方法論記事

生蛍光、細胞波立方位の逆イメージング、およびマクロピノサイトーシス

DOI：

10.3791/62870

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2021年8月5日

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1Institute for Molecular Bioscience, The University of Queensland

この記事について

サマリー

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このプロトコルは、連続的な取り込みと逆画像を使用して生細胞のデキストランイメージングを実証し、ラフリングの可視化、マクロピノソームの成熟、およびデキストランと他の細胞標識の分析を最適化します。

要約

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マクロピノサイトーシスは、高度に保存されているが、まだ完全には理解されていないプロセスであり、細胞内の液体、液相栄養素、およびその他の物質の取り込みと摂取に不可欠です。細胞表面のフリルの劇的な拡大、マクロピノソームを形成するためのそれらの閉鎖、および内在化されたマクロピノソームの成熟は、この経路における重要なイベントであり、蛍光カーゴのボーラスの追跡に基づく従来の共焦点イメージングでは捉えることが困難な場合があります。蛍光デキストランは、マクロピノソームや他のエンドサイトーシス経路の液相マーカーとして実験的に一般的に使用されています。デキストラン取り込みのイメージングを最適化するために研究室が採用した方法には、培地中の高濃度の蛍光デキストランを浴びた細胞のライブイメージングを使用し、非標識細胞が浮き彫りに(黒色で)現れることが含まれます。細胞のフリルは、フリルの閉鎖を視覚化するために強調表示され、内在化されたマクロピノソームは細胞内部に蛍光液胞として現れます。この方法は、マクロピノソームの特徴を視覚化するのに最適であり、セグメンテーションと定量が容易になります。この論文では、異なるサイズのデキストランを用いた経路の二重標識と、マクロピノソームと他のエンドソームをマークするための脂質プローブと蛍光膜タンパク質の共発現について説明します。相関光電子顕微鏡(CLEM)を用いた超微細構造レベルでの内在化デキストランの検出も実証されています。これらの細胞プロセスは、3Dを含む複数のライブイメージングモダリティを使用してイメージングできます。これらのアプローチを組み合わせることで、マクロピノソームイメージングを多くの異なる設定や実験系に最適化します。

概要

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ほとんどの脊椎動物細胞は、単一細胞アメーバ1にまでさかのぼる進化を通じて、体液の非選択的取り込みの先天的な能力を先行細胞と共有しています。この高度に保存されたマクロピノサイトーシス(大量飲酒)による液相取り込みのプロセスは、アメーバでは主に栄養の獲得に利用されています1が、脊椎動物の細胞では、ストレス下で栄養を得るための供給経路として同様に利用され、免疫細胞では組織環境のサンプリングや監視に利用されています2。マクロピノサイトーシスは、特有の大きな(直径>0.2mm)液胞様マクロピノソーム、流体と溶質の取り込みの非選択的性質、およびマクロピノソームに日和見的に内在化される原形質膜の広がりなど、他の形態のエンドサイトーシスとは異なる特徴を持っています3。この取り込みの非選択的性質は、選別とリサイクルが迅速に行われなければならないことを意味します。マクロピノソームに取り込まれた物質の多くは、リソソームでの分解に運命づけられており、マクロピノソームの成熟と他のエンドソームとの融合を通じてエンド/リソソーム経路に注ぎ込まれます。また、原形質膜タンパク質は、マクロピノソームから細胞表面にリサイクルすることもできます。がん分野では、がん細胞で活性化され、がん細胞の栄養と増殖の維持に役立つ....

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プロトコル

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1. 35mmガラス底皿への細胞調製(0日目)

  1. 10%熱不活化(RAW264.7の場合)または通常のウシ胎児血清と1%L-グルタミンを添加した完全培地で、加湿した5%CO2 インキュベーターで37°Cで細胞株を維持し、継代します。
  2. 適切な数の細胞をプレート化して、24時間で60%のコンフルエントを達成するように、35 mmのガラス底皿にプレートします。
    注:推奨細胞密度は、ここに記載されているRAW264.7、BV2ミクログリア細胞、およびMDA-MB 231乳がん細胞の場合、0.15 x 106 細胞/mLから0.25 x 106 細胞/mLの2 mLです。

2. 蛍光DNAプラスミドトランスフェクション(1日目)-オプション

注:クローニング細胞株で、さまざまな蛍光標識タンパク質およびプローブを一過性または安定的に発現させ、初期エンドソーム、後期エンドソーム、またはリソソームなどのエンドサイトーシス経路のアクチンフリルおよびコンパートメントを特異的に標識することができる。

  1. 製造元の指示に従って、脂質ベースのトランスフェクションキットを使用して、組織培養フードに播種後1日で細胞をトランスフェクションし....

