蛍光活性化細胞選別 - 放射性リガンド処理組織(FACS-RTT)は、アルツハイマー病における18 kDaトランスロケータータンパク質またはセロトニン5HT2A受容体発現の役割を細胞規模で研究するための強力なツールです。このプロトコールは、TgF344−ADラットモデルにおけるFACS−RTTの エクスビボ 適用を記載する。
このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。
この記事について
サマリー
要約
グリア細胞は、おそらくアルツハイマー病(AD)などの神経変性疾患の病態生理学においてかなりの意味を持つ。それらの変化は、おそらく炎症誘発状態と関連している。TgF344-ADラット株は、アミロイドタンパク質Aβ-40およびAβ-42をコードするヒトAPPおよびヒトPS1ΔE9 遺伝子を発現するように設計されており、加齢に伴うアミロイド病態および認知障害を示す。本研究では、TgF344-ADラットモデルを用いて、18kDaのトランスロケータータンパク質(TSPO、グリア細胞活性化のマーカー)結合の細胞起源、およびADにおいて破壊される可能性のある5HT2A受容体(5HT2AR)セロトニン受容体レベルを評価する。ここで紹介する技術は、Radioligand Treated Tissue(FACS-RTT)への蛍光活性化細胞選別であり、 in vivo PETまたはSPECTまたは ex vivo/in vitro オートラジオグラフィー技術を補完する定量的細胞型特異的技術である。画像化の前に使用したのと同じ放射性標識トレーサーを定量し、細胞選別後にサイトメトリーカウンター γを使用する。これにより、高い細胞特異性および感度を有する放射性標識タンパク質の細胞起源を決定することができる。例えば、FACS-RTTを用いた研究では、(i)リポ多糖(LPS)誘発神経炎症のラットモデルにおけるTSPO結合の増加がミクログリアと関連していたこと、(ii)12ヶ月および18ヶ月でのTSPO結合の増加が最初にアストロサイトと関連し、次にTgF344-ADラットにおけるミクログリアが野生型(WT)ラットと比較して、および(iii)5HT2Aの線条体密度に関連していたことが示されました。Rは、同じラットADモデルにおいて18ヶ月でアストロサイトにおいて減少する。興味深いことに、この技術は事実上すべての放射性トレーサーに拡張することができます。
概要
アルツハイマー病(AD)などの神経変性疾患は、症状の増加に伴う神経細胞喪失によって特徴付けられる。認知症の最も一般的な原因であるADは、症例の60%〜70%を占め、世界中で約5,000万人が罹患しています1。神経病理学的レベルでは、ADの2つの主要な特徴は、細胞外アミロイドβ(Aβ)プラークおよび細胞内タウ神経原線維のもつれの蓄積である。グリア細胞の変化はまた、AD2 およびいくつかの神経伝達物質系の可能な破壊と関連している3、4。
TgF344-ADラット株は、ヒトAPPおよびPS1ΔE9導入遺伝子を発現することによってADをモデル化するように改変され、可溶性および不溶性のAβ−40およびAβ−42発現およびアミロイドプラーク形成5をもたらす。それはまた、タウオパチーにつながるタウタンパク質の過剰リン酸化形態の蓄積を提示する。9〜24ヶ月齢から、ラットはADの病理学的特徴および認知障害5,6,7,8,9を徐々に発症する。<....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
プロトコル
すべての実験手順は、ジュネーブ州の人間および動物実験のための倫理委員会、研究倫理のための州委員会(CCER)、およびジュネーブ州の健康の一般的な方向性(スイス)とそれぞれ合意して実施されました。データは、動物研究: 報告インビボ 実験(ARRIVE)ガイドラインに従って報告されます。
1. SPECTカメラの準備とキャリブレーション
- カメラの電源を入れ、オペレーティングソフトウェアをロードします( 材料表を参照)。 ホームXYZステージ ボタンをクリックして、ホーミングを実行します。
- 1 回の 10 分間のスキャン取得で構成される実験を設定します。 ステップ モードを ファイン に設定し、 アクイジション モードを リストモード に設定します(発光スペクトル全体を記録するため)。
- ベッドをセットアップし、温暖化システム、呼吸センサー、および麻酔が機能し、安全であることを確認します(図1A-D)。次に、動物の頭部が配置される場所にファントム(すなわち、既知の濃度の125Iの2mLを2mL....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
結果
WTラットは、片側的LPS注射後に[125I]CLINDE放射性トレーサーによるインビボSPECTスキャンを経験した(図2)。このスキャン(放射性トレーサー注射後45〜60分の画像からの集計データを使用)は、LPS注射部位(図2A)における[125I]CLINDEの結合が脳の対側領域(図2B)よりも高いことを示した。FACS-RTTを受けたエキソビボサンプルは、これらの結果を確認し、ミクログリアにおいてのみより多くの[125I]CLINDE結合部位の存在を明らかにし、脳の同側側における[125I]CLINDEシグナルの細胞起源がミクログリアであることを示した(図3A)15。
次.......
