ストップフローと小角中性子散乱によるナノスケール材料の時間発展の測定

Summary

このプロトコルは、小角中性子散乱測定中に複数の液体溶液を その場 で迅速に混合し、ナノメートルの長さスケールと秒の時間スケールで運動過程を研究するために、ストップフローサンプル環境の使用を提示します。

Abstract

この論文では、ストップフロー小角中性子散乱(SANS)サンプル環境を使用して、液体サンプルをすばやく混合し、数秒から数分の時間スケールでナノスケールの運動プロセスを研究します。ストップフローサンプル環境では、市販のシリンジポンプを使用して必要な量の液体サンプルを混合し、ダイナミックミキサーを介して石英ガラスセルに約1秒で注入します。時間分解SANSデータ収集は、サンプル混合と同期して、混合後の溶液中のナノ構造の進化を追跡します。

中性子ビーム時間を最も効率的に利用するために、一連のフローセレクターバルブを使用して、測定の合間にセルを自動的にロード、すすぎ、乾燥させ、複数のサンプル注入を通じて繰り返しデータ収集を可能にします。十分な中性子散乱統計が収集されるまで、サンプル注入が繰り返されます。混合セットアップは、さまざまな混合比、サンプル濃度、添加剤濃度、および温度で動態を測定するために、条件を体系的に変化させるようにプログラムできます。注入ごとに必要な最小サンプル量は、石英セルの経路長に応じて約150 μLです。

このストップフローサンプル環境を使用した代表的な結果は、添加剤であるシクロデキストリンの存在下での迅速な脂質交換速度について示されています。小胞は数秒のオーダーで外側のリーフレット(外部)脂質を交換し、数時間以内に内部と外部の両方の脂質を完全に交換します。脂質交換速度論を測定するには、in situ 混合で高速(秒)と低速(分)のプロセスをキャプチャし、速度定数を抽出する必要があります。同じサンプル環境を使用して、脂質ナノ粒子、タンパク質、界面活性剤、ポリマー、エマルジョン、無機ナノ粒子などの他のタイプの液体サンプルでの分子交換を調べることもできます。交換または反応系のナノスケールの構造変換と動力学を測定することで、ナノスケールで進化するプロセスへの新しい洞察が得られます。

Introduction

小角中性子散乱(SANS)は、≈1 nmから≈100 nm ^1,2,3までの長さスケールでさまざまな材料のサイズ、形状、相互作用、および組織を測定する独自の方法を提供します。集束ミラーを備えたVSANS(超小角中性子散乱)装置を含む最近の機器は、最大≈1000nm4,5までのさらに大きな長さスケールの測定に向けて限界を押し広げています。一般に、中性子散乱法に固有のユニークな散乱コントラストは、医薬品製剤^中の成分の凝集6、ポリマー系における架橋およびゲル化反応^7,8、膜タンパク質のメソ結晶化^9,10、タンパク質の分解およびアンフォールディング^11,12など、ナノスケール構造の時間発展を測定する上でいくつかの利点を提供する。、およびシリカ系材料の成長¹³、^14、15。独自の散乱コントラストにより、時間分解SANS(TR-SANS)は、他のストップフローベースの測定を補完するのに便利です。

ストップフロー混合法は、小角X線散乱(SAXS)16,17,18,19,20,21、蛍光分光法22,23,24,25,26、および光散乱^27,28,29,30においてしばしば実施される^。ミリ秒の時間スケールで運動過程を研究するための^31,32の実験。SANSとSAXSの重要な違いは、中性子散乱は非破壊的な特性評価技術であり、そのため、SANSを使用して、高フラックスX線散乱実験中に発生する可能性のある、サンプルへの電離放射線損傷なしに、同じサンプルを数時間または数日間測定できることです³³。SANS測定を繰り返してもプローブ分子やサンプルの化学構造は変化しないため、例えば蛍光に依存する速度論測定を複雑にする可能性のある光退色の影響なしに時間発展を研究することができます^23,24。さらに、SANSは、動的光散乱などの光ベースの技術では特性評価が難しいことが多い、高濃度で光学的に不透明なサンプルの測定に使用できます。

