ミトコンドリアのエネルギーを野外で測定するための移動式ミトコンドリア生理学研究室の開発

サマリー

野外で捕獲した野生動物の単離ミトコンドリアの呼吸数を測定する移動実験室を設計・建設しました。ここでは、移動式ミトコンドリアラボの設計と装備、および関連するラボプロトコルについて説明します。

要約

ミトコンドリアのエネルギー学は、動物の生化学と生理学の中心的なテーマであり、研究者はミトコンドリア呼吸を代謝能力を調査するための指標として使用しています。ミトコンドリア呼吸の測定値を得るには、新鮮な生物学的サンプルを使用する必要があり、実験室手順全体を約2時間以内に完了する必要があります。さらに、これらのラボアッセイを実行するには、複数の専用機器が必要です。そのため、生理学研究室から遠く離れた場所に生息する野生動物の組織におけるミトコンドリア呼吸を測定することは、野外で採取した後、生きた組織を長期間保存することができないため、困難が生じます。さらに、生きた動物を長距離輸送するとストレスが誘発され、ミトコンドリアのエネルギーが変化する可能性があります。

この原稿では、オーバーン大学(AU)のMitoMobileという、野生動物から採取した組織のミトコンドリア代謝を測定するために現場に持ち込んで現場で使用できる移動式ミトコンドリア生理学研究室を紹介します。移動式実験室の基本的な特徴と、孤立したミトコンドリアの呼吸数を測定するための段階的な方法を紹介します。さらに、提示されたデータは、移動式ミトコンドリア生理学実験室の装備とミトコンドリア呼吸測定の成功を検証しています。移動式ラボの斬新さは、現場に車で行き、現場で捕獲された動物の組織でミトコンドリア測定を行うことができることです。

概要

今日まで、ミトコンドリアのエネルギーを測定するために設計された研究は、実験動物または確立された生理学研究所の近くで捕獲された動物に限定されており、科学者は、移動、潜水、冬眠などの活動中に動物から収集された組織でミトコンドリア生体エネルギー研究を行うことを妨げてきました1,2,3,4,5,6 .多くの研究者が野生動物の基礎代謝率とピーク代謝率、および毎日のエネルギー消費量の測定に成功していますが^7,8、ミトコンドリアのパフォーマンスを測定する研究者の能力は限られています(ただし、1,4,9を参照)。これは、ミトコンドリアを単離するための新鮮な組織と、新鮮な組織を入手してから約2時間以内に単離を行うための実験施設が必要であることが一因です。ミトコンドリアが分離されたら、ミトコンドリア呼吸の測定も~1時間以内に完了する必要があります。

単離されたミトコンドリア呼吸速度は、通常、クラーク電極に接続された密閉容器内の酸素濃度を測定することによって行われます。この方法の背後にある理論は、酸素が酸化的リン酸化中のミトコンドリア呼吸の最後の電子受容体であるという基本的な観察に基づいています。したがって、実験中に酸素濃度が下がると、アデノシン三リン酸(ATP)の生成が起こると仮定^される10。消費された酸素は、産生されたATPの代理です。研究者は、さまざまな基質を使用して特定の実験条件を作成し、チャンバーに所定の量のADPを添加することにより、アデノシン二リン酸(ADP)刺激呼吸(状態3)を開始できます。外因性ADPからATPへのリン酸化に続いて、酸素消費率は低下し、状態4に達して測定可能になる。さらに、特異的阻害剤の添加により、漏出呼吸および非結合呼吸に関する情報を得ることができる¹⁰。状態3と状態4の比率は、ミトコンドリア全体の結合の指標である呼吸制御比(RCR)を決定する^10,11。RCRの値が低いほどミトコンドリア全体の機能不全を示し、RCRの値が高いほどミトコンドリアの結合の程度が大きいことを示唆している¹⁰。

前述したように、生体物質の採取、ミトコンドリアの単離、および呼吸数の測定は、組織を取得してから2時間以内に完了する必要があります。動物を既存の研究所に長距離輸送することなくこのタスクを達成するために、移動式ミトコンドリア生理学実験室が建設され、これらのデータを収集できるフィールドの場所に連れて行かれました。2018年のJayco RedhawkRV車は、移動式分子生理学研究所に改造され、オーバーン大学(AU)MitoMobileと名付けられました (図1A)。冷蔵庫、冷凍庫、貯水タンクと配管、12ボルトのバッテリーで駆動する電気、ガス発電機、プロパンタンク、セルフレベリングシステムを備えたRV車が選ばれました。さらに、RV車は、データ収集のために遠隔地に一晩滞在する機能を提供します。車両の前部は変更されておらず、運転室と寝室があります (図1B)。車両後部に設置されていた寝室のアメニティ(ベッド、テレビ、キャビネット)とコンロは撤去されました。

