方法論記事

選択的リボソームプロファイリングによる共翻訳相互作用ネットワークのグローバル同定

DOI：

10.3791/62878

⸱

2021年10月7日

 ,  , 
1Faculty of Biology, Technion - Israel Institute of Technology

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

共翻訳相互作用は、新生鎖修飾、標的化、折り畳み、およびアセンブリ経路において重要な役割を果たします。ここで、選択的リボソームプロファイリング、 in vivo、モデル真核生物 サッカロミセス・セレビシエにおけるこれらの相互作用の直接分析のための方法について説明する。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

近年、リボソームが私たちのmRNAを解読するだけでなく、混雑した細胞環境へのポリペプチド鎖の出現を導くことが明らかになりました。リボソームは、膜標的因子の空間的および速度論的に制御された結合、修飾酵素、および折り畳みシャペロンのためのプラットフォームを提供する。高次オリゴマー複合体への集合、ならびにタンパク質間ネットワーク形成ステップでさえ、合成と協調することが最近発見された。

ここでは、 インビボでの共翻訳相互作用を捕捉するために開発された方法である選択的リボソームプロファイリングについて説明する。リボソーム-新生鎖複合体を共翻訳インタラクターとともに捕捉するために必要なさまざまなアフィニティー精製ステップ、ならびにコドンに近い分解能で共翻訳相互作用を解読するために必要なmRNA抽出、サイズ排除、逆転写、ディープシーケンシング、ビッグデータ解析ステップについて詳述します。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SeレクティブリボソームPロファイリング(SeRP)は、今日まで、共翻訳相互作用をインビボで、直接的に捕捉し、特徴付ける唯一の方法である1、2、3、4、5、6。SeRPは、任意の因子と翻訳リボソームとの相互作用のグローバルプロファイリングをコドン分解能2,7に近い状態で可能にする。

この方法は、増殖する細胞のフラッシュ凍結および活性翻訳の保存に依存している。次いで、細胞溶解物をRNase Iで処理して、「リボソームフットプリント」と呼ばれるリボソーム保護mRNA断片を除く細胞内のすべてのmRNAを消化する。その後、サンプルは 2 つの部分に分割されます。1つの部分は、すべての細胞リボソームフットプリントの単離に直接使用され、細胞内で進行中のすべての翻訳を表す。第2の部分は、例えば修飾酵素、転座因子、折り畳みシャ....

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 選択的リボソームプロファイリングのための菌株の生成

注:SeレクティブリボソームPロファイリング(SeRP)は、リボソーム - 新生鎖複合体との相互作用の様式を評価するために、関心のある因子のアフィニティー精製に依存する方法である。相同組換え9、ならびにCRISPR/Cas910ベースの方法が、関心のある様々な因子をアフィニティー精製のためのタグと融合させるために利用される。このようなタグは、GFP、GFP−trapアフィニティー精製のための、TAP−タグ、アビジンまたはストレプトアビジンによって精製されたIgG−セファロースビーズ精製ならびにAVI−Tagのための、近年からのいくつかの成功例を列挙する。

  1. 成長アッセイまたは機能アッセイを実行して、タグ付けがタンパク質の機能に影響を与えなかったことを検証します。N' 端末と C' 端末のタグ付けは評価する必要があります。
    注:リボソーム(rRNA)は、様々な要因における多くのリボソーム結合ドメインと同様に、高度に荷電しており、誤った発見または結合モードの変更につながる可能性があるため、高度に荷電したタグ(ポリヒスチジンなど)を使用することは好ましくない。

2. 文化の成長

  1. ....

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコールのフローチャート(図1)に例示されるように、細胞を対数期まで増殖させ、次いで濾過によって迅速に回収し、極低温粉砕によって溶解した。次に、ライセートを2つに分けました:1つはリボソームで保護されたmRNAフットプリント用、もう1つは選択されたリボソーム保護mRNAフットプリント用で、アフィニティー精製を実施してタグ付きタンパク質-リボソーム-新生鎖複合体をプルダウンしました。 図2に見られるように、タグ付きタンパク質発現とウェスタンブロット分析によるプルダウンの成功を確認しました。リボソームで保護されたフットプリント(通常20~45 ntの長さ)の単離を、スモールRNA電気泳動(2100 BioAnalyzerシステム)によって検証し、システムマニュアルに従ってサイズ検出の5~10 ntシフトを可能にしました(図3)。次に、ディープシーケンシングとビッグデータ解析のためのcDNAライブラリを生成しました。cDNAライブラリの生成中は、アンダーサイ.......

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここで、プロトコルは、コドン分解能に近い共翻訳相互作用を捕捉するための選択的リボソームプロファイリングアプローチを詳述する。リボソームが混雑した細胞質への新生鎖出現を調整するためのハブとして上昇するにつれて、これは機能的なプロテオームを確保するために必要な様々な共翻訳相互作用を同定し、特徴付けるために、そして様々な疾患を研究するための重要な方法である。今日まで、SeRPは、インビボで、直接的に、これらの相互作用を捕捉し、特徴付けることができる唯一の方法である14、15、16。

最初の最も重要なステップは、細胞の収集と溶解です。数秒以内に、フラッシュフリーズに続いて凍結状態で溶解することによって、進行中の翻訳をキャプチャすることが不可欠です。細胞収集は、リボソーム流出を回避し、急速に起こり得るストレス翻訳応答を誘導するために、急いで行わなければならない。第2の重要な工程は、アフィニ.......

