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方法論記事

マウスバガル・アファレントニューロンにおけるGタンパク質結合受容体発現 の 検出

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DOI：

10.3791/62945

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2021年9月20日

 , 
1Center for Hypothalamic Research and Department of Internal Medicine, UTSouthwestern Medical Center at Dallas

この記事について

サマリー

Situハイブリダイゼーション(ISH)におけるマルチプレックスは、成体マウスの全迷頭神経節複合体における2つのGタンパク質共役受容体および1つの転写因子の転写を同時に可視化するために採用された。このプロトコルは、迷走性の刺激性ニューロンの転写プロファイルの正確な地図を生成するために使用することができる。

要約

本研究では、マウスの 遺伝子 組み換え(ISH)における多重化のプロトコルを説明し、特にGタンパク質共役受容体(GPCRs)の発現を検出することに重点を置いた。ホルマリン固定頸部-結節神経節は、RNAscope技術を用いて処理され、2つの代表的なGPDR(コレシストキニンおよびグレリン受容体)の発現を、ノードーズ(ペアドホメオボックス2b、Phox2b)または頸管失フェルニューロン(PRドメイン亜鉛フィンガータンパク質12、Prdm12)の1つのマーカー遺伝子と組み合わせて同時に検出した。標識された神経素は、前述の転写物の分布および発現パターンを決定するために共焦点顕微鏡を用いて画像化した。簡単に言えば、Phox2bのアッフェレントニューロンは、コレシストキニン受容体(Cck1r)を豊富に発現するが、グレリン受容体(Ghsr)を豊富に発現しないことが判明した。Prdm12の小さなサブセットの発泡性ニューロンは、Ghsrおよび/またはCck1rを発現することも発見された。この記事で説明されているアプローチは、迷走性の刺激性ニューロンの転写プロファイルの正確な地図を生成する際に科学者を助けるかもしれません。

概要

迷走性の細胞体は、頸部、ペトロサル、および無用量神経節1、2、3に含まれている。彼らの軸索は、頭蓋神経、胸部、および腹部の領域4、5、6、7に迷走神経のいくつかの枝を介して一緒に移動します。彼らの内臓の終わりから、迷走者は生理学的および有害な刺激の広い範囲に応答することができます8、9、10.しかし、バジクエンセンシングに関与するシグナル伝達分子や受容体の分布は、依然として十分に特徴付けされていません。これは、迷走性神経節が、その小さなサイズにもかかわらず、多数のGPCRs8、11、12、13を含む幅広い受容体スペクトルを発現するためである。さらに、迷走性の無フェレントニューロンは本質的に異種であり、明確な分子プロファイル14を表示する。問題を複雑にするために、頸部、ペトロサル、およびノードーズ神経節がマウスに取り付けられ、それによって単一の神経節塊を形成する。最後に、動物のサブセットにおいて、無用量神経節は交感神経節15に交感神経節に付着している。

過去に、研究者は、迷走性の神経細胞16、17、18の神経化学的構成を研究するために免疫体系化学に目を向けました。検証された抗体を用いた免疫組織化学は有用であるが、免疫組織化学の研究結果は慎重に解釈されなければならない。例えば、GPCRsに対する特定の抗体を同定するための数多くの努力は、19、20、21、22、23、24、25に失敗し、研究者はGPCBに対する抗体の大半が信頼できないと結論付けました。これらの問題を回避するために、定量PCR(qPCR)は、げっ歯類迷膜神経節系質量26、27、28、29における遺伝子発現を評価するために広く使用されている。しかし、qPCRを用いた遺伝子発現の検討は、空間情報の損失を犠牲にして生じる。特に、対象となる特定の遺伝子(例えば、無用量対頸部細胞)を発現する細胞の数や細胞タイプは予測できない。また、反復的な問題としては、隣接組織との汚染や迷走神経の可変長、上頸部、および解剖15中の頸管神経節の含めることも含まれる。上記の困難の結果として、論争は、迷走性の神経細胞におけるいくつかのGPCBの発現と分布を取り巻く。特に不可解な例の1つは、グレリン受容体(Ghsr)に関する。いくつかの研究は、バガルの無フェレントニューロン30、31、32でこの受容体の広範な発現を発見しているのに対し、他の研究は、Gsr mRNAが、11,14の無用量でほとんど検出できないことが判明した。したがって、迷走神経節系質量におけるGhsr mRNAの詳細なマッピングが保証される。

