蛍光活性化細胞選別-放射性リガンド処理組織(FACS-RTT)による放射性シグナルの細胞起源の決定

アルツハイマー病(AD)などの神経変性疾患は、症状の増加に伴う神経細胞喪失によって特徴付けられる。認知症の最も一般的な原因であるADは、症例の60%〜70%を占め、世界中で約5,000万人が罹患しています¹。神経病理学的レベルでは、ADの2つの主要な特徴は、細胞外アミロイドβ(Aβ)プラークおよび細胞内タウ神経原線維のもつれの蓄積である。グリア細胞の変化はまた、^AD2 およびいくつかの神経伝達物質系の可能な破壊と関連している^3、4。

TgF344-ADラット株は、ヒトAPPおよびPS1_ΔE9導入遺伝子を発現することによってADをモデル化するように改変され、可溶性および不溶性のAβ−40およびAβ−42発現およびアミロイドプラーク形成⁵をもたらす。それはまた、タウオパチーにつながるタウタンパク質の過剰リン酸化形態の蓄積を提示する。9〜24ヶ月齢から、ラットはADの病理学的特徴および認知障害5,6,7,8,9を徐々に発症する。

陽電子放射断層撮影(PET)、単一光子放射コンピュータ断層撮影(SPECT)、およびオートラジオグラフィーは、γ光線の放出および定量化に基づく技術である。放射性トレーサーは、インビボ(PETおよびSPECT)またはエキソビボ/インビトロ(オートラジオグラフィー)のいずれかで定量化される。これらの敏感な技術は、ADなどのいくつかの脳疾患のメカニズムの理解に貢献してきました。実際、神経炎症に関しては、in vivo神経炎症マーカーである18kDaトランスロケータータンパク質(TSPO)を、[11C]-(R)-PK11195または[^11C]PBR28などの放射性標識トレーサーで評価する多くの研究がある(レビューについては¹⁰を参照)。加えて、神経伝達物質系の変化は、放射性トレー^{サー11、12、13}を用いて研究されている。

しかしながら、これらの技術は、放射性シグナルの細胞起源を決定しない。これは、PET/SPECTにおける放射性リガンドの結合における変化の生物学的基盤の解釈を妨げる可能性がある。例えば、神経炎症のTSPO研究の場合、TSPOの増加または減少がアストロサイトまたはミクログリアの変化によるものかどうかを理解することが最も重要である。放射性リガンド処理組織への蛍光活性化細胞選別(FACS-RTT)技術は、これらの問題を回避するために開発され、すべての細胞タイプにおける放射性リガンド結合を個別に評価し、細胞あたりの標的タンパク質密度を定量化することができます。この革新的な技術は、PETおよびSPECTイメージングと補完的で高い互換性があります。

ここで、この技術は、TSPO特異的放射性リガンドを用いた神経炎症の研究とセロトニン作動系の評価の2つの軸に沿って適用された。第1の軸では、目的は、急性炎症反応に応答するTSPOシグナルの細胞起源を理解することであった。したがって、FACS-RTTは、リポ多糖(LPS)注射を介して神経炎症を誘導した後、およびin vivo [¹²⁵I]CLINDE SPECTイメージング研究に続いてラットの脳組織に使用された。さらに、12ヶ月齢および24ヶ月齢のTgF344-ADラットおよび一致する野生型(WT)ラットに、同じイメージングおよびFACS−RTTプロトコルを適用した。第2の軸は、細胞型によるエクスビボ5−HT2AR密度評価を介してこのラットモデルにおけるセロトニン作動性系変化の起源を決定することを目的とした。

すべての実験手順は、ジュネーブ州の人間および動物実験のための倫理委員会、研究倫理のための州委員会(CCER)、およびジュネーブ州の健康の一般的な方向性(スイス)とそれぞれ合意して実施されました。データは、動物研究: 報告インビボ 実験(ARRIVE)ガイドラインに従って報告されます。