ナノスケールの構造情報を提供することに加えて、SANSを使用して、中性子散乱長密度コントラストの変化を通じてこれらの構造の局所組成を調べることができます。異なる元素の散乱長密度(SLD)は周期表全体でランダムに変化し、同じ元素の異なる同位体によって変化します。一般的に利用されている例は、水素(^1HまたはH)と重水素(^2HまたはD)であり、これらは中性子散乱長が大きく異なります。したがって、界面活性剤、脂質、タンパク質、RNA、DNA、その他のポリマーなどの水素に富む材料は、システムの物理的特性を大幅に変更することなく、SANSを使用して重水素化溶媒と区別できます。ただし、H/D交換はサンプルの密度、水素結合、および相転移温度に影響を与える可能性があることに注意することが重要です。それにもかかわらず、水素に富む材料に対するSANSのユニークな感度は、SAXSなどのX線ベースの技術で関心のあるサンプルの散乱コントラストとシグナルが低いソフトマター研究で特に役立ちます。同位体置換により、SANSは、H標識分子とD標識分子を混合するだけで、水素が豊富な材料の分子交換速度を研究するための強力なツールになります。同位体置換は、嵩高い蛍光色素が目的の界面活性剤または脂質分子よりも大きく、交換速度論に影響を与える可能性がある系において特に有用である^34、35。

時間分解SANS測定は、測定された強度が時間、長さスケール、およびSLDコントラストの関数であるため、有利です。そのため、TR-SANS実験は、空間分布とサンプルの組成の時間依存の変化を調べるように設計できます。SANSのこれらのユニークな利点は、界面活性剤36,37,38、エマルジョン39,40,41、脂質34,42,43,44,45,46,47,48,49などの多くのソフトマテリアルシステムにおける速度論的プロセスに関する重要な洞察をもたらしました。、50、および^{ポリマー51}、52^、53、54、^55、56、⁵⁷、⁵⁸、⁵⁹、⁶⁰、^61、62。ほとんどのTR-SANS研究は、数分から数時間の時間スケールに焦点を当てています。しかし、関心のある多くの運動過程は2番目の時間スケールで発生し、根底にあるメカニズムを理解するために不可欠です。これらの初期の時点を捉えるには、溶液を迅速に混合し、その場で測定する必要があり、停止流光散乱^27、28、29、^30、31、32、蛍光²²、23、^{24、25、26、}およびX線^{中に混合をデータ収集と同期させる必要があります。16}、^17、18、¹⁹、^20、21の実験。この研究では、複数の液体サンプルを迅速に混合し、TR-SANS測定のために混合物を石英ガラスセルに注入するように設計されたサンプル環境の使用について説明します。混合装置は、最近開発されたキャピラリーレオSANS装置⁶³の適応であり、複数のシリンジポンプおよびバルブを使用して、サンプル混合を制御し、細胞洗浄を自動化する。シリンジポンプを一連のフローセレクターバルブに接続することで、複数の入口ストリームを繰り返し混合、測定、すすぎ、乾燥して、秒単位でのTR-SANS測定を容易にすることができます。

現在の手順では、目的のサンプルが特定され、準備されていることを前提としています。私たちは、その場での混合セットアップとTR-SANSデータを収集する方法に焦点を当てています。中性子散乱データは、NIST中性子研究センター(NCNR)のVSANS機器で収集されました。ただし、この手順は他のSANS機器にも適用できるはずです。他のSANS機器に同様のプロトコルを実装することに関心のある読者は、地元の機器科学者に相談して、目的の速度論プロセスに最も関連する望ましい長さスケールと時間スケールで中性子束を最大化するための最適な機器構成を決定する必要があります。ここに示されているデータは、^{空間分解能5}の損失で中性子数を最大化するために、VSANSの高フラックス「ホワイトビーム」構成を使用して収集されました。検出器キャリッジは、0.005 Å-1 < q < 0.5 ^Å-1の範囲の散乱ベクトル(q)をカバーするように配置され、≈130 nmから≈13 nmの長さスケールに対応します。散乱ベクトルはq = 4π/λ sin(θ/2)と定義され、λは中性子波長、θは散乱角である。

TR-SANS測定に使用されるストップフロー混合装置は、 図1に示すように、複数のポンプ、リンスシリンジ、サンプルシリンジ、フローセレクター、およびアダイナミックミキサー、サンプルセル、および混合サンプル容器で構成されています。すべての密閉流体経路は、シリンジ、バルブ、接続チューブ、ダイナミックミキサー、サンプルセルを含む空調されたエンクロージャ内に配置されています。プログラム可能な熱電エアコンを使用して、エンクロージャの温度を10°Cから50°Cの範囲で±1°C以内に制御します。 エンクロージャの断熱材の一部は、デバイスの動作部分を示すために取り外されていることに注意してください。メインのミキシングデバイスの筐体は、NCNRのNG3 VSANSビームラインの並進ステージに配置されています。エンクロージャの位置は、平行移動ステージを使用して調整され、サンプルセルを中性子ビームの経路(黄色の破線)に配置します。

