせた統合アプローチを用いて、818タンパク質を4つのミトコンドリアサブコンパートメント13に割り当てた。

これらのハイスループットプロテオーム研究によって達成された進歩にもかかわらず、提出プロテオーム組成に関する我々の知識は決して完全ではないほどです。実際、Vögtleおよび共同研究者によって酵母ミトコンドリアに局在していると報告された986タンパク質のうち、168は4つのサブソキアドリアコンパートメント13のいずれにも割り当てることができなかった。さらに、ミトコンドリア膜の周囲に末梢に付着すると予測されたタンパク質の膜トポロジーに関する情報は提供しなかった。例えば、内膜に末梢に付着したタンパク質がマトリックスや膜間空間に向いているかどうかを知ることはできない。プロテオーム全体の研究からこれらの欠けているデータとは別に、かなりの数のミトコンドリアタンパク質のサブオーガネラの局在に関する矛盾する情報があります。その一例が、サッカロマイセスゲノムデータベース(SGD)やユニプロットなどの一般的なデータベースで膜間空間タンパク質として割り当てられたプロテアーゼPrd1です。驚くべきことに、ここで説明したような亜分解析プロトコルを使用して、Vögtleと共同研究者は、Prd1が本物のマトリックスタンパク質13であることを明確に示した。前述のように、多くのミトコンドリアタンパク質の局所的な局在化を解明または再評価する必要があります。ここでは、酵母ミトコンドリアタンパク質の副オーガンエリアの局在を決定するための、シンプルで信頼性の高いプロトコルを提供します。このプロトコルは、様々な研究グループによって開発され、最適化され、多くのミトコンドリアタンパク質の膜トポロジーと同様に、サブソクオントリアル局在化を決定するために日常的に使用されてきました。

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プロトコル

1. 酵母細胞の増殖

  1. 細胞の小さな部分を-80°CグリセロールストックからYPD(1%酵母エキス、2%ペプトン、2%グルコース)寒天プレートにストリークさせることにより、目的の株の単一コロニーを単一分離する。プレートを30°Cで2~3日間インキュベートします。
    注:このプロトコルで使用されるS.セレビシエ株はBY4741(MATα;;彼の3Δ1;leu2Δ0;met15Δ0;ura3Δ0)。栄養マーカー遺伝子を除いて、この株は、任意の削除された遺伝子を含んでいないし、任意のプラスミドを運びません。これにより、豊かな培地での培養に成功し、活発な細胞増殖を刺激することができる。プラスミドで形質転換した株を使用する場合は、プラスミド選択に適切な最小培地を使用してください。
  2. 100 mL のエルレンマイヤーフラスコに YPGal 培地(1%酵母エキス、2% ペプトン、2%ガラクトース)の YPD 寒天プレートから 2-3 個のコロニーを接種してスターター培養を準備します。30°Cで24時間、激しく揺れ動く。
    注:成長培地の選択は、プロトコルで使用される酵母株に依存します。YPDとYPGalの両方が発酵性炭素源を含み、ミトコンドリア呼吸を行わない株の増殖を可能にする。しかし、グルコースは多くのミトコンドリア遺伝子の発現を抑制するので、ミトコンドリアの量が少ないため、この炭素源を使用することは推奨されない。呼吸の有能な菌株を用いて呼吸を行う場合、グリセロールやエタノールなどの炭素源を用いて、ミトコンドリアの収率を高くする試みも可能である。
  3. スターター培養液を1Lの新鮮なYPGal培地に希釈し、0.1未満のOD600 にします。OD600が1-1.5に達するまで激しく揺れ、30 °Cで細胞を培養します。
    注:実験を行う前に、酵母株ごとに成長率(倍率)を決定します。これは、培養が1-1.5のOD600 に到達するために必要なインキュベーションの時間の正確な推定値を提供します。