1. SPECTカメラの準備とキャリブレーション

1. カメラの電源を入れ、オペレーティングソフトウェアをロードします( 材料表を参照)。 ホームXYZステージ ボタンをクリックして、ホーミングを実行します。
2. 1 回の 10 分間のスキャン取得で構成される実験を設定します。 ステップ モードを ファイン に設定し、 アクイジション モードを リストモード に設定します(発光スペクトル全体を記録するため)。
3. ベッドをセットアップし、温暖化システム、呼吸センサー、および麻酔が機能し、安全であることを確認します(図1A-D)。次に、動物の頭部が配置される場所にファントム(すなわち、既知の濃度^{の125Iの2mL}を2mLマイクロフュージチューブに入れる)を置く(領域の中心、図1E)。
4. 画面の下部にある3つの画像の助けを借りて、3次元のカーソルをスライドさせてスキャン領域を設定します。ファントムと動物のスキャン音量が同じであることを確認します。
5. ステップ1.2~1.4で設定したパラメータを使用して、後続のキャリブレーション用のファントムスキャンを開始します。

2. SPECTイメージングのためのワークスペース設定

1. 消毒剤のウイルスでワークスペースを清掃し、すべての表面に柔らかい紙を置きます。
2. それぞれのタンクに十分なイソフルランと酸素があることを確認してください。
3. ラット尾静脈をより鮮明に見るために、バタフライカテーテルのフィンを切り取って24Gカテーテルを準備する。
4. 針を抜いた後、ヘパリン溶液(25000 U/mL)でカテーテルを完全に充填してカテーテルをコーティングします。次に、カテーテル挿入後の血栓形成を避けるために、針をその中に戻します。

3. [^125I]クリンデ放射性トレーサー合成

注意: 放射能は、生細胞の原子に影響を与え、遺伝物質(DNA)を損傷するのに十分な電離エネルギーを持つ可能性があります。

1. 放射能実験の許可を受けた適切な環境で作業すること。
   メモ:指や身体の線量計など、放射能の取り扱いに適した個人用保護具(PPE)を着用してください。放射能源から安全な距離を保つようにしてください。
2. 100 μLの酢酸中のトリブチルリン前駆体100 μgをヨウ化ナトリウム(^Na125I)( 材料表を参照)および5 μLの37%過酢酸をグローブボックスに入れたサーモサイクラーで20分間インキュベートする。
3. 50%アセトニトリル(ACN)を水中で希釈して500 μLの容量に希釈します。希釈した反応液500 μLを逆相カラムに注入します( 材料表を参照)。
4. [^{125 I]CLINDE}を線形勾配HPLCで単離し、5%~95%ACNを7mM_H3PO4中で10分間実行します。単離物を_H2Oで希釈して最終容量10mLを達成し、希釈反応物を濃度カラムに注入する(材料表を参照)。
5. カラムから [¹²⁵I]CLINDE を 300 μL の無水エタノールで溶出した後、RT で真空遠心分離機で 40 分間インキュベートしてエタノールを蒸発させます。
6. [^125I]CLINDEを含む残渣を300 μLの滅菌生理食塩水で希釈し、原液を作成する。
7. その放射能を測定した後、原液を滅菌生理食塩水で希釈し、500 μL中の0.037 MBqの溶液を得た。
8. HPLC(高速液体クロマトグラフィー)によりトレーサーを精製する。450nmでの標準校正を使用して溶出時間を決定し、単一の放射性ピークを単離する。7つの標準濃度の低温(非放射性)CLINDE(0.1 μg、0.5 μg、0.75 μg、1 μg、1.5 μg、2 μg、および5 μg)の50%ACN溶液400 μLを用いて標準検量線を実行します。無線TLC(薄層クロマトグラフィー)で単一のピークを測定することにより、放射化学的純度を確立する。放射化学物質の純度が60%を超えていることを確認してください。
9. 450nmにおける紫外線吸光度を測定する放射性リガンドの比活性と、冷たく参照化合物で作成した検量線を確認してください。比活性が 1000 GBq/μmol を超えていることを確認します。