図1:NIST中性子研究センターのVSANSビームラインでのストップフロー混合と小角中性子散乱測定を組み合わせるためのセットアップ例。 セットアップには、4つのシリンジポンプ、溶剤すすぎ用の2つのシリンジ、サンプル注入用の2つのシリンジ、4つのポンプセレクターバルブ、2つのミキサーセレクターバルブ、ダイナミックミキサー、フロースルー石英セル、および混合サンプルコンテナが含まれています。入射した中性子は、サンプルセル内にある混合サンプルから散乱します。石英窓と熱電空調ユニットを備えた断熱エンクロージャを使用して、サンプルとすべての機器を一定温度で制御します。黄色の破線は中性子ビームの経路を示しています。スケールバー= 10 cm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図1に示すデバイスは、2つのサンプルシリンジ、2つのすすぎシリンジ、および 1 つのサンプルセルで構成されています。プロトコルのさまざまなステップに対応するフロー図を 図2に示します。所望の量の2つの異なるサンプルをミキサーおよびサンプルセルに注入する(図2A)。サンプルセルが充填されると、インレットスイッチバルブ(ISV)とアウトレットスイッチバルブ(OSV)を閉じて、サンプルセルをダイナミックミキサーから隔離し、TR-SANSデータ収集中にサンプルがセルに逆拡散するのを防ぎます(図2B)。ダイナミックミキサーの前は、接続チューブの長さは10cmから1mまで変化し、混合遅延時間には影響しません。ただし、ダイナミックミキサーとサンプルセル間のチューブ接続は、混合遅延時間と必要なサンプル注入量に影響します。ダイナミックミキサー、ミキサーセレクターバルブ(MSV1およびMSV2)、およびISVおよびOSVを接続するために、内径0.04インチ(1 mm)、長さ100 mmのプレカットステンレス鋼チューブが使用されます。内径1mm、長さ115mmのフッ素系チューブを使用して、ISVとOSV(またはダイナミックミキサー出口)をサンプルセルに接続します。混合遅延時間に影響を与える総ボイド容量には、ミキサーのボイド容量(0.15 mL)、ミキサー出口とサンプルセル入口の間のチューブ(0.09 mL)、およびサンプルセル容量(0.16 mL)が含まれます。この例では、総空隙容積は0.4mLである。バルブの内部ボイドボリュームは、チューブ、ミキサー、およびサンプルセルのボイドボリュームと比較してごくわずかです。例えば、採用された低圧セレクターバルブ(ボア径0.75mm)のボイド体積は約4μL、高圧セレクターバルブとスイッチバルブ(ボア径0.25mm)のボイド体積は約0.5μLです。

TR-SANS測定が完了したら、サンプルを溶媒とともにセルから押し出し、リンス溶媒をセルに繰り返しポンプで送り込んで、残留サンプルを除去し、サンプルセルを洗浄します(図2C)。リンスシリンジは、ポンプセレクター値を介してより大きな溶媒リザーバー(水やエタノールなど)に接続され、測定の実行間でサンプルセルを洗浄するのに十分な溶媒量を確保します。可燃性液体を含む溶媒源、サンプル源、および混合サンプル容器は、考えられるすべての発火源を排除するために、電気機器のない別のエンクロージャに配置されます。さらに、可燃性蒸気と溶剤の蒸発を最小限に抑えるために、ベーパーロックボトルキャップが使用されます。最後に、サンプルセルを窒素ガス流で乾燥させて、残留すすぎ溶媒を除去します(図2D)。ミキサーセレクターバルブへの入口窒素ガス圧力は、窒素ガスボンベにある手動圧力調整器を使用して、約2バール(0.2MPa、ゲージ圧)に調整されます。サンプルセルが十分に洗浄および乾燥されると、新しく混合されたサンプルが次の測定サイクルのためにサンプルセルに注入されます(図 2Aのフロー図に示されている混合と注入を繰り返します)。

