Ex Vivoのレティナル組織サンプルにおけるミトコンドリア呼吸と解糖の測定

サマリー

ここで説明する、商業バイオアナライザを用いた ex vivo のレチナル組織サンプルにおけるミトコンドリアストレスアッセイおよび解糖率アッセイを行うための詳細なプロトコルを説明する。

要約

ミトコンドリア呼吸は、全ての細胞、特に高活性代謝を有するレチン系感光体の重要なエネルギー生成経路である。また、光受容体は癌細胞のような高い好気性解糖を呈する。これらの代謝活動の正確な測定は、生理学的状態および疾患状態における細胞恒常性に関する貴重な洞察を提供することができる。高スループットマイクロプレートベースのアッセイは、生細胞におけるミトコンドリア呼吸および様々な代謝活動を測定するために開発されています。しかし、これらの大部分は培養細胞用に開発されており、インタクトな組織サンプルやアプリケーション ex vivo用に最適化されていません。ここでは、マイクロプレートベースの蛍光技術を用いて、酸素消費速度(OCR)をミトコンドリア呼吸の指標として直接測定する詳細なステップバイステッププロトコル、ならびに細胞外酸性化率(ECAR)を解糖の指標として、無傷の ex vivo レチン組織で説明する。この方法は、正常に成人マウスのレティナの代謝活動を評価し、老化や病気の細胞機構を調査する際にそのアプリケーションを実証するために使用されています。.

概要

ミトコンドリアは、細胞代謝、シグナル伝達、ホメオスタシス、アポトーシスを複数の重要な生理学的プロセスを調整することによって調節する必須のオルガネラ^である1。ミトコンドリアは、酸化リン酸化(OXPHOS)を介してアデノシン三リン酸(ATP)を生成し、ほぼすべての細胞イベントをサポートするエネルギーを提供する細胞内の大国として機能します。細胞酸素の大部分はミトコンドリアで代謝され、好気呼吸中の電子輸送鎖(ETC)の最終的な電子アクセクサとして機能する。低量のATPは、グルコースをピルビン酸に変換するサイトゾルの解糖からも製造することができ、さらに乳酸に変換したり、ミトコンドリアに輸送したり、三カルボン酸サイクル(TCAサイクル)の基質であるアセチルCoAに酸化することができます。

このレティナは哺乳動物2において最も代謝活性の高い組織の1^つで、高レベルのミトコンドリア呼吸と非常に高い酸素消費量を示す³。ロッドおよびコーン光受容体は、ミトコンドリア⁴の高密度を含み、OXPHOSは、retina5で最もATPを生成します。さらに、このレチナは、グルコースを^乳酸5に変換することにより、好気性

プロトコル

すべてのマウスプロトコルは、国立眼科研究所(NEI ASP#650)の動物のケアと使用委員会によって承認されました。マウスは12時間の明暗条件で収容され、実験動物のケアと使用のためのガイド、実験動物資源研究所、およびヒトケアと実験動物の使用に関する公衆衛生サービスポリシーの勧告に従って世話をしました。

1. センサカートリッジのハイドレートとアッセイ媒体の準備

1. 実験前日に、1 mLのキャリブレーション媒体をユーティリティプレートの各ウェルに加えます。ハイドロブースターカバーを上部に置き、カバーの開口部からセンサーカートリッジを下げます。センサーがキャリブレーションメディアに沈み込みになっていることを確認します。センサーカートリッジを37°Cの_CO2フリーインキュベーターに一晩インキュベートし、フルオロフォアを活性化します。
   注:蒸発を防ぐために、インキュベーターは内部の水のトレイを保つことによって加湿され、センサーカートリッジカセットは透明なラップで包まれます。
2. シーホースDMEM培地をグルコース、ピルビン酸、グルタミンを所望の濃度に添加して再構成してアッセイ培地を調製します。本稿で報告されたアッセイでは、アッセイ媒体中の基質の最終濃度は、グルコースの6mM、ピルビン酸の0.12mM、および0.5mMのグルタミンである。各アッセイプレートについて、実験当日にアッセイ培地の40mLが新鮮に調製される。
....