4. [¹²⁵I]R91150 放射性トレーサー合成

メモ: CLINDE 合成のセクションで説明したのと同じセキュリティ規則に従っていることを確認してください。

1. 3 μLの無水エタノール、3 μLの氷酢酸、15 μLのキャリアフリーNa¹²⁵I( 材料表を参照)(10 mCi)の溶液に300 μgのR91150前駆体を0.05 M NaOHおよび30%_H2O2の3 μLで混合_する。グローブボックスで30分間インキュベートする。
2. 反応全体を逆相カラムに注入する( 材料表を参照)。
3. [¹²⁵I]R91150 をアイソクラティック HPLC ラン (ACN/水 50/50、10 mM 酢酸バッファー) で 3 mL/minの流速で分離します。
4. [125 I]R91150を_H2Oで希釈し、最終容量を¹⁰mLにします。
5. 希釈反応液10mLを濃度カラムに注入する( 材料表参照)。
6. カラムから [¹²⁵I]R91150 を 300 μL の無水エタノールで溶出します。
7. エタノールをRTの真空遠心分離機で40分間インキュベートしてエタノールを蒸発させる。
8. [¹²⁵I]R91150を含む残渣を300 μLの生理食塩水で希釈する。
9. HPLCによりトレーサーを精製する。450nmでの標準校正を使用して溶出時間を決定し、単一の放射性ピークを単離する。無線TLCの単一ピークを測定することにより、放射化学的純度を確立する。放射化学物質の純度が98%を超えていることを確認してください。

5. 動物の準備

1. TgF344-ADラット(雄または雌、生後2〜24ヶ月)を3%イソフルランを含む誘導チャンバー内で計量し、麻酔する。深く麻酔をかけたら、チャンバー内のイソフルラン流量を2%(0.4 L/分、100% O2)に下げます。
2. 麻酔ノーズコーンを備えた予め温められたベッドに動物を置きます。イソフルランを2%(0.4L/分、100%_O2)に維持する。
3. 動物の目にアイゲル潤滑剤を塗布し、呼吸モニタリングを介して麻酔の深さを確認する。必要に応じて麻酔を調整する。
4. 尾静脈に24Gカテーテル挿入を行う。

6. スペクト取得

1. 動物を、38°Cに設定した温度制御された加熱パッドを備えたカメラベッドに移します(図1E)。
2. 動物の頭をバイトバーに固定し、頭の支柱を固定します。
3. 1 分間の 60 フレームで構成される 60 分間のスキャンで実験を設定します。手順 1 で設定した他のすべてのパラメーターを再利用します。[ 画像の更新 ]ボタンをクリックして、動物の位置を更新します。
4. 3次元の画面の下部にある3つの画像の助けを借りてカーソルをスライドさせてスキャン領域を設定します。
5. 500 μLの放射性放射性放射性トレーサー([125 I]^{CLINDEまたは[125}I]R91150)を注入し、チューブに300 μLの滅菌0.9%NaClを流す。同時にクリック 取得の開始 スキャンを開始します。
6. スキャン時間中は、呼吸数モニタリングで動物を一定の麻酔下で維持してください。必要に応じてイソフルランの流れを調整します。
7. スキャンが終わったら、麻酔をかけられた動物を素早く断頭して安楽死させます。

7. スキャンの再構築

1. スキャン再構築ソフトウェア( 材料表を参照)を開き、データセットを開き、スキャンのフォルダに作成された[filename].parametersファイルを探します。
2. 目的の同位体を選択します。 Listmode パラメーターを使用すると、このステップで複数の同位体を選択できます。
3. 次のパラメータを選択します:0.4 mmボクセルサイズ、4(POS-EM)サブセット、6回の反復(24ME-EM相当)、ポストフィルタなし、および対応する同位体減衰補正。NIfTI への出力形式を選択し、[ SPECT 再構築の開始 ] を選択します。

8. ラット脳抽出

1. スキャン手順と同じ麻酔イベントで、呼吸数を監視して動物の深い麻酔状態を確認した後、ギロチンによる断頭に進み、頭を解剖ベンチに素早く移します。
2. はさみで、頭の上の皮膚を背中から前へ目の真ん中まで慎重に切ります。
3. 頭蓋骨の基部と頸椎の周りの余分な筋肉を切り取ります。
4. 次に、頭蓋骨の後ろの穴、孔マグナムにハサミの刃を1枚慎重に入れ、手術用ペンチで頭蓋骨の後ろの部分を外します。
5. その後、外科用ペンチで、頭蓋骨の上部を慎重に取り外します。古い雄ラットの頭蓋骨は厚く、脳への損傷を避けるために小さな断片として取り除くことができます。
6. 髄膜をハサミで慎重に切ります。髄膜は、抽出プロセス中に脳を損傷することができます;予防措置として削除してください。
7. 頭蓋骨の上部を取り除いた後、動物の頭を回し、小さな平らなヘラで、視神経と三叉神経を切って慎重に脳を引き抜きます。
8. 氷上で解剖するために、平らで清潔なガラス表面に脳を慎重に移します。
9. 平らな金属のヘラとカミソリの刃を使用して、脳の関心領域を解剖します。組織を2mL遠沈管に入れ、得られた組織を秤量する。細胞単離のために脳セクションを直接使用するか、後で使用するために液体窒素中で迅速に凍結する。