図2:1つのサンプルセル、2つのサンプル混合、および洗浄用の2つのリンス溶媒を使用したフロー図の例。 (a)サンプルA(青)とサンプルB(赤)を混合し、混合したサンプル(紫)をサンプルセルに流します。(B)データ収集中、ISVおよびOSVスイッチバルブが閉じてサンプルセルを分離し、データ収集中のサンプルの逆拡散を防止する停止フローデバイス状態。(C)データ収集後にサンプルセルをSS1(緑色)からのリンス溶剤ですすぐ洗浄ステップ。(d)試料セルを窒素ガス(オレンジ色)で乾燥する乾燥工程。略語:PSV =ポンプセレクターバルブ。MSV =ミキサーセレクターバルブ;OSV =アウトレットスイッチバルブ;ISV = インレットスイッチバルブ;SS1 = 溶媒源 1;SSA = サンプル ソース A;N2 =窒素ガス源。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3は、混合セットアップが同じスイッチバルブに接続された2つの別々のサンプルセルで構成されている場合の、わずかに異なるバージョンのフロー図を示しています(図3A)。TR-SANSデータがサンプルセル1に収集されている間、サンプルセル2はすすぎ(図3B)、乾燥されます(図3C)。サンプルセル1のデータ収集が完了すると、インレットスイッチバルブは、データ収集のために新しく混合されたサンプルをサンプルセル2に導きます(図3D)。TR-SANSデータがサンプルセル2に収集されている間、サンプルセル1はすすぎおよび乾燥されます(図3E)。2つのサンプルセル間のこの交互の並列プロセスは、後続のサンプル注入間の時間を最小限に抑え、中性子ビームの使用時間を最大化します。

図3:2つのサンプルセル、2つのサンプルの混合、および洗浄用の2つのリンス溶媒を使用したフロー図の例。 (A)サンプルA(青)とサンプルB(赤)を混合し、混合サンプル(紫)をサンプルセル1に流します。(b)試料セル2がSS1からの溶媒ですすがれている間の試料セル1上のデータ収集中の停止流動装置状態(緑色)。(c)試料セル2を窒素ガスで乾燥させている間の試料セル1でのデータ収集中の停止流動装置状態(オレンジ色)。(d)サンプルセル1のデータ収集が完了すると、すぐに新しいサンプル(紫色)が混合され、サンプルセル2に流入されます。(e)試料セル1がSS1からの溶媒ですすがれている間の試料セル2でのデータ収集中の停止流動装置状態(緑色)。一方のサンプルセルが測定されている間、もう一方のサンプルセルは洗浄および乾燥されています。ストップフロー測定プロセスは、2つのサンプルセル間で交互に行われ、後続のサンプル混合注入間の時間を最小限に抑えます。略語:PSV =ポンプセレクターバルブ。MSV =ミキサーセレクターバルブ;OSV =アウトレットスイッチバルブ;ISV = インレットスイッチバルブ;SS1 = 溶媒源 1;SSA = サンプル ソース A;N2 =窒素ガス源。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ポンプとチューブラインの接続、システムのプライミング、サンプルセルのすすぎと乾燥、混合サンプルの注入に関する段階的なプロトコルを以下に説明します。シンプルにするためにシングルセル構成が示されていますが(図2)、柔軟なモジュラーセットアップ、プロトコル、およびスクリプトを簡単に変更して、図3に示す2サンプルセル構成など、より多くのシリンジポンプ、バルブ、ミキサー、またはサンプルセル構成を実装することができます。混合および洗浄注入サイクル全体で収集された代表的な生中性子計数率データを図4に示し、3つの異なる温度で測定された脂質交換速度論および交換された脂質の割合に対応する抽出された正規化散乱強度をそれぞれ図5および図6に示す。