2. 高精製ミトコンドリアの分離

注: このプロトコルは、マイナーな変更で17から適応されています。

  1. 室温で5分間3,000xgで遠心分離して細胞を収穫します。
  2. 蒸留水で細胞を洗い、室温で5分間3,000 x g で遠心分離して回収します。
  3. 細胞のぬれた重量を決定します。
    注: ステップ 2.2 から細胞ペレットの重量を測定する最も簡単な方法は、セルのコレクションの直前に空の遠心管の重量を決定することです。遠心分離後、上清を捨て、細胞と同じチューブの重量を測定します。細胞の重量は、2つの測定値の差です。
  4. パスツールピペットまたはP5000チップを使用して、DTTバッファー(細胞1 g当たり2 mL)の細胞を再懸濁します。DDT バッファー構成については 、表 1 を参照してください。
  5. 穏やかな揺れ(〜70rpm)で20分間、30°Cで細胞をインキュベートします。
  6. 遠心分離機を室温で5分間3,000xgで細胞をペレット化する。
  7. 酵素を使わずにザイモリャーゼ緩衝液で細胞を洗浄する(細胞1g当たり約7mL)。
    Zymolyase バッファーの組成については 、表 1 を参照してください。
  8. 遠心分離機を室温で5分間3,000xgで細胞をペレット化する。
  9. ジモリヤーゼ(細胞1g当たり7mL)を使用せずに、バッファー内の細胞を再懸濁させる。
  10. 細胞懸濁液を250 mLのエルレンマイヤーフラスコに移し、Zymolyase-20T(1gウェットウェイトあたり3mg)を加えます。
  11. 穏やかな揺れ(〜70 rpm)で30〜40分間、細胞を30°Cでインキュベートします。Zymolyase処理前後の細胞懸濁度を比較して、このプロセスの効率を確認してください。
    注:このステップでは、細胞はZymolyaseによる細胞壁消化のために球体に変換されます。
    1. このために、各セル懸濁液の50 μLを加える 2 mL の水を含むガラス管を別々に。激しく混合した後、ジモリャーゼで処理した細胞懸濁液の濁度は、球状体の浸透性破壊のために急速に減少するはずです。一方、非処理細胞懸濁液の濁度は変わらないべきである。
      注:濁りの影響は、簡単な目視検査によって、または両方のサンプルのOD600 を測定することによっても監視することができます。第2の場合において、Zymolyase処理サンプルのOD600 は、非処理サンプルの10%〜20%であるべきである。別の方法は、光顕微鏡を使用して両方のサンプルの細胞を数える必要があります。
    2. 球形芽球形成の収率が低い場合は、さらにZymolyaseを加え、さらに15分間インキュベートします。
  12. 4°Cで5分間、2500 x g で遠心分離により球状体を収穫する。
    注:加水分解酵素によるタンパク質の分解を避けるために、さらなるステップはすべて、氷上または4°Cで迅速に行う必要があります。
  13. 4°Cで5分間、氷冷均質化バッファー(細胞1gあたり約6.5mL)と2,500 x g の遠心分離機でペレットを2回洗浄します。 ホモジナイゼーション・バッファー構成については 、表 1 を参照してください。
  14. 氷冷ホモジナイゼーションバッファー(細胞1g当たり6.5 mL)のスフェロプラストを再懸濁し、予冷ガラスDounceホモジナイザーに移します。約30mLの大型ガラスホモジナイザーを使用してください。
  15. 害虫を使用して15ストロークで球状体を均質化します。
    注: ストロークの数は、害虫のフィッティングに応じて調整する必要があります。きつい害虫の場合は、15ストロークで十分です。一方、緩い害虫を使用する場合は、最大25ストロークを行うことをお勧めします。
  16. ホモゲン酸を50 mL遠心分離管に移し、氷冷均質化バッファーを1ボリューム加えます。