9. 細胞分離

1. 清潔で無菌の環境で作業してください。クラスIIバイオセーフティキャビネット(BSC)の下で作業することをお勧めします。BSCに導入される手袋とすべての機器が無菌であることを確認してください。
2. 細胞を細胞選別用に調製するには、Jaclyn M. Schwarz¹⁴ のプロトコルに従います。
   注:この実験では、市販の神経解離キット( 材料表を参照)を細胞調製に使用した。
   1. サンプルを1 mLのHBSS(Ca-およびMg-フリー)を含む2 mL遠沈管に入れ、次いで遠心分離機(300 x g、2分、室温= RT)し、ペレットを乱すことなく上清を除去した。
   2. 1900 μLの酵素ミックス-1を加え、5分ごとに反転させてチューブを攪拌しながら、37°Cで15分間インキュベートします。
   3. 30 μLの酵素ミックス-2を加え、ピペット1( 材料表を参照)で穏やかに30回前後に攪拌する。その後、5分毎に反転させてチューブを攪拌しながら37°Cで15分間インキュベートする。
   4. ピペット2と前後に穏やかに混合し、次いでピペット3を37°Cで10分間インキュベートする前に、組織を解離させた。
   5. 80 μm のセルストレーナーで細胞をろ過し、10 mL の HBSS (Ca-および Mg-フリー) を加えます。遠心分離機(300 x g、10分、RT)し、ペレットを乱すことなく上清を除去した。
   6. ミエリン枯渇のために、ペレットを400μLのミエリン除去緩衝液(材料表を参照)で再懸濁し、次いで100μLのミエリン除去ビーズ(材料表を参照)を加えてから、4°Cで15分間インキュベートする。
   7. 5mLのミエリン除去緩衝液を加え、遠心分離機(300 x g、10分、RT)し、ペレットを乱すことなく上清を除去した。
   8. 500 μLのミエリン除去バッファーを加え、チューブを磁場カラムに入れます。カラムを1 mLのミエリン除去バッファーで4回洗浄する。
   9. 遠心分離機(300 x g、2分、RT)し、ペレットを乱すことなく上清を除去した。ボルテックスで短時間(2秒)細胞を解離させ、5μLのFcブロックCD32を加えた。ボルテックスを再度、4°Cで5分間インキュベートした。
   10. 目的の一次抗体の混合物を100μL加える;4°Cで20分間インキュベートする。
   11. 遠心分離機(350 x g、5分間、4°C)でペレットを乱すことなく上清を除去した。チューブを柔らかい紙に逆さまに拭きます。
   12. 短い渦(2秒)の後、100μLの二次抗体ミックスを加え、4°Cで15分間インキュベートする。
   13. 2mLのミエリン除去緩衝液を加え、遠心分離機(350 x g、5分、4°C)で、ペレットを乱すことなく上清を除去した。チューブを柔らかい紙に逆さまに拭きます。細胞を250 μLの滅菌PBSに再懸濁し、細胞選別に直接進む。

10. セルの仕分け

1. マイクロフュージチューブに500 μLの滅菌PBSを用意し、選別した細胞を回収します。
2. 細胞溶液1000 μLあたり10 μLのヘキストを加えて、生細胞の核を着色し、それらを死細胞と区別する。
3. できるだけ早く細胞を4°Cの細胞選別機に移す。
4. まず、前方散乱と側方散乱で細胞をソートし、次にヘキスト陽性細胞をソートします。次に、目的の抗体に基づいて細胞を選別する。陽性に染色された細胞を別々に集める。陽性細胞と自己蛍光細胞を区別するようにしてください。
5. 対象のプールごとにソートされたセルの数をカウントします。

11. ガンマカウント

1. SPECT校正に使用したのと同じファントム溶液10 μLでγ計数システムを校正しますが、1 mLの水で希釈します。
   注:ファントム溶液は、γ計数システムの精度が向上しているため、希釈されています。
2. 選別された細胞のチューブをγ計数システムに置き、製造元のプロトコルに従ってγ計数を続行します。