また、この中で、迷走神経節塊7、11、12、33、34、35の遺伝子発現パターンを評価するためにも使用されている。RNAベースの技術は、ほとんどの状況下で抗体ベースの技術よりも信頼性が高く、特異的なままであるため、36、37、ISH研究は、迷膜の発泡神経細胞の神経化学的コーディングのより良い理解のために価値があることが証明されています。それにもかかわらず、伝統的なISH技術自体は注意点がないわけではありません。放射性ISHは敏感であるが、背景を生成し、面倒な38のままです。非放射性のISHは複雑ではなく、感度が低い38です。対照的に、最近開発されたRNAscope ISH法は高感度で、最小限の背景39を生成します。現在の研究では、マウスの迷走性の神経細胞におけるGPCBの検出に多重蛍光RNAscopeを適用した。我々は、Ghsrの分布をマッピングすることに焦点を当て、その分布をコレシストキニン受容体(Cck1r)と比較し、無用量神経節34で発現することがよく知られている別のGPCRである。最後に、2つの転写因子は、ペアドライホメオボックス2b(Phox2b)およびPRドメインジンクフィンガータンパク質12(Prdm12)と、それぞれ14個の無用量および頸状の帯状神経細胞に対する選択マーカーとして使用した。Phox2bまたはPrdm12を視覚化しなければ、確実に頸部対無用量のアフェレントを特定することは困難です。潜在的な技術的な落とし穴についても、記事全体で説明されています。

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プロトコル

注:この研究で使用されたマウスは、純粋なC57BL / 6Jバックグラウンドで野生型の雄でした。多重化のISHには合計4匹のマウスを用いた。すべてのマウスは、犠牲の時点で約8週齢であった。1つの雄マウス(およそ1歳)も老化に関連する内因性蛍光を示すために使用された。動物は、食料と水への アドリビタム アクセスを備えたバリア施設内の換気ケージに収容されました。UTサウスウェスタン医療センターの施設動物のケアと使用委員会は、以下に記載の手順を検討し、承認しました。試薬とツールの詳細については、 資料表を参照してください。

1. サンプルコレクション

  1. 犠牲の日に、マウスにクロラルハイドレート(500mg /kg、すなわち)の過剰摂取を投与する。深く麻酔化されたマウスを、5 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を用いた蠕動ポンプを使用して、室温で10%ホルマリンの50 mLを続ける心腔内に浸透させる。
    注:これはホルマリンの吸入を防ぐためにヒュームフードで行われます。
  2. ノードース、ペトロサル、および頸管神経節が融合してマウス15に単一の神経節塊を形成し、解剖スコープと細かいスプリングハサミと鉗子の助けを借りて、両側(左右)から迷走神経節塊全体を慎重に収集する( 材料表を参照)。
  3. 大きなハサミでマウスの首を切るとき( 材料表を参照)、脳幹を押しつぶさないようにします。
  4. ラット40に先に説明した解剖アプローチに従って、後頭部骨を露出させるために、小さな鉗子(材料表)で気管に横向きのステルノヒロイドおよびオモヨイド筋を取り除く。頸動脈、迷走神経、舌下神経、および前門のマグナムが見えるまで、筋肉、脂肪組織、および結膜組織の全領域をクリアする。小さな春のはさみで全ての舌下神経を切る(材料表)。
  5. 口数マグナム15に近い半透明の塊として無用量ガングリオンを探してください。小さいはさみ(材料のテーブル)を使用して、慎重に後頭部の骨を破って、さらに頸神経節を露出させる。視覚的なランドマークとして、頸部の表面に黒いメラノサイトを探します。
  6. 迷走神経節系質量の間の神経付着を切断し、迷走神経の末端を優しく引っ張りながら、小さなスプリングハサミで脳幹に向かって頸神経節を切断することによって、神経節質量全体を抽出する(材料表)。
  7. 結合組織と、迷走神経と神経節系の塊にできるだけ固着する脂肪をできるだけ取り除きます。
  8. 一方のチューブから他方への移動中に1つの神経節を失うのは容易であるため、迷走神経の約0.5cmを保持して、サンプルの取り扱いと局在化を容易にします。
  9. 1.5 mLマイクロ遠心分離チューブに微細な鉗子の助けを借りて神経節を置き、ホルマリンで4°Cで24時間、さらに24時間30%スクロースでインキュベートします。
  10. アルミ箔の上に最適な切断温度(OCT)媒体の小さな滴(約4mm Ø)の内側に神経節を配置します。次に、ドライアイスのベッドの上にサンプルを凍結します。
  11. -20°Cのクライオスタットでサンプルを14 μmの厚さのセクションに切り、3シリーズ42 μm離れたところにガラス顕微鏡スライドに集めます。
    メモ:スライドの端にセクションを近づけないようにします。試薬を保存するには、組織切片をできるだけしっかりと詰めておきますが、重ならないようにしてください。
  12. 少なくとも6ヶ月間、必要になるまで-80°Cの冷凍庫にサンプルを保管してください。
    メモ:内因性蛍光のトラブルシューティングについては 、図1 を参照してください。