  17. ホモジェン酸を低速で遠心し、ペレット核、細胞デブリ、および切れ目のない細胞に4°Cで5分間1,500 x g 。
  18. ペレットを破壊しないように注意して、パスツールピペットまたはP5000チップを使用して新しい50 mL遠心分離チューブに上清を移します。
  19. 4°Cで5分間4,000 x g で遠心分離機。
  20. 上清を高速遠心管に移し、遠心分離機を12,000 x g で4°Cで15分間15分間、粗いミトコンドリア分率をペレットにします。
  21. 上清を捨て、P5000チップを使用して穏やかなピペット処理を行い、20〜30 mLの氷冷ホモジナイジングバッファーで粗ミトコンドリアペレットを穏やかに洗浄します。
  22. 懸濁液を50mL遠心分離管に移し、4000 x g で4°Cで5分間遠心分離機を動かして、残りの細胞デブリをペレットにします。
  23. 上清を高速遠心管に移し、遠心分離機を12,000 x g で4°Cで15分間15分間、粗いミトコンドリア分率をペレットにします。
  24. 上清を捨て、P1000チップを使用して穏やかなピペット処理を行い、氷冷SEMバッファーの少量(通常は1000 μL)の粗ミトコンドリアペレットを穏やかに再懸濁します。SEM バッファー構成については 、表 1 を参照してください。
    注:この粗ミトコンドリア画分は 、オルガネロ タンパク質輸入アッセイなどの一部のアプリケーションで直接使用できますが、他の細胞成分のかなりの量が含まれています。これらの汚染は、タンパク質の局所的な局所的な局所化を決定する際に、結果の誤解を招く可能性があります。したがって、以下に説明するように、高度に精製されたミトコンドリア製剤を得るためにさらなる精製工程が必要である。
  25. 60%、32%、23%、および15%(w/v)の濃度で、EMバッファーにスクロース溶液を調製します。これらのソリューションは、4 °Cで最大1ヶ月間安定しています。 EM バッファー構成については 、表 1 を参照してください。
  26. 超遠心チューブに4ステップのスクロース勾配を用意します:遠心管の底に60%(w/v)のスクロースを1.5 mL置きます。次に、ピペットを慎重に段階的に:32%の4 mL、23%の1.5 mL、および15%スクロースの1.5 mL(w/v)。フェーズを中断しないように注意してください。
  27. 粗ミトコンドリア分画をショ糖勾配の上に慎重にロードします。
  28. 振るバケットローターで4°Cで134,000 x g で1時間の遠心分離機。
  29. 60%/32%のショ糖界面で茶色のバンドで表される高度に精製されたミトコンドリア分率に達するまで、慎重にスクロース溶液を取り除き続けてください。
  30. P1000カットチップを使用して精製ミトコンドリアを回収し、あらかじめ冷やされた高速遠心管に入れ。
  31. 回収したミトコンドリアを5~10分の氷冷SEMバッファーで希釈します。
  32. 遠心分離機は4°Cで12,000 x g で30分間
  33. P1000カットチップを使用して穏やかなピペット処理を行い、純粋なミトコンドリアを500 μLの氷冷SEMバッファーに再懸濁します。
  34. 製造者の指示に従ってブラッドフォードの手順を使用して、高度に精製されたミトコンドリア製剤のタンパク質濃度を決定します。氷冷SEMバッファーを使用してタンパク質濃度を10mgのタンパク質/mLに調整します。
    注: 以下に説明する提出分画プロトコルでは、作りたてのミトコンドリアを使用することをお勧めします。しかし、Vögtleと共同研究者は、ミトコンドリア無傷の詳細な品質管理分析を行い、凍結されたオルガネラもこのプロトコル13で使用できることを示した。このために、40 μLのアリコートを作り、液体窒素で凍結します。-80°Cで保管してください。