寝室のアメニティとコンロの代わりに、特注のステンレス製の棚と80/20アルミニウムフレームで支えられた特注のクォーツカウンタートップが設置されました (図1C)。実験台は、データ収集に十分なスペースを提供します (図1D)。各機器(冷蔵遠心分離機、ミトコンドリア呼吸室、プレートリーダー、コンピューター、ホモジナイザー、体重計、ポータブル超冷凍庫、その他の一般的な実験用品)の消費電力を考慮しました。遠心分離機の大きな電圧と電流の要求に対応するために、電気系統は航空機グレードの機器にアップグレードされました。車両後部の外部コンパートメントは、液体窒素の貯蔵と輸送に関する米国運輸省のガイドラインを満たす液体窒素貯蔵ベイに改造されました。この貯蔵ユニットはステンレス鋼で構成されており、膨張する窒素ガスが車両の客室に漏れるのを防ぐための適切な通気孔を備えています。

移動実験室がミトコンドリア生体エネルギー研究に利用できることを確認するために、ミトコンドリアを単離し、野生由来のハツカネズミ(Mus musculus)の後肢骨格筋のミトコンドリア呼吸数を測定しました。Mus musculusはモデル生物であるため、この種のミトコンドリア呼吸数は^12,13,14と確立されています。以前の研究では、差動遠心分離によるミトコンドリアの分離が文書化されています^が15,16,17、モバイルミトコンドリア生理学実験室法で使用される方法の簡単な概要を以下に説明します。

プロトコル

次のセクションでは、ミトコンドリアの実験室の方法について説明します。すべての動物の取り扱いと組織採取の手順は、オーバーン大学の施設動物管理および使用委員会(#2019-3582)によって承認されました。

1. データ収集に用いるバッファの説明

注:これらのバッファーは、固定ラボで調製し、フィールドトリップの前に移動ラボに移動できます(以下に特に記載がない限り)。

1. 表1に示すように、ウシ血清アルブミン(BSA)を含む骨格筋ミトコンドリア単離バッファーを調製します。
   1. 脂肪酸を含まないBSA 以外の 化学物質を脱イオン水(~90%の体積)に溶かします。緩衝液を温度が4°Cになるまで冷蔵庫に入れます。
   2. 温度を4°Cに保ちながら、溶液をpH7.5に調整します。
   3. 脂肪酸を含まないBSAを加え、体積を100%にします。溶液を50 mLのコニカルチューブに分注します。この溶液は、使用するまで-20°Cで保存してください。
2. 表1に示すように、BSAを含まない骨格筋ミトコンドリア分離バッファーを調製します。
   1. 化学物質を脱イオン水(~90%の体積)に溶かします。緩衝液を温度が4°Cになるまで冷蔵庫に入れます。
   2. 温度を4°Cに保ちながら、溶液をpH7.5に調整します。
   3. 音量を100%にします。溶液を50 mLのコニカルチューブに分注します。この溶液は、使用するまで-20°Cで保存してください。
3. 表1に示すように、骨格筋再懸濁バッファーを調製します。
   1. 化学物質を脱イオン水(~90%の体積)に溶かします。緩衝液を温度が4°Cになるまで冷蔵庫に入れます。
   2. 温度を4°Cに保ちながら、溶液をpH7.4に調整します。
   3. 音量を100%にします。溶液を50 mLのコニカルチューブに分注します。この溶液は、使用するまで-20°Cで保存してください。
4. 表2に示すように、骨格筋呼吸緩衝液を調製する。
   1. 脂肪酸を含まないBSA を除く 化学物質を脱イオン水(~90%の体積)に溶解します。緩衝液を温度が37°Cになるまで加熱します。
   2. 温度を37°Cに保ちながら、溶液をpH7.0に調整します。
   3. 脂肪酸を含まないBSAを加え、体積を100%にします。溶液を50 mLのコニカルチューブに分注します。この溶液は、使用するまで-20°Cで保存してください。
5. 表2に示すように呼吸基質を調製する。
   1. これらの基質は、データ収集当日に 100 mM Tris-HCl、pH 7.4 で新鮮に作ってください。使用するまで氷上に保管してください。
      注:提供された値は、ミトコンドリアが取り込むのに十分な基質のために十分に濃縮された溶液を作るためのものです。基質の最終濃度は、2 mM ピルビン酸、2 mM リンゴ酸、10 mM グルタミン酸、および 5 mM コハク酸です。