2. 前処理とイッシュ

  1. 実験の日の前に、食器や洗浄バッファーの瓶を含む、ISHに使用されるオートクレーブ実験室用ガラス製品。
    注:RNaseフリーの条件下で作業することは重要ではありませんが、常に手袋を着用してください。汚染が疑われる場合には、RNase除染溶液ボトル(材料表)を手の届くところに保管してください。
  2. 初日は、特にISH専用のベンチでスライドを室温にします。1x PBSでスライドをすすぎ、ベーキングオーブン(材料表)で60°Cで30分間焼きます。
  3. 4%ホルマリンでスライドを4°Cで15分間後固定します。
  4. マルチプレックスキット(材料表)の試薬を室温にしてください。
  5. スライドを50%、70%、100%エタノールずつ脱水乾燥します。H2O2溶液をサンプルに10分間塗布し、二重蒸留水(ddH2O)ですすります。
  6. サンプルを5分間のターゲット検索試薬で処理し、ddH2Oでリンスを100%エタノール、エアドライで処理します。疎水性ペンを使用して、サンプルの周囲にバリアを作成します。
    注:疎水性バリアを組織切片に近づけないでください。
  7. ハイブリダイゼーションオーブンで40°Cでプロテアーゼを30分間塗布する(材料表)。
  8. その間、プローブを40°Cで予熱し、使用前に室温で冷却します。ハイブリダイゼーションオーブンで40°Cで2時間、目標プローブ(Cck1r-C3、Ghsr-C1、Phox2b-C2;またはCck1r-C3、Ghsr-C1、Prdm12-C2)の所望の組み合わせでスライドをインキュベートします。
  9. ジヒドロジピコリン酸還元法(DapB)標的C1プローブをハイブリダイゼーションオーブンで40°Cで2時間用にインキュベートする。
  10. スライドを洗浄バッファーで洗い流し、室温でクエン酸 5x 生理食塩水ナトリウム (SSC) で一晩保管します。便宜上、実験を2日間に分割します。翌日、洗浄バッファーでスライドを洗い流し、以下にリストされている増幅試薬でインキュベートします( 資料表のユーザーマニュアルを参照)。
  11. AMP1(40°Cで30分)、AMP2(40°Cで30分)、AMP 3(40°Cで15分)を適用します。各ステップ間の洗浄バッファーで洗い流す。
  12. ジメチルスルホキシドで各オパール色素(材料表)を溶解し、必要になるまで4°Cで溶液を保存します。
  13. チャンネル1の場合は、HRP-C1(40°Cで15分)とオパール520(緑色、希釈1/1,500;40°Cで30分)でスライドをインキュベートします。各ステップ間の洗浄バッファーで洗い流す。
  14. チャンネル2の場合は、HRP-C2(40°Cで15分)とオパール570(黄色、希釈1/1,500;40°Cで30分間)でスライドをインキュベートします。各ステップ間の洗浄バッファーで洗い流す。
  15. チャンネル3の場合は、HRP-C3(40°Cで15分)とオパール690(遠い赤い色、希釈1/1,500;40°Cで30分間)でスライドをインキュベートします。各ステップ間の洗浄バッファーで洗い流す。
  16. スライドを洗い、4',6-ジミディノ-2-フェニリンドール(DAPI)に30 sで公開します。
  17. すぐに各スライドに取り付け媒体を塗布し、組織セクションの上にカバースリップを置きます。
  18. 画像が撮れるまで、スライドホルダの組織を4°Cで水平に保ちます。