3. サブソクオンドリアル分画議定書

注:このプロトコルはreference18 から適応され、(1)プロテイナーゼKの存在または不在における低血圧腫脹、および(2)超音波処理に続いて炭酸塩抽出の2つのステップで構成されています。タンパク質の分解を避けるために、氷上または4°Cで両方のプロトコルのすべてのステップを実行します。

  1. プロテナーゼKの存在下での低血圧腫脹
    1. 高度に精製されたミトコンドリア40 μLを10 mg/mL(400 μg)で4つの1.5 mLの予冷標識マイクロ遠心チューブに移します。
    2. 360 μL の SEM バッファーをチューブ 1 と 2 に追加します。
    3. 360 μL の EM バッファをチューブ 3 と 4 に追加します。
    4. チューブ2と4に4μLのプロテイナーゼK(10mg/mL)を加えます。間違いを防ぐために 、表 2 に記載されているピペット方式を使用します。
      注:使用前に、10 mg/mL溶液のプロテイナーゼKを水に入れ、準備してください。実験におけるプロテナーゼKの最終濃度は、約50〜100μg/mLである必要があります。詳細については 、「ディスカッション」 セクションを参照してください。
    5. すべてのチューブを穏やかに混ぜ、時折混合して30分間氷の上でインキュベートします。
    6. 4本のチューブに4μLの200mM PMSFを加えるため、プロテナーゼK活性を停止します。
      注意:PMSFは非常に有毒です。PMSF を含むソリューションを使用する場合は、手袋を着用してください。
    7. 4°Cで30分間20,000xgで遠心分離機。
    8. 上清を収集し、新しい1.5 mLの事前冷蔵ラベル付きマイクロ遠心分離管に移します。ペレットを破壊しないように注意してください。
      注:ペレットは、さらなるSDS-PAGEおよびウェスタンブロット分析のためにサンプルバッファに直接再懸濁させることができます。しかし、PMSF処理後もプロテナーゼKの痕跡は活性を保ち、最終的にはペレットがSDS含有サンプルバッファーに溶解した後に一部のタンパク質を消化することができる。この問題を回避するために、以下に説明するトリクロロ酢酸(TCA)による試料の処理により、プロテナーゼKを完全に不活性化することができる。
      注意:TCAは非常に有毒です。TCA を含むソリューションを扱う場合は手袋を着用してください。
    9. ステップ3.1.8からペレットを氷冷SEMバッファーの400 μLで再懸濁します。
    10. 上清(ステップ3.1.8から)と再懸濁されたペレット(ステップ3.1.9から)をTCAで沈殿させ、最終濃度10%(w/v)にします。
    11. 氷上のすべてのチューブを10分間インキュベートします。
    12. TCA処理サンプルを10分間、4°Cで12,000 x g で遠心分離します。
    13. 上清を取り除き、サンプルバッファーの200 μL でペレットを再懸濁します。
      注:酸処理のためにブロモフェノールブルーpHインジケータが黄色になる可能性があります。この場合は、青色になるまで 1 M トリス ベースの小さなアリコート (1 ~ 5 μL) を追加します。
    14. すべてのチューブに4μLの200 mM PMSFを加えます。
    15. SDS-PAGEとウェスタンブロットによる分析が終わるまで、すべてのサンプルを-80 °Cで保管してください。
  2. 超音波処理と炭酸塩抽出
    注:このプロトコルでは、超音波処理がミトコンドリア膜の破裂を引き起こすと、作りたてのミトコンドリアを使用する必要はありません。
    1. 高精製ミトコンドリア200 μLを10 mg/mL(2 mgタンパク質)で1.5mLの予冷マイクロ遠心チューブに移します。
    2. ミトコンドリアを氷冷SEMバッファーで1倍希釈します。
    3. 氷の上に3 x 30 sのためのソニック化ミトコンドリア。少量に対応したソシレーターを使用してください。
    4. サンプルを4°Cで100,000 x g で30分間遠心します。
    5. 上清を収集し、新しい1.5 mLの予冷マイクロ遠心チューブに移します。氷の上に置いておきなさい。このサンプルは可溶性タンパク質画分(S)と名付けられます。
    6. ステップ3.2.4からペレットを氷冷SEMバッファーの400 μLに再懸濁します。
    7. ステップ3.2.6から再懸濁されたペレットを100μL取り、新しい1.5 mLの冷蔵マイクロ遠心分離管に移します。氷の上に置いておきなさい。このサンプルは、サブセクション粒子画分(SMP)と呼ばれます。
    8. ステップ3.2.6から残りの300 μLを1倍に希釈し、200 mM炭酸ナトリウムを作り上げ、お使いください。
    9. ステップ3.2.8から氷の上でサンプルを30分間インキュベートします。
    10. サンプルを4°Cで100,000 x g で30分間遠心します。
    11. 上清を収集し、新しい1.5 mLの予冷マイクロ遠心チューブに移します。氷の上に置いておきなさい。このサンプルは炭酸上上清分画(CS)と呼ばれます。
    12. ステップ3.2.10からペレットを氷冷SEMバッファーの400 μLに再懸濁します。このサンプルは炭酸塩析出画分(CP)と呼ばれます。
    13. TCA を使用してすべてのサンプル (S、SMP、CS、および CP) を最終濃度 10% (w/v) に沈殿させます。
    14. 氷上のすべてのチューブを10分間インキュベートします。
    15. TCA処理サンプルを10分間、4°Cで12,000 x g で遠心分離します。
    16. 上清を取り除き、サンプルバッファー内の各ペレットを再び懸濁します。サンプルバッファーが黄色になった場合は、青色になるまで 1 M トリスベースの小さなアリコート (1 ~ 5 μL) を加えます。
    17. 200 mM PMSF の 1 μL をすべてのチューブに追加します。
    18. SDS-PAGEとウェスタンブロットによる分析が終わるまで、すべてのサンプルを-80 °Cで保管してください。