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結果

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高濃度の蛍光デキストランに浸漬した非標識生細胞をイメージングするアプローチには、マクロピノサイトーシスを追跡するための従来のイメージング技術に比べていくつかの利点があります。画像を浮き彫りにすることで、細胞体は黒く見え、明るい蛍光背景に対する劇的な細胞表面の波動の視覚化が向上し、 図1Aに示すようにTMRデキストラン(70 kDa)で満たされたマクロピノソームの液相内在化が続きます。この最大強度投影では、がん細胞が記録され、マクロピノソームが波立たない境界から細胞に侵入します。細胞の内部は黒色で、背景や焦点が合っていない蛍光がないため、マクロピノソームの高コントラストな定義が得られ、 図1B に示され、 図1Cのムービーシーケンスで強調表示されているように、マクロピノソームのサイズと形状を正確に描写し、成熟中に発生する変化を明らかにします。ホモタイプ融合はサイズの増加を伴い(図1C)、マクロピノソーム.......

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ディスカッション

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この論文では、蛍光デキストランに連続的に浸漬された細胞のライブイメージングと、標識されていない細胞の黒色背景への取り込みの視覚化に基づいて、デキストラン標識を使用してマクロピノサイトーシスを追跡する従来の方法のバリエーションについて説明します。最適化されたプロトコルは、異なる細胞内小胞を区別する手段を提供し、複数のマクロピノサイトーシスおよびエンドサイトーシスのカーゴおよびタンパク質の時空間的追跡を可能にします。細胞をデキストラン培地に浸して液相取り込みの動的プロセスをモニターする方法は、Dictyostelium23で初めて実証されました。他の先行研究の例も、取り込みを見るために浮き彫りに細胞を見た15,16。この論文に記載されているプロトコルは、このアプローチのより包括的な治療と分析を提供し、さまざまな細胞および組織環境での将来の研究を促進します。このアプローチは、デ.......

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開示事項

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著者は、競合する金銭的利益を宣言しません。

謝辞

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著者は、Tatiana Khromykhの専門的な技術支援に感謝します。蛍光イメージングは、Australian Cancer Research Foundationが資金提供するCancer Ultrastructure and Function Facilityを組み込んだIMB Microscopyで実施されました。電子顕微鏡は、UQの顕微鏡および微量分析センターで実施されました。資金は、オーストラリア国立保健医療研究評議会(JLS APP1176209)およびオーストラリア研究評議会(DP180101910)から受けました。NDCは、Silicon Valley Community FoundationのアドバイズドファンドであるChan Zuckerberg Initiative DAFからの助成金番号2020-225648により、CZI Imaging Scientistとしてサポートされています。YHは、オーストラリア政府からの奨学金とユルギルバーアルツハイマー研究プログラムからの資金提供により、博士号によって支援されました。Z-JXは、中国科学院の奨学金によって支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
2% 四酸化オスミウムProSciTechEMS19192
647-TransferrinMolecular Probes, Invitrogen T23366
BV2 cellsGift given to us by Dr Liviu Bodea (Queensland Brain Institute)-
CpG (Class B) BIntegrated DNA TechnologiesCustom Order
Dextran Alexa Fluor 488  at 10 kDa MWLife Technology Australia Pty LtdD22910
Dextic Alexa Fluor 647  at 10 kDa MWLife Technology Australia Pty LtdD22914
デキストラン オレゴン グリーン 488 at 70 kDa MWLife Technology Australia Pty LtdD1818
デキストラン テトラメチルローダミン at 70 kDa MWLife Technology Australia Pty LtdD7173
DMEM medium with sodium pyruvate and L-glutamineGibco Invitrogen#11995
Fetal Calf serumInterpath Services Pty LtdSFBS-F
グルタルアルデヒド水溶液、EMグレード 25%ProSciTechC002
Jeol 1011 電子顕微鏡JEOL-L-Glutamine
Gibco Invitrogen25030081
Lipofectamine 2000Gibco Invitrogen11668019
MatTek ガラス底皿 35 mm、コーティングされていないグリッドMatTek CorporationP35G-2-14-CGRD
MatTek ガラス底皿 35 mm コーティングされていないMatTek CorporationP35G-1.5-14C
MDA-MB 231 細胞ATCCHTB-26
Opti-MEM 還元血清培地サーモフィッシャーサイエンティフィック31985088
プラスミド mCherry-2XFYVEDr Frederic Meunier (University of Queensland)よりご丁寧に贈られた贈り物-
Plasmid mCherry-PLCδ-PHGift given to us by Dr Frederic Meunier (University of Queensland)-
Raw264.7 cellsATCCTIB-71
RPMI medium 1640,without L-glutamineGibco Invitrogen#21870
Ultrapure LPSJomar Life Research Pte LtdTLR-3PELPS
酢酸ウラニルProSciTechC079
Zeiss倒立LSM880共焦点顕微鏡Zeiss-

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. King, J. S., Kay, R. R. The origins and evolution of macropinocytosis. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 374 (1765), 20180158(2019).
  2. Stow, J. L., Hung, Y., Wall, A. A.

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