WTラットは、片側的LPS注射後に[125I]CLINDE放射性トレーサーによるインビボSPECTスキャンを経験した(図2)。このスキャン(放射性トレーサー注射後45〜60分の画像からの集計データを使用)は、LPS注射部位(図2A)における[125I]CLINDEの結合が脳の対側領域(図2B)よりも高いことを示した。FACS-RTTを受けたエキソビボサンプルは、これらの結果を確認し、ミクログリアにおいてのみより多くの[125I]CLINDE結合部位の存在を明らかにし、脳の同側側における[125I]CLINDEシグナルの細胞起源がミクログリアであることを示した(図3A)15。

次に、同じ[125I]CLINDE放射性トレーサーを用いて、このプロトコルを、古いTgF344-ADラット(12ヶ月齢および24ヶ月齢)の海馬上で実施し、24ヶ月齢WTと比較した。結果は、TgF344-ADラットにおける12ヶ月におけるTSPO結合の増加がアストロサイトに限定されることを実証した。生後24ヶ月のラットでは、TSPO結合の増加は、アストロサイトおよびミクログリアの変化の両方によるものであった(図3B)。結果は、アストロサイトにおけるTSPO過剰発現が、おそらくミクログリアのものよりも先に観察されることを示した。独立して、放射性トレーサー[125I]R91150を用いて、この技術を細胞規模で使用して、高齢のTgF344-ADラットにおいて、線条体アストロサイトがWTと比較して5HT2AR密度の減少を示したことを示した(図3C)16。

最後に、FACS-RTTをヒトAD死後サンプルに対して実施した。解離後、細胞を染色およびFACS手順の前に[125I]CLINDEと共にインキュベートした。これにより、AD被験者のアストロサイトおよびミクログリアの両方において、年齢が一致した対照と比較してTSPOの皮質過剰発現を発見することができた(図3D)。

図 1: SPECT カメラのセットアップ。(A) SPECT カメラ全体のプレゼンテーション。(B)ヒーターと呼吸数モニタリングによるベッドプレゼンテーション。(C)麻酔チューブプラグ。(D)加熱ベッドと呼吸プローブソケット。(E)ソフトウェアからのファントム位置決め監視ビュー。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:SPECTと[125 I]CLINDE放射性トレーサーを用いたTSPO脳イメージング。脳の同側(白)側および対側(赤)側における(A)LPSまたは(B)生理食塩水注射後の海馬の代表的な画像([125I]CLINDEの注射後45〜60分)。関心のある体積で測定されたインビボ時間活性曲線は、右側のパネルに表されます。SPECT:単一光子放出コンピュータ断層撮影;TSPO:トランスロケータータンパク質;LPS:リポ多糖。n = 1条件あたり7匹の動物。この図はTournier et al.15から修正されたものである。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:TSPOおよび5HT2AR.(A)LPSの片側脳注射後のTSPO過剰発現の細胞起源の定量化。放射能は、注射の対側(灰色、n = 7)および同側(緑色、n = 7)側の各細胞集団において(組織の%注入用量/ g)を測定した。使用される統計検定: 対応のある t 検定。(B)古いTgF344-ADラットにおけるTSPO。[125I]CLINDE濃度(組織の%注射用量/g)を、24ヶ月齢の野生型動物(灰色、n=9)および12-(緑色、n=8)および24ヶ月齢(紫色、n=7)TgF344-ADラットにおいて決定した。使用される統計的検定: 二元配置分散分析。(c)5HT2ARは、古いTgF344-ADラットにおける線条体のアストロサイトにおいて減少している。[125I]R91150濃度は、WT(灰色、n = 7)および古いTgF344-AD(緑色、n = 11)ラットの細胞レベル(%注射用量/細胞)でアストロサイトおよびミクログリアにおいて決定された。使用される統計的検定: 一元配置分散分析。(d)アルツハイマー病(AD)における前頭皮質におけるTSPO過剰発現の細胞起源。各細胞集団において、AD被験者(緑色、n = 9)および対照(灰色、n = 9)において放射能(組織の%注入線量/ g)が測定される。使用される統計検定: 不対応の t 検定。すべてのデータは、次の注釈±持つ平均<95%信頼区間として表されます:* p < 0.05、** p < 0.001。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

著者らは利益相反がないと宣言しています。