Protocol

1. ストップフローシステムをセットアップして開始します。

1. 電源スイッチを使用して、すべてのポンプ電源とダイナミックミキサーの電源を入れます。
2. 停止流システム制御グラフィカル・ユーザー・インターフェース (GUI) ですべてのポンプとバルブを開始するには、デバイス構成パスを入力し、コマンド bus=qmixbus を使用します。Bus(), bus.open(), bus.start(), pump=qmixpump.Pump()、pump.enable()、および valve=ViciMultiposSelector() (オンラインオープンソースリポジトリで利用可能な開始コードの例を参照⁶⁴)。
3. シリンジを取り付ける前に、コマンド pump.calibrate() を使用してポンプを校正します。
4. バルブが開始されたことを確認し、コマンド valve.setPort() および valve.getPort() を使用して、コマンドで正しいセレクタポートに移動します。
5. コマンド pump.set_syringe_param(A、B)を使用して、各ポンプに使用するシリンジタイプを割り当てます( A はシリンジバレルの内径(mm)、 B はシリンジの最大ピストンストローク距離(mm)。
6. サンプルシリンジをシリンジポンプに接続します。
   1. ポンプが校正されていることを確認したら、きれいなシリンジバレルをポンプ上部の接続部(シリンジマウントヘッド)にねじ込みます。
   2. ガラスシリンジを使用する場合は、シリンジピストンからの過度の力によってガラスシリンジが壊れないように、充填量を分注する前にシリンジマウントヘッドが緩んでいることを確認してください。
   3. シリンジピストンをポンプの下部にある接続部(シリンジマウントテール)にねじ込みます。
   4. シリンジバレルとシリンジピストンをポンプに接続した後、シリンジピストンをシリンジバレルの上部に移動するコマンド pump.empty()を使用してシリンジタイプの充填量をディスペンスします。
   5. ガラスシリンジを使用する場合は、ピストンの動きが止まった後にシリンジマウントヘッドを締めてください。
7. チューブをサンプルおよび溶媒源、シリンジ、バルブ、ミキサー、サンプルセル、および混合サンプル容器に接続します。
   1. シリンジポンプチューブをポンプセレクターバルブに接続します。
   2. ポンプセレクターバルブチューブをサンプルソースに接続します。
   3. ポンプセレクターバルブチューブをすすぎ溶剤源に接続します。
   4. ポンプセレクターバルブチューブをミキサーセレクターバルブチューブに接続します。
   5. ミキサーセレクターバルブチューブを窒素ガス源に接続します。
   6. ミキサーセレクターバルブチューブをミキサーインレットに接続します。
   7. ミキサー出口をインレットスイッチバルブに接続します。
   8. インレットスイッチバルブをサンプルセルインレットに接続します。
   9. サンプルセルの出口を出口スイッチバルブに接続します。
   10. 出口スイッチバルブを混合サンプル容器に接続します。
8. 各バルブに対して行われる対応するポート番号接続を入力して、ストップフローシステム制御GUIで作成されたすべてのチューブおよびバルブ接続を定義します(ステップ1.7)。
9. ミキサー入口とサンプルセル出口の間のチューブのボイド体積を計算し、各測定でサンプルセルを充填するために必要なサンプルの最小量を定義します。

2. サンプルをロードします。

1. 所望の数値を入力して、ストップフローシステム制御GUIで所望のサンプル充填量および溶媒充填量を設定する(オンラインオープンソースリポジトリ⁶⁴の制御コード例を参照)。
2. pump.aspirate() コマンドを使用して、目的のサンプルと溶媒の量をソースからポンプセレクターバルブを介してサンプルシリンジに引き込みます(吸引します)。
   注意: 空のシリンジを最初にロードするときは、シリンジの上部に空気が存在し、手順3でサンプルと溶媒でシステムをプライミングするためにパージする必要があります。

3.システムを準備します。

1. pump.dispense() コマンドを使用して、シリンジ、チューブライン、およびバルブからすべての空気を押し出す (ディスペンスする) 。シリンジ、チューブ、およびバルブからすべての空気を完全に除去するために、各シリンジから十分な量の液体が分注されていることを確認します。チューブ内に気泡が見える場合は、気泡が除去されるまで溶媒またはサンプルの分注を続けます。
2. システムから空気がパージされたら、少なくとも1つのサンプル注入およびすすぎ手順を実行します(中性子散乱データは収集されません)。
   1. コントロール GUI で [ 混合実験の開始 ] というラベルの付いたセルをクリックして選択します。
   2. このセルをアクティブに選択した状態で、コントロール GUI の上部にある [実行 ] ボタン (右三角形) をクリックするか、キーボードの Shift キーと Enter キーを同時に押します。
   3. サンプルセルを目視検査して、気泡がないことを確認します。
      1. 気泡が存在する場合は、プロトコル手順3.1と3.2を繰り返して、チューブラインからさらに空気をパージします。
      2. サンプルセルに気泡が存在しない場合は、ステップ4に進み、残りの実験プロトコルステップを定義します。