3. 顕微鏡・データ解析

メモ:多重のISHデータは、適切なフィルタを備えた幅広い機器で画像化できます。しかし、好ましいイメージング方法は、20xおよび63x(油)目標を有する共焦点顕微鏡である。その理由から議論を参照してください。最適な信号対雑音比の決定については 、図2 を参照してください。

  1. 488、561、および633 nmのレーザーラインを備えた共焦点顕微鏡を使用してください。次の取得パラメータを使用します( 表1を参照):Opal 690(HeNe 633 nm、検出範囲668-696 nm、パワー2.0、ゲイン724)。オパール570(DPSSレーザー561 nm、検出範囲579-627 nm、<パワー15.0、<ゲイン450);オパール520(アルゴンレーザー488 nm、検出範囲499-535 nm、<パワー6.0、<ゲイン830);DAPI(ダイオードレーザー405、検出範囲415-502nm、<電力12.0、<ゲイン532)。
  2. 画像の品質を向上させるためには、4のライン平均と少なくとも1024 x 1024のピクセルサイズで取得します。
    注:上記のパラメータは例として提供されるだけであり、1つの器具、倍率(20xまたは63x)、発現レベル、および任意の特定の組織の蛍光の内因性レベルに応じて変更が推奨されます。
  3. 取得パラメータに満足したら、同じ設定を使用して画像を収集します。各チャネルに誤った色を設定して、視覚化を容易にします。
    注: たとえば、赤 (Phox2b または Prdm12)、シアン (Cck1r)、黄色 (Ghsr)、およびグレー (DAPI) などです。
  4. DAPIで軽く染色された1つの核を有するRNAscope陽性プロファイルの輪郭を同定することにより、デジタル画像を用いて細胞計数を行う。各転写を表すRNAscope陽性プロファイルの割合を計算する[図3A-C]。
  5. 推定値の厳格さと精度を向上させるために、少なくとも4つの異なる動物から少なくとも2,000のニューロンプロファイルを数えます。左右の神経節から個別にカウントを実行します。
  6. カウントされたプロファイルの合計数を含む円グラフのデータを入力します。
  7. イメージングソフトウェアを使用して画像を取得し、20倍の画像をつなぎ合わせます。ImageJ-Fijiと別の写真とデザインソフトウェアを使用して、最終的なプレートを生成します。すべての画像に対して、コントラストと明度を均一に調整します。

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結果

RNAScopeは、年齢、性別、または遺伝的背景を持つ動物に適用できますが、若い成人(生後3ヶ月 <)と一緒に働くことをお勧めします。これは、蛍光性アーチファクト(例えば、リポフスチン)が古い動物41のニューロンにおける一般的な知見であるからである。古いマウスからのホルマリン固定神経節は、多くの場合、本物の染色と間違えられやすい驚くほど強烈な内因性蛍光を含んでいます(図1A,B)。いずれの場合も、処理前に組織中の内在性蛍光のレベルを確認することをお勧めします。

図2A,Bに示すようにDapB陰性プローブでインキュベートされた陰性対照組織の切片を用いて、各レーザーと倍率の最適な取得パラメータと信号対雑音比を決定することが重要である。DapBは原核生物遺伝子であるため、RNAscopeシグナルは陰性対照組織から完全に存在しなくなる...

