このプロトコルは、灌流、脳切片、自由浮遊免疫染色、組織実装、イメージングを含むマウス脳組織学的研究のための効率的で再現可能なアプローチを記述する。
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この記事について
サマリー
要約
マウス脳の免疫構造化学的染色は、エネルギー代謝やその他の神経生物学的プロセスの調節の基礎となる中心的なメカニズムを調査するために神経科学で一般的に使用される日常的な技術です。しかし、脳組織学の結果の質、信頼性、再現性は、実験室によって異なる場合があります。染色実験ごとに、種、組織、標的タンパク質、試薬の作業条件の違いに基づいて重要な手順を最適化する必要があります。本論文では、大動脈灌流、脳切除、自由浮遊免疫染色、組織実装、イメージングなど、この分野の研究者が容易に追跡できる信頼性の高いワークフローを詳細に示す。
また、研究者の個々のニーズを満たすためにこれらの手順を変更する方法についても説明します。このプロトコルの信頼性と効率を説明するために、ペリニューロンネットは、マウス脳内の抗AVP抗体を有するビオチン標識藤フラルブダ凝集(WFA)およびアルギニンバソプレシン(AVP)で染色された。最後に、手順全体の重要な詳細が取り上げられており、このプロトコルの利点は他のプロトコルのそれと比較されます。本論文は、マウス脳組織の自由浮遊免疫染色に最適化されたプロトコルを提示する。このプロトコルに従うと、このプロセスは、ジュニアと上級の両方の科学者が免疫染色研究の品質、信頼性、および再現性を向上させることが容易になります。
概要
肥満とそれに伴う併存疾患の有病率は流行レベルに達し、社会経済的負担が大きい1,2を引き起こしている。肥満の原因となる生物学的プロセスをより深く理解するために、様々なマウスモデルが開発されました3,4。これらの動物モデルにおけるエネルギー恒常性の調節には中心的なメカニズムが重要であるため、マウス脳の神経解剖学的研究はこの分野で必要な技術となっています。しかし、脳組織学の技術の品質、信頼性、再現性は、様々な理由(例えば、抗体、組織、治療、種、研究目的)のために、同じ研究室内の研究室や研究者によってかなり異なります。したがって、灌流、脳切片、自由浮遊免疫染色、組織実装、イメージングなど、マウス脳の組織学的研究のための一般的なプロトコルを確立する必要があります。一方、初心者は、迅速に学び、マスターし、個々のニーズを満たすために、このプロトコルを調整することができます。
免疫組織化学的染色は、様々な組織(例えば、脳および末梢組織)における特定の細胞タイプ、mRNA、およびタンパク質を可視化するために広く使用されてきた確立された方法である5,6
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プロトコル
両性のC57BL/6Jマウス(8〜16週齢)を本研究で使用した。すべての動物のケアとすべての手順は、ベイラー医科大学の制度的動物ケアと使用委員会によって承認されました。
1. 灌流
注:ステップ 1.1-1.6 はヒュームフードで行われます。
- 麻酔
- 5 mL のイオブルラン( 材料表参照)を、デシケータの底に置いたペーパータオルに注ぎます。デシケータの内側に穴があいたバリアにマウスを導入し、呼吸の兆候が消えるまで待ちます。
注: 呼吸なしで、マウスは短時間の心拍を持ち、心拍が消失する前に、それが浸透します。 - 先に進む前に、つま先ピンチに反射がないことを確認してください。
- 各足を通してピンを駆動することにより、泡板にマウスを固定します。泡板が液体の波及を集めるために皿に置かれていることを確認して下ろします。
- 5 mL のイオブルラン( 材料表参照)を、デシケータの底に置いたペーパータオルに注ぎます。デシケータの内側に穴があいたバリアにマウスを導入し、呼吸の兆候が消えるまで待ちます。
- 心をさらけ出す
- 胸郭と腹部の上に正中線に沿って縦方向の表面的な切開を行い、胸部と腹部の筋肉壁を露出させるために皮膚を脇に移動します。次に、筋肉層を切開して肝臓と腸を露出させる。最後に、胸郭を開き、心臓と肺を露出させるためにはさみで肋骨ケージをカットします。止血鉗子を使用して胸部を引き離し、作業領域を広げます。....