4.プログラムスクリプトでストップフローミキシングプロトコルを定義します(オンラインオープンソースリポジトリ⁶⁴のコード例を参照)。

1. ストップフロー装置を囲む断熱エンクロージャの温度を制御するプログラマブルエアコン(AC)ユニットの温度設定値を入力します。
   1. ACコントロールユニットのスターボタンを押しながら、上下の矢印を押して設定温度を変更します。または、制御GUIに希望の温度設定値を入力し、[実行]をクリックします。
   2. 運動実験を開始する前に、エンクロージャーの内部が目的の温度で平衡化するために15〜30分待ちます。
      注意: アクセス可能な温度範囲は現在10°Cから50°Cの間であり、温度安定性は1°C±です。
2. 制御GUIに適切な量、流量、時間、および繰り返し回数を入力して、すべてのすすぎシーケンスステップを入力します。
   1. 注入する各サンプルの体積を定義し、総流量(Q)を定義します。
   2. すすぎ手順中に注入される各溶媒の量を定義します。
   3. 各すすぎサブステップ間の乾燥時間(_tdry)を定義します。
   4. すすぎサブステップの数を定義します。
   5. 後続のすすぎステップのさまざまな溶剤を定義します。
   6. 各測定(n_リンス)の後に実行するすすぎの繰り返し回数を定義します。
   7. サンプルセルとミキサーを完全に乾燥させる時間を定義し、その後のサンプル注入のためにきれいなサンプルセルを提供します(t_{dry_final})。
3. ストップフローシステム制御GUIに適切な量、流量、時間を入力して、すべてのサンプル注入シーケンスステップを定義します。
   1. 注入する各サンプルの量と流量を定義します。
   2. ボイド体積(V_ボイド)と総流量(t_遅延 = V_ボイド/ Q)から遅延時間(t_遅延)を計算します。
      注意: 遅延時間は、サンプルセルに混合サンプルを充填するのに必要な時間です。
   3. TR−SANSデータの所望の取得時間を、対象の運動過程全体が発生するように定義する(t_scatt)。
   4. 散乱実験の終了からすすぎサイクルの開始までの待機時間を設定します(t_wait)。
      注意: サンプル中性子透過率をセルからすすぐ前に測定する場合は、この待機時間を少なくとも100秒にする必要があります。サンプル送信は、データを絶対強度まで下げるためにデータ処理中に必要です。
   5. ステップ 4.2 (n サイクル) で定義された各注入の間に実行されるすすぎシーケンスで実行する注入_サイクル数を定義します。
4. 式 (1) を使用して、1 回のストップフローデータ収集サイクル (t_サイクル) の合計時間を計算します。
   t_サイクル = n_すすぎ× (t 遅延 + t_乾燥) + t_{dry_final} + t_遅延 + t_{スキャット} (1)
   ここで、n_リンス =すすぎの繰り返し回数(ステップ4.2.6)。t_delay =停止したフローデバイスの遅延時間(ステップ4.3.2)。t_dry =各すすぎサブステップ間の乾燥時間(ステップ4.2.3);t_{dry_final} =サンプルセルとミキサーを完全に乾燥させる時間(ステップ4.2.7);t_scatt = 必要なTR-SANSデータ取得時間(ステップ4.3.3)

5. SANS機器制御GUIで小角中性子散乱パラメータを定義します。

1. 各サンプルの長さスケールと対象q範囲を決定します。
2. 目的のq範囲をカバーしながら、サンプルの中性子束を最大化するように装置の構成を定義します。
3. SANS計測器制御GUIでVSANSデータの合計アクイジション時間を、ステップ4.4で計算されたサイクルタイムに設定します(中性子散乱データアクイジション時間=t_サイクル)。
4. SANS機器制御GUIでサンプル送信測定時間を100秒に設定します。
5. SANS 計測器制御 GUI を使用して、コマンドラインに 「イベントモードデータの生成 」と入力して、イベントモードのデータ収集をオンにします。

6. TR-SANSデータを処理するためのストップフロー実験を開始する前に、データ削減のための標準散乱測定値を収集します。

1. バックグラウンド散乱を測定します。
   1. ローカル計器シャッターが閉じていることを確認します。
   2. ブロックされたビームサンプルをサンプル開口部の背面に取り付け、ローカル機器環境を固定し、ローカル機器シャッターを開きます。
   3. ソフトウェアでブロックビーム散乱データ取得時間を定義し、ブロックビーム散乱データを収集し、最長散乱データ取得時間(t_scatt)と同じ期間カウントします。
   4. データ収集が完了したら、機器のシャッターを閉じ、ブロックされたビームサンプルをサンプルアパーチャから取り除きます。
2. 空の細胞の散乱を測定します。
   1. サンプルセルが完全にすすぎ、乾燥されていることを確認してください。
   2. ローカル計器シャッターを開きます。
   3. 空のセル透過率測定値を100秒間収集します。
   4. 空細胞散乱測定値を収集し、少なくとも最長取得時間(_tscatt)についてカウントする。

