方法論記事

タンパク質分析のためのマウス網膜における光受容体細胞区画の単離のための2つの剥離方法

DOI：

10.3791/62977

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2021年12月7日

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1Zilkha Neurogenetic Institute, Keck School of Medicine, University of Southern California, 2Department of Cell & Neurobiology, Keck School of Medicine, University of Southern California

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルは、タンパク質分析のためにマウスの桿体光受容体の細胞内区画を単離するための2つの技術を提示する。第1の方法は、生きた網膜とセルロース濾紙を使用してロッドの外側セグメントを分離し、第2の方法は凍結乾燥された網膜と粘着テープを使用してロッドの内側と外側のセグメント層を剥離する。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

桿体光受容体は、異なる区画を有する高度に偏光された感覚ニューロンである。マウスの桿体は、長く(〜80μm)および薄く(〜2μm)、網膜の最外層である感光体層に横方向に充填され、類似の細胞下区画の位置合わせをもたらす。伝統的に、凍結したフラットマウント網膜の接線方向切片化は、異なる桿体区画内のタンパク質の動きおよび局在を研究するために使用されてきた。しかし、桿体優性マウス網膜の高い曲率は、接線切除を困難にする。コンパートメント間のタンパク質輸送の研究に動機づけられて、我々は、ウエスタンブロット用のロッド外側セグメント(ROS)および他の細胞下コンパートメントを確実に単離する2つの剥離方法を開発した。当社の比較的迅速かつ簡単な技術は、濃縮された細胞内特異的画分を提供し、正常な棒状体における重要な光受容体タンパク質の分布および再分布を定量的に測定する。さらに、これらの単離技術は、健康な網膜および変性網膜の両方内の他の細胞層のタンパク質組成を単離および定量的に調査するために容易に適合させることもできる。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

神経網膜の最外層にしっかりと詰め込まれた桿体視細胞は、薄暗い光の視覚の不可欠な部分です。忠実な光子カウンターとして機能するために、ロッドは、光変換と呼ばれるGタンパク質ベースのシグナル伝達経路を利用して、単一光子捕捉に対する迅速で増幅された再現可能な応答を生成する。光に対するこの応答は、最終的に原形質膜における電流の変化を引き起こし、その後、視覚系の残りの部分に信号を送る1。その名前が示すように、各桿体細胞は明確な棒状の形状を有し、外側セグメント(OS)、内側セグメント(IS)、細胞体(CB)、およびシナプス末端(ST)からなる高度に分極した細胞形態を示す。各細胞下区画には、特定のタンパク質機構(膜結合および可溶性)、生体分子的特徴、および視覚的光伝達、一般的なハウスキーピングおよびタンパク質合成、シナプス伝達などの重要な役割を果たすタンパク質複合体があります2,3。

30年以上前、細胞内タンパク質、特にトランスデューシン(OSから離れる)とアレスチン(OSに向かう)の光依存的な相互運動が最初に観察されました4,5,6,7。早い段階で、この観察された現象は、エピトープマスキングに対する免疫組織化学の脆弱性のために、懐疑的に受け止められました8。2000年代初頭、刺激依存性のタンパク質転座は、厳格で困難な物理的切片技術を用いて確認された9。凍結したフラットマウントげっ歯類網膜の連続接線切片化とそれに続くイムノブロッティングにより、トランスデューシン9、10、アレステイン11、12、およびrecoverin13はすべて、光に応答して細胞内再分布を受けることが明らかになった。これらの重要なシグナル伝達タンパク質の光駆動転座は、光変換カスケードの感受性を調節するだけでなく9,14,15だけでなく、光損傷に対する神経保護も可能であると考えられている16,17,18。桿体における光駆動タンパク質輸送は、桿体細胞の生物学および生理学にとって非常に重要であるように思われるので、タンパク質分布を決定するために異なる細胞内区画の単離を可能にする技術は貴重な研究ツールである。

現在、桿体細胞下区画を単離することを目的としたいくつかの方法がある。しかしながら、これらの方法は、長くて再現が困難であり得るか、またはかなりの量の網膜分離物を必要とする。ロッドアウターセグメント(ROS)調製物は、密度勾配遠心分離19を介して、例えば、網膜ホモジネートからROSを分離するために一般的に使用される。この方法はウェスタンブロットに広く使用されているが、この手順は非常に時間がかかり、最低8〜12匹のマウス網膜20を必要とする。一方、凍結マウスおよびラット網膜の直列接線切片化は、OS、IS、CB、およびST9、11、13を単離する際に首尾よく実施されている。しかし、この方法は、接線切除の前に網膜層を整列させるために、小さくて高度に湾曲したマウス網膜を完全に平坦化する必要があるため、技術的に困難である。視覚系の疾患を再現するマウスモデルやトランスジェニックマウスは数多く存在するため、個々の桿体コンパートメントを確実に、迅速に、そして容易に分離する技術の創出は、各特殊なコンパートメントで起こる生理学的プロセスと、健康および疾患における視覚プロセスの根底にあるメカニズムを明らかにする上で有望である。