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結果
このプロトコルのフローチャートを 図 1 に簡単に示します。この研究室の凍結切除手順は、5つの脳サンプルを同時に切り離した 図2Aで実証されています。脳部の取り付けは 図2Bに示され、脳部を備えた完全に取り付けられたスライドを 図2Cに示す。 図3において、ブレグマ-0.82mmでのWFAとAVPの共染色を伴うマウス脳部の代表的な蛍光免疫検査画像が、傍室核および超視核においてAVPシグナルを観察した。WFAシグナルは、視床下部前視床下部および網状核の骨膜領域で観察された。
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ディスカッション
このプロトコルは、灌流、組織切片、自由浮遊免疫染色、組織実装、イメージングを含むマウス脳の神経解剖学的研究のための確立された方法を提供する。ただし、一貫性のある信頼性の高い結果を得るには、いくつかの重要な詳細を最適化する必要があります。
灌流の質は、染色を成功させるために重要です。血液細胞(例えば、赤血球)が人工的な「陽性」染色10を生成できることを考えると、血液が脳に残っている場合、染色結果が影響を受ける可能性があります。我々は、通常、血液を含まない脳をもたらす灌流の高品質を示すために、褐色がかった灰色の肝臓の存在を推測する。このプロトコルで使用される自動灌流ポンプは、短期間で正常に1匹の動物を浸透させるのに役立ちます。不十分な固定は、その後の手順で柔らかく、脆弱な脳切片を生成します, 過剰固定は、タンパク質の強化されたホルムアルデヒド架橋による抗原反応の感受性を低下させます.異なる条件を試験し、マウス脳の後固定には4°Cでの夜間固定で十分であった。固定性緩衝液として本プロトコルで使用される10%のNBFに加えて、PBS中で調製した.......
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開示事項
著者らは開示する利益相反はない。
謝辞
調査官はNIH(K01DK119471からCWへの助成金)によって支えられました。P01DK113954、R01DK115761、R01DK117281、R01DK125480、R01DK120858からYX、USDA/CRIS(51000-064-01SからYX)、および米国心臓協会の博士研究員(LTX)829565
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| Alexa Flour 594ロバ抗ウサギIgG(H + L) | Invitrogen | A21207 | |
| 30%ショ糖 | VWR | 470302 | 30 gのショ糖を100 mLのPBSに分解& |
| nbsp;中性緩衝ホルマリン | VWR | 16004-128 | 10%、25°C、C, pH 6.8-7.2 |
| 1 mL Sub-Q シリンジ | BD | 309597 | |
| 48 ウェル細胞培養プレート | Corning | 3548 | |
| 6 ウェル細胞培養プレート | Corning | 3516 | |
| 退色防止封入剤 DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| オートクレーブプラスチックデシケーター | Thermo Scientific Nalgene | 5315-0150 | |
| AVP抗体 | フェニックスファーマシューティカル | H-065-07 | |
| セルストレーナー | コーニング | 431752 | |
| 凍結保護剤緩衝液 | ユーザープリファレンス | 該当なし | 20%グリセロール、30%エチレングリコール、50%PBS |
| イソフルラン | Covetrus | 11695-6777-2 | |
| ライカDFC310FX顕微鏡 | ライカ | 該当 | |
| 顕微鏡スライドボックス(50箇所) | VWR | PBT該当 | |
| ユーザーの好み | 該当なし | Triton X-100 2.5 mLを1000 mLのPBS | |
| に溶解 灌流 2 自動灌流システム | ライカ | 39471005 | |
| リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 20x | VWR | VWRVE703-1L | 25 °C、pH 7.3-7.5、1x 組成:137 mM NaCl、2.7 mM KCl、9.8 mM リン酸緩衝液 |
| クロトーム Microm HM450 | ThermoFisher | Microm HM450 | |
| 塩化ナトリウム | RICCA Chemical | 7220-32 | 0.9%, 25 °C, pH 7.4 |
| ストレプトアビジンタンパク質, DyLight 488 | ThermoFisher | #21832 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 089k01921 | |
| WFA antibody | Sigma-Aldrich | L1516 | |
| Zeiss Axio Z1 Scanner | Zeiss | 該当なし | |
| Zen 3.1 software | scanner software |
参考文献
- Must, A., et al. The Disease burden associated with overweight and obesity. Journal of the American Medical Association. 282 (16), 1523-1529 (1999).
- Apovian, C. M. Obesity: definition, comorbidities, causes, and burden. The Am....
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再版と許可
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