7. ストップフロー実験を開始します。

1. イベント モードで VSANS 散乱データ収集を開始します。
   1. ローカル計器エリアが安全であることを確認してから、ローカル計器ビームシャッターを開きます。
   2. 計測器コンピュータのSANS計測器制御ソフトウェアを使用して、目的の実行を計測器キューにドラッグアンドドロップして、SANSデータ収集を開始します。
      注意: 最も早い時点を確実に測定するには、ストップフロー混合実験を開始する前にデータ収集を開始してください。データは、遅延時間(t_遅延)を考慮して、後のステップで後処理されます。
2. 制御GUIでストップフロー混合実験を開始します。
   1. 停止フロー システム制御 GUI で [ 混合実験の開始 ] というラベルの付いたノートブック セルを選択します。
   2. このセルをアクティブに選択した状態で、ストップフローデバイス制御プログラムの上部にある [実行 ]ボタン(右三角形)をクリックするか、キーボードの Shiftキー と Enter キーを同時に押します。
   3. セクション4で定義されたストップフロー混合プロトコルが動作を開始したことを確認します。
   4. 散乱実行後、SANS計測器制御GUIを使用して100秒の伝送測定をVSANS計測器キューに追加します。
   5. SANS計測器制御GUIで、残りのストップフロー混合サイクル(n_サイクル -1、ステップ4.3.5)ごとに、1つの散乱測定実行と1つの送信測定実行を機器キューに追加します。

8.データを処理および削減して、すべての背景を削除し、検出器の感度を修正し、サンプルの透過を修正します。

1. サーバーから散乱データ ファイルと関連するイベント ファイルをダウンロードします。
   注:各VSANS測定後に個別のディテクタイベントファイルが生成され、アクティブなディテクタキャリッジ(フロント、ミドル、バックディテクタなど)ごとに1つのイベントファイルが生成されます。
2. コマンド events=Rebin(ファイル名) の後にコマンド events.do_rebinning(timebins) が続くコマンドを使用して、散乱データを目的のタイムビンにビンに入れます。入力ファイル名は目的の SAN データ ファイルの名前に対応し、タイムビンは目的のタイム ビン境界のリスト (秒単位) です。
   注:入力タイムビンがリストではなく単一の数値として入力された場合、データは等しい時間幅のN個のビンにビン化されます(Nは入力タイムビン^です)。
3. ビームライン⁶⁵に備えたソフトウェアを用いてビニング散乱データを低減する。

9. TR-SANSデータを分析します。

1. 式(2)を用いて測定時間から対象とする処理時間(t_処理)を算出する。
   t_プロセス = t_i - t_停止 + t_遅延 (2)
   ここで、tiは流れが停止した後に開始する測定時間ビンであり、_tstopは流れが停止した直後の測定時間_{であり、t}遅延は_遅延時間である。
2. ステップ8.2で定義された時間ビンとステップ9.1で計算されたtプロセスを使用して、q依存強度I(q)を_プロセス時間の関数としてプロットします。
   注: アクセス可能な最も早いプロセス時間は、t_delay によって制限されます。以前のプロセス時間ポイントを測定するには、総流量(Q)を増やすか、総ボイド体積(V_ボイド)を減らします。
3. プロセス時間の関数としてのI(q)の変化から関心のある運動パラメータを抽出します。

10. 実験を終了します。

1. ローカル機器のシャッターを閉じて、中性子ビームをオフにします。
2. ビームラインから備え付けの放射線モニターを用いて放射線チェックを行い、部品やチューブを外したり、サンプルや混合サンプル容器を取り出したりしてください。
3. シリンジ、チューブ、および混合サンプル容器を保健物理学部門に移します。
4. 保健物理学フォームに記入し、保健物理学担当者による評価を待ちます。

Results

ここに示す代表的な中性子データは、交換速度_(ke)^66,67で小胞間の脂質交換を触媒する添加剤であるメチル-β-シクロデキストリン(mβCD)の存在下での脂質交換速度を測定します。以前の蛍光研究では_、keがmβCD濃度に依存し、交換プロセスの半減期が⁶⁸分のオーダーであることが示されています。本実験では、ストップフローTR-SANSを用いて、mβCD触媒による小胞間の脂質交換を秒単位の時間スケールで測定する。2つの同位体的に異なる脂質小胞集団を調製した。一方の小胞集団は尾部水素化ジミリストイルホスファチジルコリン(DMPC)脂質(図5のH脂質小胞)で調製し、もう1つの小胞集団は尾重水素化DMPC(DMPC-d54)脂質(図5のD-脂質小胞)で調製しました。荷電ジミリソチルホスファチジルグリエルコール(DMPG)脂...