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結果

提出分画プロトコルの成功は、高度に精製された無傷のミトコンドリアを得るにかかっています。このために、酵母細胞のリシスの間、オルガネラの無傷性はほぼ完全に保存されたままである必要があります。これは、Dounceホモジナイザーを使用して、細胞壁の酵素消化とそれに続く細胞膜の物理的破壊を組み合わせた細胞ライシスプロトコルを使用することによって達成される。ミトコンドリア内容物は、次いで、差動遠心によって収集される。この細胞内分画は、高レベルのポリン(Por1)、ミトコンドリアマーカータンパク質(図1、レーン2)の存在によって確認されるように、富化されたミトコンドリア画分をもたらす。しかし、これは粗いミトコンドリア画分であり、小胞体、液胞、細胞質ゾル、およびエンドソームを含む他の細胞コンパートメントの相当量を含む(図1、レーン2)。これらの汚染は、提出タンパク質の局在化実験などの一部のアプリケーションでアーティファクトを導入する可能性があります。これらの汚染の量を減少させるために、粗ミトコンドリア画分は、さらにショ糖密度勾配遠心...

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ディスカッション

ここに示すプロトコルは、送信コンパートメント13、14、18、21、22、23におけるタンパク質の局在を決定するために、長い間使用され、継続的に最適化されています。このプロトコルの信頼性と再現性は、ミトコンドリア製剤の純度と完全性に強く依存します 18.これらの要件は、粗ミトコンドリア製剤13,24,25(図1)に精製工程(ショ糖密度勾配遠心分離)を追加す...

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開示事項

著者らは利益相反を宣言しない。

謝辞

サブションドリアルマーカータンパク質Cytに対して抗体を提供してくれたA.ツァゴロフ博士(コロンビア大学)に感謝します。 b2、αKGD、およびスコ1。また、この議定書の確立に際して、マリオ・エンリケ・デ・バロス博士(サンパウロ大学)の有益な議論とコメントに感謝します。

この研究は、プンダサン・デ・アンパロ・ア・ペスキサ・ド・エスタド・デ・サンパウロ(FAPESP)(助成金2013/07937-8)からの研究助成金によって支えられました。

フェルナンド・ゴメスとヘレナ・トゥラーノもFAPESP、助成金2017/09443-3と2017/23839-7によってサポートされています。アンジェリカ・ラモスは、コルデナサン・デ・アペルフェイソアメント・デ・ペソアル・デ・ニーヴェル・スーペリア(CAPES)の支援も受けます。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
バクトペプトンBD211677
バクト酵母抽出物BD212750
ックマン超透明遠心分離管、14 x 89 mmベックマンコールター344059
ウシ血清アルブミン(BSA脂肪酸フリー)シグマアルドリッチA7030質化バッファーDL
ジジオスレイトールシグマアルドリッチ43815の成分DDTバッファーの成分
D-ソルビトールSigma-AldrichS1876
エチレンジアミン四酢酸(EDTA)Sigma-AldrichE9884
ガラクトースSigma-AldrichG0625
グルコースSigma-AldrichG7021
MOPSSigma-AldrichM1254
フェニルメチルスルホニルフッ化物(PMSF)Sigma-AldrichP7626プロテイナーゼの不活性化に使用 リン酸
K二塩基性Sigma-AldrichP3786
リン酸カリウム一塩基性Sigma-AldrichP0662
プロテイナーゼKSigma-Aldrich
糖Sigma-AldrichS8501
トリクロロ酢酸(TCA)Sigma-AldrichT6399
Trizma BaseSigma-AldrichT1503
Zymolyase-20T from Arthrobacter luteusMP Biomedicals, Irvine, CA320921た酵母細胞壁を溶解してスフェロプラストを生成するために使用されます
ベ均ショ 生き

参考文献

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