2. ミトコンドリア単離の実施(図2)

注:ミトコンドリア単離とミトコンドリア呼吸の測定は、移動式実験室の実験台エリアで行われ、特に断りのない限り、すべての溶液は4°Cに保つ必要があります。

1. 移動式実験室を平らな地面に駐車します。発電機をオンにして、車両を水平にします。スライドを伸ばし、機器をセットアップします。
2. 必要な量のバッファーを解凍します。
   注:一般的に、筋肉ごとに30 mLの骨格筋分離バッファーと10 mLのBSAなしの骨格筋分離バッファーが必要です。
3. ミトコンドリア呼吸チャンバーをセットアップし、メーカーの指示に従って、実験の希望の温度と現在の気圧に校正します。実験に用いるチャンバーについては、 材料表 を参照してください。
4. 首を切って動物を安楽死させます。
   注:現在の研究では、安楽死のために斬首が用いられている。二酸化炭素やイソフルランなどの一部のガスは、ミトコンドリア機能に影響を与えます18,19,20;これらの影響は、各研究の最良の安楽死方法を選択する際に考慮されるべきである。各研究でどの方法を実行すべきかは、尋ねられている科学的な質問によって決定されます。
5. 骨格筋を切除し、脂肪と結合組織をすばやく切り取り、体重を量り、BSA(少なくとも1/10 w / v)を含む骨格筋分離バッファーに筋肉を入れます(例:.、10 mLのバッファーに対して1 gの骨格筋)。
6. 氷の上でハサミで骨格筋をひじき切ります。
7. 切り取った5 mLのピペットチップを使用して、みじん切りにした組織を50 mLの遠心チューブに移します。ブレード( 材料表を参照)で50%の電力で5秒間均質化します。プロテアーゼ(5 mg/gの湿った筋肉)を加え、7分間消化し、30秒ごとに溶液を混合します。BSAと等量の単離バッファーを添加して反応を終了します。
8. ホモジネートを500 × g で10分間遠心分離します。上清を2層構造のチーズクロスに通し、カットした5 mLのピペットチップを使用して、清潔な50 mLの遠心チューブに移します。上清を3,500 × g で10分間遠心分離し、褐色ミトコンドリアペレットを沈殿させます。
9. 残りの上澄み液を注ぎます。BSAを含む同量の分離バッファーを遠心分離管に添加します。ミトコンドリアペレットを遠心分離管の壁からそっと離して、柔軟なスクレーパー(警官)でミトコンドリアペレットを再懸濁します。3,500 × g で10分間遠心分離します。
10. 残りの上澄み液を注ぎます。BSAを含まない同量の単離バッファーを遠心分離管に添加します。ミトコンドリアペレットを遠心分離管の壁からミトコンドリアペレットを清潔な警官でそっと取り除いて、ミトコンドリアペレットを再懸濁します。3,500 × g で10分間遠心分離します。
11. 上清をデカントし、ミトコンドリアペレットを再懸濁バッファーに再懸濁し、ミトコンドリアペレットを遠心分離管の壁から静かに取り除きます。
    注:再懸濁バッファーの量は、ミトコンドリアペレットのサイズによって異なります。
12. 再懸濁したミトコンドリアを、1 mLのピペットチップをカットしたDounceホモジナイザーに移します。Dounceホモジナイザーを使用して、懸濁液を4〜5パスで慎重に均質化します。
13. ミトコンドリア懸濁液をラベル付きの2 mL微量遠心チューブに入れ、別のカットされた1 mLピペットチップを使用します。

3. ミトコンドリア呼吸測定(図3)