これらの調査を容易にするために、我々は、現在のプロトコルよりも容易に桿体細胞下区画を分離する2つの剥離方法を説明する。第1の剥離方法は、パッチクランプ記録21のために蛍光標識されたバイポーラ細胞を露出させる技術から適合し、セルロース濾紙を使用して、生きた単離されたマウス網膜からROSを順次除去する(図1)。第2の方法は、chick22およびfrog23網膜から3つの一次網膜細胞層を単離する手順から適合し、粘着テープを使用して凍結乾燥網膜からROSおよび桿体内部セグメント(RIS)を除去する(図2)。どちらの手順も1時間で完了でき、かなりユーザーフレンドリーです。我々は、C57BL/6Jマウスからの暗適応および光曝露網膜を利用して、ロッドトランスデューシン(GNAT1)およびアレスチン(ARR1)の光誘発転座を実証することによって、ウェスタンブロットに対するこれら2つの分離プロトコルの有効性の検証を提供する。さらに、テープ剥離法を用いて、我々の技術が免疫細胞化学(ICC)によって取得されたタンパク質局在データとウェスタンブロットとの間の不整合を調べ、対処するために使用することができるという追加の証拠を提供する。具体的には、我々の技術は、1)プロテインキナーゼC-α(PKCα)アイソフォームが双極性細胞だけでなく、マウスROSおよびRISにも低濃度ではあるが24,25存在し、2)ロドプシンキナーゼ(GRK1)が単離されたOSサンプル中に主に存在することを示した。これらのデータは、特定のロッドタンパク質とレチナールタンパク質を分離および定量するための2つの剥離技術の有効性を示しています。

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プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