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らは利益相反がないと宣言しています。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

実りある議論をしてくれた研究室のメンバー全員と、原稿を批判的に読んでくれたムハンマド・マフズミーに感謝します。この研究は、ISF(イスラエル科学財団)助成金2106/20によって資金提供されました。

....

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
3'-リン酸化 28 nt RNA 制御オリゴヌクレオチドIDTカスタムオーダーRNase フリー HPLC 精製; 5'-AUGUAGUCGGAGUCGAGGCGC
GACGCGA/3Phos/-3'Absolute
ethanolVWR20821
酸性フェノール–クロロホルムアンビオンAM9722
抗体:マウスモンクローナル抗HAメルク1158381600112CA5
アプロチニンロスA162.3
ATP*NEBP0756S10 mM
バクト寒天BD214030
バクトペプトンBD211820
バクトトリプトンBD
バクト酵母抽出物BD212720
ベスタチン塩酸塩Roth2937.2
クロロホルムメルク102445
CircLigase II ssDNA Ligase*震源地CL9025K100 U/μL
Colloidal Coomassie 染色液Roth4829
cOmplete, EDTA-free protease inhibitor カクテル錠Roche Diagnostics29384100
CycloheximideBiological IndustriesA0879
DEPC 処理済み滅菌ろ過水*Sigma95284
D-Glucose anhydrousMerckG5767-500G
ジエチルピロカーボネートRothK028
ジメチルスルホキシド*Sigma-Aldrich276855
DNA ラダー、10 bp O'RangeRuler*サーモフィッシャーサイエンティフィックSM1313
DNA ローディング色素*サーモフィッシャーサイエンティフィックR06316×
DNase I、組換えRoche4716728001RNAse
フリーdNTP溶液セット*NEBN0446S
EDTA *Roth8043
セロールVWR24388.260。
グリシン溶液Sigma-Aldrich67419-1ML-F1 M
GlycoBlueAmbionAM951615 mg/mL
HEPESRothHN78.3
HF Phusion ポリメラーゼ*NEBM0530L
HK S. cerevisiaeSigma-AldrichH6380-1.5KU
塩酸AppliChemA1305
イソプロパノールSigma-Aldrich33539
イソプロピル β-D-1-チオガラクトピラノシドRothCN08
KanamycinRothT832.4
KClRoth6781.1
KH2PO4Roth3904.1
ロイペプチンロスCN33.4
リンカー L(rt)IDTカスタムオーダー
液体窒素
MgCl2RothKK36.3
Na2HPO4RothP030.2
Na2HPO4·2H2ORothT879.3
NaCl*InvitrogenAM976065 M
NaH2PO4·H2ORothK300.2
NHS活性化セファロース4高速フロービーズGE Life Sciences17090601
Nonidet P 40 substituteSigma74385
Pepstatin ARoth2936.2
Phenylmethyl sulfonyl fluorideRoth6367
プレキャストゲルBio-Rad567103410% および 12%
RNase IAmbionAM2294
SDS、20%AmbionAM9820RNase フリー
酢酸ナトリウム*AmbionAM97403 M、pH 5.5
アジ化ナトリウムメルクS8032-100G
塩化ナトリウムRoth 9265
水酸化ナトリウム*SigmaS27701 N
スクロースSigma-Aldrich16104
SUPERase-In RNase 阻害剤AmbionAM2694
Superscript III Reverse Transciptase*Invitrogen18080-044
SYBR Gold*InvitrogenS11494
T4 ポリヌクレオチドキナーゼ*NEBM0201L
T4 RNA リガーゼ 2*NEBM0242L
TBEポリアクリルアミドゲル*NovexEC6215BOX8%
TBE–尿素ポリアクリルアミドゲル*NovexEC68752BOX10%
TBE–尿素ポリアクリルアミドゲル*NovexEC6885BOX15%
TBE–尿素サンプルバッファー*NovexLC68762×
トリス・ロス4855
トリス*アンビオンAM98511 M、pH 7.0
トリス*アンビオンAM98561 M、pH 8.0
ウルトラピュア 10×TBEバッファー*Invitrogen15581-044
* - ライブラリー調製
ガスケットおよびスプリングクランプ用、90 mm、ミリポア 
グランドジョイントフラスコ1L、ミリポアXX1504705
211699グリXX1009020

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Oh, E., et al. Selective ribosome profiling reveals the cotranslational chaperone action of trigger factor in vivo. Cell. 147 (6), 1295-1308 (2011).
  2. Shiber, A., et al. Cotranslational assembly of protein complexes in eukaryo....

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

このJoVE記事のテキストまたは図の再利用許可をリクエスト

許可をリクエスト

タグ

RNASaccharomyces cerevisiae

関連記事