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
ディスカッション
我々の知る限り、この技術は、細胞レベルでの放射性トレーサーのin vivo結合変化のよりよい理解を可能にするアプローチを最初に記述した。このプロトコルは、[125 I]クリンド(TSPO)または[125 I]R91150(5HT 2AR)を例として使用して細胞レベルで放射性トレーサー結合を定量化するマルチスケール法を記載している。
この技術は、LPSによって誘導される強烈な炎症反応からADのラットモデルで観察されるより微妙なグリア細胞変化まで、広範囲のグリア細胞変化の細胞起源を正確に検出するのに十分堅牢で感度が高く、SPECTで得られたシグナルのミクログリア起源として、 in vivo 核神経イメージングに重要な相補的情報をもたらす。この研究はさらに、FACS-RTTが5HT2ARの例を用いて細胞スケールで神経受容体密度の変化を識別することさえできることを示した(図3C)。最後に、ヒトの死後組織におい.......
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
開示事項
著者らは利益相反がないと宣言しています。
謝辞
この研究はスイス国立科学財団(助成金番号320030-184713)の支援を受けた。著者BBTとKCは、Velux Foundation(プロジェクト番号1123)の支援を受けています。著者STはスイス国立科学財団(早期ポスドクモビリティ奨学金、いいえ。P2GEP3_191446)、マックス・クロエッタ教授(臨床医学プラス奨学金)、ジャン・アンド・マドレーヌ・ヴァシュー財団。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 酢酸 | Sigma-Aldrich | ||
| アセトニトリル | Sigma-Aldrich | ||
| BioVet | BioVet | バイタルチェック用ソフトウェア | |
| Bondclone C18 逆相カラム | Phenomenex, Schlieren, Switzerland | ||
| Des-Sur | University Hospital of Geneva | Virucide | |
| Fc Block / anti-CD32 | BD Biosciences | BDB550270 | 反応性 ラット |
| に対する反応性 FITC-標識抗ラット CD90 | Biolegend | 202504 | 反応 |
| ラットに対する反応性 ヘパリン | B. Braun | B01AB01 | |
| HPLC | Knauer | ||
| Insyte-W 24 GA 0.75 IN 0.7 x 19 mm | BD Biosciences | 321312 | 24 G カテーテル |
| イソフルラン | バクスター | ZDG9623 | |
| Lacryvisc | Alcon | 2160699 | |
| LSカラム | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Microporeソフトテープ | 3M | F51DA01 | |
| MILabs-Uspect II | SPECTカメラ用 | MILabs | |
| MoFlo Astrios | Beckman Coulter | 細胞選別機 | |
| ミエリン除去ビーズ II | Miltenyi Biotec | 130-096-733 | ビーズとミエリン除去バッファーが含まれています。 |
| NaCl 0.9% 滅菌溶液 | B. ブラウン | 395202 | |
| 神経解離キット (P) | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | 酵素ミックス、ピペット 1、2、3 が含まれています。 |
| ナイロンメッシュシート | Amazon | CMN-0074-10YD | 40インチ幅、80ミクロンサイズのメッシュ |
| 過酢酸 | Sigma-Aldrich | ||
| QuadroMACS セパレーター | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| R91150 préカーソル | CERMN | ||
| Sep-Pak C18 カラム | Waters | Concentration カラム | |
| ヨウ化ナトリウム Na125 | PerkinElmer | ||
| トリブチリン前駆体 | CERMN | ||
| U-SPECT Rec2.38c | MILabs | バージョン Rec2.38c | SPECT画像再構成用ソフトウェア |
| USPECT II | MILabs | Spect Camera | |
| Wizard 3" | PerkinElmer | ガンマカウンター |
参考文献
- Nichols, E., et al. regional, and national burden of Alzheimer's disease and other dementias, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. The Lancet Neurology. 18 (1), 88-106 (2019).
- Kinney, J. W., et al.
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
再版と許可