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ディスカッション

ISHの技術は1960年代後半42年に発明された。しかし、1980年代半ばになって初めて、中枢神経系および末梢神経系43,44におけるmRNAの検出に適用された。神経系の異質性と抗体の繰り返しの問題を考慮すると、細胞レベルで特定のトランスクリプトを局所化することは非常に貴重なツールのままです。それにもかかわらず、伝統的なISH法は、面倒で多様に敏感なままです。幸いなことに、この研究はRNAscopeと呼ばれる非常に敏感なISH手順を採用し、通常は背景を生成せず、低レベル45、46で発現するいくつかの転写物を検出することを可能にする。具体的には、多重蛍光RNAScopeを、GhsrおよびCck1r転写物の同時検出に適用した。転写因子としては、Phox2bおよびPrdm12が、それぞれ無用量および頸状の不透過性ニューロンを区別する選択的マーカーとしてさらに用いら...

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開示事項

著者らは、競合する財政的利益を宣言しない。

謝辞

この研究は、NIH助成金#5P01DK119130-02によって資金提供された神経解剖学/神学/脳注射コアによって支えられた。著者らは、NCIがんセンター支援グラントの一部が支援するハロルド・C・シモンズがんセンターの共有資源であるNIHグラント#1S10OD021684-01の支援を受けたUTサウスウェスタン・ライブ・セル・イメージング・ファシリティ(フェルプス博士が率いる)とそのスタッフ(アビジット・バグデとマルセル・メトレン)の支援を認めたいと考えています。 P30 CA142543.

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
10x PBSフィッシャーサイエンティフィックBP399-4
20x SSCInvitrogenAM9763-80
°C冷凍庫PHCBIMDF-DU901VHA-PA
Adobe Photoshop 2021Adobeの写真およびデザインソフトウェア
ベーキングオーブンThermo Scientificモデル:658
共焦点顕微鏡ツァイスLSM880 エアリスカン
カバーガラスブレインリサーチラボラトリーズ2460-1.5D
クライオスタットライカCM3050 S
デュモン #5 フォーセプスF.S.T.11252-20
EcomountBiocare MedicalEM 897L封入媒体
HybEZ オーブンハイブリダイゼーションオーブン
疎水性ペンVector LaboratoriesH-4000
ImageJ-FijiNIH
大型はさみHenry Schein100-7561
マイクロ遠心分離管VWR20170-333
ミニポンプ可変流量フィッシャーサイエンティフィック13-876-1
オパール 520アコヤバイオサイエンスFP1 1487001KT蛍光バイオマーカー
オパール 570アコヤバイオサイエンスFP1 1488001KT蛍光バイオマーカー
オパール 690アコヤバイオサイエンスFP1 1497001KT蛍光バイオマーカー
プロロングゴールド蛍光標識細胞用褪色防止封入剤封入剤
RNAscopeマルチプレックス蛍光試薬キット v2ACD /Bio-Techne323100マルチプレックスキット
RNAscopeプローブ Mouse Cck1r-C3ACD /Bio-Techne313751-C3
RNAscopeプローブ Mouse DapBACD /Bio-Techne310043
RNAscopeプローブ Mouse GhsrACD /Bio-Techne
RNAscopeプローブ Mouse Phox2b-C2ACD /Bio-Techne407861-C2
RNAscopeプローブ Mouse Prdm12-C2ACD /Bio-Techne524371-C2
RnaseZapSigmaR2020Rnase 除染液
小型解剖ハサミMillipore SigmaZ265977
Superfrost Plus スライドFisherbrand1255015
Tissue Tek OCT mediumSakura4583
ユーザーマニュアルACD323100 USM
Vannas Spring ScissorsRobozRS 5620
ZEN イメージングソフトウェアZeiss
426141

参考文献

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