結果

ここで報告されるデータは、OCRトレースを示す代表的なミトコンドリア応力アッセイ(図1)およびOCRトレースおよびECARトレースを示す解糖率アッセイ(図2)であり、4ヶ月前のトランスジェニック Nrl-L-EGFP ^mice36 (C57B/L6バックグラウンド)から解剖したばかりの1mmのレチナルパンチディスクを使用して行った。これらのマウスは、正常なレチナルの発達、病変、生理学を変えることなく、特にロッド感光体でGFPを発現し、肛門の研究で広く使用されている。ここで提示したアッセイでは2つの Nrl-L-GFP リッターメートマウスが使用された。 Nrl-L-GFP マウスで発現されたGFPは、このプロトコルにおけるOCRおよびECARの測定を妨げない。各レチナから5つのレチナルパンチが採取された。10個のレチナルパンチをミトコンドリアストレスアッセイに使用し、残りの10を解糖率アッセイに使用した。シーホースXF.......

ディスカッション

ここでは、ex vivo、新たに解剖されたレチナルパンチディスクを使用してミトコンドリア呼吸および解糖活性のマイクロプレートベースのアッセイを実行するための詳細な手順を提供します。プロトコルは、次のように最適化されています: 1) ex vivoのレチン組織に適したアッセイ媒体の使用を保証します。2)は、マシンの最適な検出範囲内にあるOCRとECARの測定値を得るために、レチナルパンチディスクの適切なサイズを採用します。3)コーティングメッシュ挿入物は、測定サイクル中に安定した読み取りのためのレチナルパンチの粘着性を高めるために挿入します。4)各注射薬物化合物の最適濃度の使用;5)各ステップでミトコンドリア状態の高原に到達するために変更されたサイクル長さを確認する。試薬とプロトコルは、新世代のシーホース^XFe24マシンに適応するために、以前に公開されたバージョン23から変更されました。前のプロトコル²³で使用されたAmesのバッファの代わりに、グルコース、グルタミン、ピルビン酸を別々に添加することによって燃.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1X PBS	サーモフィッシャー	14190-144
2-デオキシグルコース (2-DG)、500 mM ストック溶液	Sigma	D6134	タツノオトシゴ XF DMEM 培地に溶解し、事前に準備
します 30 ゲージニードル	BD プレシジョン グライド	305106
アンチマイシン A、10 mM ストック溶液	Sigma	A8674	DMSO に溶解し、事前に準備
Bam15、10 mM ストック溶液	TimTec	ST056388	DMSOに溶解し、事前に準備
生検パンチャー、1 mm	Integra Miltex	33-31AA
Cell-Tak	Corning Life Sciences	CB40240
CO2 asphyxiation chamber
解剖鉗子-Dumont #5	Fine Science Tools	11251-10	Stright tip
Dissection鉗子-デュモン #7	ファインサイエンスツール	11274-20	湾曲した先端
解剖顕微鏡
DMSO	シグマ	D2438
グレーフ鉗子	ファインサイエンスツール	11051-10	湾曲した、鋸歯状の先端
マイクロハサミ	ファインサイエンスツール	15004-08	湾曲した先端
NaOH 溶液、1 M	シグマ-アルドリッチ	S8263	水溶液、事前に準備
ロテノン、10 mMストック溶液	シグマ	R8875	DMSOに溶解し、事前に準備
タツノオトシゴ校正媒体	アジレント	100840-000
タツノオトシゴ XF 1.0 Mグルコース	アジレント	103577-100
タツノオトシゴ XF 100 mMピルビン酸	アジレント	103578-100
タツノオトシゴ XF 200 mM グルタミン	Agilent	103579-100
タツノオトシゴ XF DMEM ミディアム	Agilent	103575-100	pH 7.4、5 mM HEPES タツ
XFe24 Islet Capture FluxPak	Agilent	103518-100	センサーカートリッジと Islet Capture マイクロプレート
タツノオトシゴ XFe24、細胞外フラックス分析装置	Agilent
重炭酸ナトリウム溶液、0.1M	Sigma-Aldrich	S5761	水溶液、事前に準備
超極細まつげブラシ	テッド・ペラ	113

します します ノオトシゴ