すべての実験は、南カリフォルニア大学(USC)の研究動物ケア委員会の現地機関のガイドラインに従って実施された。

1. 生細胞網膜剥離法

  1. エイムズのバッファーの準備、紙剥がし、解剖皿
    1. 鈍い先端の虹彩はさみ(または同等のはさみタイプ)を使用して、セルロースろ紙(グレード413)を約5mm x 2.5mmの長方形に切ります。将来の使用のために挿し木を保管してください。
    2. エイムズのミディアム、2.38 g HEPES、および0.877 gのNaClのボトルを組み合わせて、エイムズのHEPESバッファー1 Lを準備します。滅菌ガラス瓶に試薬を蒸留超純水で溶解し、浸透圧およびpHをそれぞれ280mOsmおよび7.4に調整する。フィルター(孔径0.2 μm)を滅菌し、蓋をパラフィンフィルムで密封し、4°Cで保存した。
    3. エイムズの培地の1本のボトルと1.9gのNaHCO3を組み合わせて、エイムズの重炭酸塩緩衝液1Lを調製する。滅菌ガラス瓶に試薬を蒸留超純水で溶解し、浸透圧およびpHをそれぞれ280mOsmおよび7.4に調整する。フィルター(孔径0.2 μm)を滅菌し、蓋をパラフィンフィルムで密封し、4°Cで保存した。
      注:エイムズのHEPESおよびエイムズの重炭酸塩緩衝液は、事前に調製し、4°Cで1週間保存することができます。
    4. 35 x 10 mmのペトリ皿の底に、メス(ブレード番号11、40 mm)で格子または市松模様を作成します。
      注:ペトリ皿のテクスチャー加工された底部は、網膜解剖中に孤立した自由に浮遊する眼を所定の位置に保持する。
  2. 網膜の解剖
    メモ: この手順では、バッファを室温(RT)に持ち込んで室温(RT)に保持する必要があります。解剖中は、エイムズの重炭酸塩バッファーを15分ごとに新鮮な炭水化エイムズの重炭酸塩バッファーでリフレッシュします。これは必要な生理学的pHを維持する。
    1. 解剖の約15〜20分前に、チューブキャップアダプタを備えた100mL実験室または培地ボトルでエイムズのHEPES緩衝液を酸素化し、組織インキュベーションチャンバおよびチューブキャップアダプタを備えた100mL実験室または培地ボトル内でエイムズの重炭酸塩緩衝液を95%O2および5 %CO2 で泡立てる。
    2. C57BL/6Jマウス(生後2~3ヶ月)の両性を同数、イソフルラン吸入または二酸化炭素(CO2)による安楽死、続いて子宮頸部脱臼のいずれかを行う。湾曲したハサミで目を核形成し、泡立てたエイムズの重炭酸塩緩衝液で満たされたテクスチャー加工された35 x 10 mmのペトリ皿に目を置きます。
    3. 角膜 - 辺縁部の穴を18G針で穿刺して、アイカップ(図1A)を作成します。微小解剖虹彩はさみを使用してこの接合部の周囲に沿って切断し、各眼の角膜を除去した。ピンセットを使ってレンズと硝子体液を各目から離し、捨てます。
    4. 網膜色素沈着上皮(RPE)-強膜-脈絡膜複合体を神経網膜から慎重に剥離することによって、眼杯から網膜を単離する。RPE-強膜-脈絡膜複合体を破棄する。解剖中に網膜が損傷していないことを確認するために、縁だけを扱います。
    5. ワイドボアトランスファーピペットを使用して、分離した網膜を、泡立てたエイムズの重炭酸塩緩衝液で満たされた60 x 15 mmディッシュの蓋に移します。
    6. 半球状の網膜を凹面上に向け(視細胞は皿の底に向かって下を向いている)、虹彩はさみまたはメス(刃番号10、40mm)を使用して各網膜を(視神経を通して)二分する。各半網膜の湾曲したエッジをトリミングして、2つの長方形を作成します(図1A)。
      注:半分になった各網膜の曲率を最小限に抑えると、その後の剥離ステップで網膜がよりよく平坦になり、桿体外側セグメント(ROS)層の正確な剥離が生成されます。
    7. 半分になった網膜を、95%O2 および5%CO2で連続的にバブリングされた組織インキュベーションチャンバーに保管する。
      注:単離された網膜は、炭化エイムズの重炭酸塩緩衝液に約24時間保持することができます。
  3. ろ紙剥離によるロッドアウターセグメント(ROS)回収
    注:剥離プロセス中にRT酸素化エイムズのHEPESバッファーを15〜20分ごとにリフレッシュして、必要な生理学的pHを維持します。
    1. 1つの網膜長方形を、広い口径の転写ピペットと5 mm x 2.5 mmのろ紙で組織チャンバーから、100% O2で泡立てたエイムズのHEPESバッファーで満たされた35 x 10 mmのペトリ皿に移します。
    2. 仕切られた網膜を凹ませ、感光体が皿の底に向かって下を向いていることを確認します。半分になった網膜の側面をピンセットで軽くつかみ、ろ紙の上に動かします。網膜がろ紙の中央に収まったら、半分になった網膜がろ紙に触れるようにろ紙を上方に動かして、ROSとろ紙間の接着を作成します(図1B)。
      メモ:感光層がろ紙と直接接触していることを確認してください。
    3. 網膜が付着したろ紙をエイムズのHEPESバッファーから慎重に持ち上げます。ろ紙の底面側(網膜のない側)をペーパータオルの上に置き、2~3回軽く叩いて乾かします(図1B)。
    4. 網膜のあるろ紙の側面にエイムズのHEPESを一滴加えます。今説明したように、ペーパータオルの上にろ紙を再び置いて乾かします。このプロセスをさらに 2 回繰り返します。
    5. 網膜の入ったろ紙をペトリ皿に戻します。ピンセットを使用して、半分になった網膜のすべての端をゆっくりと押し上げ、すべての側面のろ紙から離します。
    6. 網膜をろ紙から繊細に剥がします。剥離プロセス中に網膜の極端な周囲のみに触れて、網膜の構造的完全性を維持します。
    7. ペトリ皿からろ紙を持ち上げ、ペーパータオルの余分な液体を取り除きます。網膜に接触していた側がペーパータオルに接触していないことを確認してください。
    8. 部分ROS層を含むろ紙を氷上のラベル付きチューブに入れます(図1B)。剥離した網膜をエイムズのHEPESバッファーに浸してください。
    9. この半分になった網膜の剥離工程を約7~8回繰り返し、ROS層全体を除去します。各剥離の後、濾紙を同じチューブに入れ、1つの半分の網膜から単離されたROSを含む。
      注:このプロセス中に網膜が薄くなるため、半分になった網膜をろ紙から剥がすときは引き裂かないように注意してください。
    10. 分離された ROS のすべてのろ紙皮を含むチューブを氷の上に置き、すぐに使用するか、ドライアイス上で直接凍結させて -80 °C で保存します。
    11. ピンセットを使用して、剥離した残りの網膜(ROSが欠けている)を適切なラベルの付いたチューブに移します。チューブを氷の上に置き、すぐに使用するか、ドライアイスで凍結して -80 °C で保存します。
    12. 半分に切った網膜ごとに剥離工程を繰り返し、各チューブを正確にラベル付けします。