Discussion

現在の手順では、混合装置とストップフローTR-SANS測定を実行する手順について説明します。デバイスとプロトコルは、対象の時間スケールが≈1秒から5分の低粘度液体サンプル用に最適化されています。5分を超える時間スケールの場合、サンプルを手動で混合して標準的な散乱セルにロードすることは、特に高粘度のサンプル、ゲル、またはペーストの場合、より簡単で望ましい場合があります。1秒未満の時間スケールにアクセスするには、遅延時間を短縮するために、別の混合装置、より低い総ボイド体積、およびより高い総流量が必要です。また、これらの短い時間スケールで速度論的プロセスを研究するには、TR-SANSを使用してミリ秒の時間スケールで十分な散乱カウント統計を蓄積するために、サンプル注入を繰り返す必要があることに注意することも重要です。総サンプル量が限られている場合は、光またはX線散乱で十分な散乱コントラストが存在すると仮定して、より少ないサンプル注入またはより少ないサンプル注入を必要とする光散乱またはX線散乱などのより高いフラックス技術を使用することが望ましい場合があります。

このモジュール式のストップフロ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ダイナミックミキサー	分析科学機器	462-0150A	磁気結合ローター、バイナリダイナミックミキサーアセンブリ(三元系タイプが利用可能)、0.15 mLのデッドボリューム(より大きなデッドボリュームが利用可能)
フッ素樹脂チューブ	IDEX Health &科学	1507L	PFAチューブナチュラル1/16インチODx0.040インチIDx50フィート
フッ素樹脂1/4-28フランジレス継手	IDEX健康&科学	XP-245	PFA フランジレス継手、フェルール付き、1/4-28 ねじ切り、1/16 インチ OD チューブ
ガラスシリンジ	ハミルトン カンパニー	81660	ハミルトン 1000 シリーズ シリンジ、10 mL (81660)、モデル 1010 C シアー、1/4"-28 ねじ端子、その他の容量が利用可能
高圧フロー セレクター バルブ	Vici Valco	C85X-1570EUTB	Vici 10ポジションセレクターバルブ、最大15000 psi、内径0.25 mm、外径1/16インチチューブ、10-32コーンネジポート、USBユニバーサルアクチュエータ
スイッチバルブ	Vici Valco	C82X-1574EUHB	Vici 4ポートスイッチバルブ、最大15000 psi、内径0.25 mm、外径1/16インチチューブ、10-32コーンネジポート、USBユニバーサルアクチュエータ
高圧シリンジ	Cetoni	A2019000358	3 mL ステンレス製シリンジ、最大 510 bar、最大流量 21 mL/分
低圧フロー セレクター バルブ	Vici Valco	C25-3180EUHB	Vici 10 ポジション セレクター バルブ、最大 250 psi 液体、0.75 mm ボア、外径 1/16 インチ チューブ、1/4-28 ネジ式ポート、USB ユニバーサル アクチュエータ
neMESYS 高圧シリンジ ポンプ	Cetoni	A3921000103	Max force 2600 N
neMESYS 中圧シリンジ	Cetoni	A3921000131	最大力 1000 N
電源	Cetoni	A3921000127	Base 600、最大4台の高圧ポンプに電力を供給
クォーツフロースルーサンプルセル	Starna Scientific	3-2.30-Q-1/TC	クォーツマイクロフローセル、光路長2mm(1mm利用可能)、2mm×2mm×30mm 内寸
クォーツ窓	テクニカルガラス製品	NA	GE 124クリアフューズドクォーツ研磨プレート、11.75インチ×23.75インチ×0.375インチ厚
ステンレス鋼10-32コーン圧縮継手	IDEX健康&科学	U-321X、U-320X	316ステンレス鋼フェルール(U-321X)およびナット(U-320X)-バルコタイプ、10-32コーン、1/16インチODステンレス鋼管用
ステンレス鋼管	IDEX健康&Science	U-102	ステンレス鋼チューブ 1/16インチ OD x 0.020インチ ID、10 cm、さまざまなプレカット長が利用可能
シリンジポンプ制御ソフトウェア	Cetoni	T6000000004	nemesysポンプ用QmixElementsソフトウェア、QmixSDKソフトウェア開発キット
熱電エアコン	EIC Solutions	AAC-140C-4XT-HC	ポンプ、バルブ、ミキサー、およびサンプル温度を制御するために断熱エンクロージャに取り付けられた熱電エアコン
Tスロット手すり	McMaster-Carr	47065T103	アルミニウム t スロット手すり (1.5 インチ x 1.5 インチ) さまざまな長さにカット
蒸気ロック ボトル キャップ	コールパー	マーEW-12018-02	4つの304 SSポートインサート、1/4 "-28スレッド、GL45ボトルキャップサイズ、PTFEボディ、SSスレッド、PPカラー