1. 複合体I基質
   1. 945 μLの呼吸緩衝液をチャンバーに加えます。攪拌機が回転し、緩衝液の温度が37°Cに保たれていることを確認します。 データ収集の記録を開始します。
   2. 酸素濃度が安定したら、ミトコンドリアを20μL添加し、チャンバーに蓋をします。ソフトウェアでは、ミトコンドリアがチャンバーに追加されたことを示します。
   3. 1 mグルタミン酸10 μL、200 mMリンゴ酸10 μL、200 mMピルビン酸10 μLを個別のシリンジでチャンバーに加え、シグナルが安定するまで待ちます。ソフトウェアで、基板が追加されたことを示します。
      注:これらの基質は、通常、炭水化物による呼吸の測定に使用されます。脂肪による呼吸の測定に使用される基質の他の組み合わせについては、²¹を参照してください。
   4. 別のシリンジで 5 μL の ADP を添加し、急速な酸素消費量を観察します (状態 3)。ソフトウェアで、ADP が追加されたことを示します。
      注:添加されたADPのリン酸化後、酸素消費率は状態4に停滞します。
   5. 状態 4 のデータ収集から 4 分後、記録を終了します。データファイルを保存します。
2. 複合体II基板
   1. 963 μL の呼吸緩衝液をチャンバーに加えます。攪拌機が回転し、緩衝液の温度が37°Cに保たれていることを確認します。 データ収集の記録を開始します。
   2. 酸素濃度が安定したら、ミトコンドリアを20μL添加し、チャンバーに蓋をします。ソフトウェアでは、ミトコンドリアが溶液に添加されたことを示します。
   3. 2 μL の 4 μg/μL のロテノンと続いて 10 μL のコハク酸 500 mM を別々のシリンジを使用してチャンバーに加え、シグナルが安定するまで待ちます。ソフトウェアで、基板が追加されたことを示します。
   4. 別のシリンジを使用してADPを5 μL添加し、急激な酸素消費量を観察します(状態3)。ソフトウェアで、ADP が追加されたことを示します。
      注:添加されたADPのリン酸化後、酸素消費率は状態4に停滞します。
   5. 状態 4 のデータ収集から 4 分後、記録を終了します。データファイルを保存します。

結果

本稿では、移動式ミトコンドリア生理学実験室で、野生由来のMus musculus(n = 7、male = 5、female = 2、age = 1.30 ± 0.2歳)のミトコンドリア呼吸を調べたものです(図1)。骨格筋のミトコンドリア呼吸を測定するために、後肢全体、つまり有酸素性および嫌気性筋をミトコンドリアの分離に使用しました(図2)。ミトコンドリア呼吸の生データの例を図3に示します。図3Aおよび図3Bは、複雑なI駆動ミトコンドリア呼吸を表している。図3Aで観察された急な傾斜は、高い最大呼吸数を表しています。これは、詳細なデータ分析に使用される値です。後肢の骨格筋からのミトコンドリアの分離の成功は、急旋回と新しい斜面の安定化によって観察され、状態4を決定します...

ディスカッション

移動式ミトコンドリア生理学ラボでは、研究者がミトコンドリアを分離し、遠隔地での組織採取から2時間以内にミトコンドリア呼吸数を測定することができます。本研究で得られた結果は、AU MitoMobileで行われたミトコンドリア呼吸の測定値が、大学の研究室で行われた測定に匹敵することを示唆しています。具体的には、ここで示した野生由来のMus musculusの状態3、状態4、およびRCRの値は、同じ実験室などから以前に発表された結果と比較可能です(表3)^12,23。ただし、使用するマウス系統および方法が異なるため、これらの研究を直接比較することはできないことに留意すべきである。これらの結果は、この移動式ミトコンドリア生理学研究室におけるミトコンドリア呼吸測定の概念実証を示しています。

ミトコンドリアの分離と呼吸に必要なすべての化学物質と材料は、移動式ラボ内で輸送および保管できるため、実験のセットアップと実行時に簡単にアク...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1.7 mL 遠心分離管	VWR	87003-294
2.0 mL 遠心分離管	VWR	87003-298
50 mL 遠心分離管	VWR	21009-681	Nalgene Oak Ridge 遠心分離管
ADP	VWR	97061-104
ATP	VWR	700009-070
Bradford	VWR	7065-020
クリア96ウェルプレート	VWR	82050-760	Greiner Bio-One
Dounceホモジナイ	ザーVWR	22877-284	Corning
EGTA	VWR	EM-4100
濾紙			Hansatech OxyGraph
遊離脂肪酸BSA	VWR	89423-672
Glucose	VWR	BDH8005-500G
グルタミン酸	VWR	A12919
ハミルトンのシリンジVWR		60373-985	のガスライト1700シリーズシリンジ
Hansatech OxyGraph	Hansatechの器械株式会社		カタログ番号は、しかしプロダクトの下で見つけることができる -->電極制御単位
KH2PO4	VWR	97062-350
のマラレート	VWR	97062-140
Mannitol	VWR	97061-052
膜			Hansatech OxyGraph
MgCl に含まれる 2	VWR	97063-152
MOPS	VWR	80503-004
Policeman	VWR	470104-462
Polytron	Thomas Scientific	11090044
塩化カリウム(KCl)	VWR	97061-566
テアーゼ	VWR	97062-366	トリプシンが一般的に使用されていますが、他のプロテアーゼを使用することができます。
ピルビン酸	VWR	97061-448
ジチオン酸塩	VWR	AA33381-22
コハク酸	VWR	89230-086
糖	VWR	BDH0308-500G
トリスベース	VWR	97061-794
スHCl	VWR	97061-258