凍結乾燥網膜剥離法

  1. バッファー、剥離媒体、解剖皿の準備、凍結乾燥機のセットアップ
    1. 1Lの保存ボトルに、500mLの蒸留超純水を加えてリンゲル溶液を調製する。試薬を溶解して、最終濃度 130 mM NaCl、3.6 mM KCl、2.4 mM MgCl2、1.2 mM CaCl2、10 mM HEPES、および 0.02 mM EDTA に達するようにします。NaOHでpHを7.4に調整し、超純水を加えて最終体積を1Lにし、オスモル濃度を313mOsmに調整します。
    2. 使用前に、リンゲル溶液を滅菌フィルター(孔径0.2μm)でろ過し、蓋をパラフィンフィルムで密封し、4°Cで保存してください。
    3. 鈍い先端の虹彩はさみ(または同等のはさみタイプ)を使用して、セルロースろ紙を約5mm x 2.5mmの長方形に切ります。鉛筆を使ってろ紙の片面に書き、ユニークなラベルを作成します。
    4. メス(刃番号11、40mm)を使用して、35 x 10 mmのペトリ皿の底に格子または市松模様を作成します。
    5. 製造元の仕様に従って凍結乾燥機の電源を入れます。
    6. デュワーフラスコまたは同様の絶縁性真空フラスコで液体窒素を取得します。
  2. 網膜解剖
    1. プロトコルのセクション1(図1A)に記載されているように網膜解剖を完了します。エイムズのバッファーの代わりにコールドリンガーの溶液を使用してください。
    2. 解剖後、半分の長方形の網膜を冷たいリンゲル溶液で満たされた35 x 10 mmのペトリ皿に保管し、氷の上に置きます。
  3. 凍結乾燥のための網膜サンプル調製
    1. 5 x 2.5 mmのろ紙を置き、半分にした網膜を冷たいリンガーのバッファーで満たされたテクスチャー加工された35 x 10 mmのペトリ皿に移します。ワイドボアトランスファーピペットを使用して、各網膜を皿間で移動させます。
    2. ピンセットを使用して、網膜が凹状になるように慎重に裏返し(感光体が上を向いています)、ろ紙の上に載るように動かします(図2A)。
      注:感光体がろ紙に接触していないこと(網膜神経節細胞層がろ紙と直接接触している必要があります)、および固有のラベルが表示されていることを確認してください。網膜分離株を簡単かつ迅速に同定するには、独自のラベルをろ紙の下側に配置することをお勧めします。
    3. 半分になった網膜がろ紙に触れるようにろ紙の端を上方に持ち上げ、リンゲルの溶液からろ紙を持ち上げて取り出します。
    4. ろ紙の底面(網膜が付いていない側)をペーパータオルの上に置き、2~3回丁寧に軽くたたいて余分な液体を取り除きます(図2A)。
    5. ピンセットでろ紙を拾い上げ、網膜のあるろ紙の側面に冷たいリンガーの滴を加えます。ペーパータオルの上にろ紙を再び置き、余分な液体を取り除きます。このプロセスをさらに 2 回繰り返します。
      注:これらの交互の濡れと乾燥のステップは、組織がろ紙にしっかりと付着していることを保証します。
    6. 付着した各網膜/ろ紙サンプルを、すべてのサンプルを凍結する準備ができるまで、冷たいリンガーで満たされたペトリ皿に保管してください。すべての半分の網膜についてこのプロセスを繰り返します。
    7. 清潔で乾燥した35 x 10 mmのペトリ皿(底のみ)と3.5 x 3.5インチの正方形にカットされたアルミホイルを手に入れます。
    8. ピンセットで冷たいリンガーのバッファーから各サンプルを持ち上げます。ピンセットがろ紙の端だけに接触し、網膜が半分になるのを避けてください。
    9. 各ろ紙の底面(網膜がない側)をペーパータオルの上に置き、余分な液体を取り除きます。
    10. 網膜が付着しているろ紙の側面に冷たい1x PBS(137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na2HPO4、2 mM KH2PO4、pH 7.4)を滴下します。ペーパータオルにろ紙を塗り、余分な液体を取り除きます。
      メモ:凍結する前に、ろ紙の水分が十分に除去されていることを確認してください。
    11. すべてのろ紙片を35 x 10 mmのペトリ皿に入れます。糸くずの出ないティッシュペーパーを使用して、ろ紙を囲む余分な液体を吸い取ります。
      注:サンプルでペトリ皿を混雑させないでください。4つ以上のマウスの目を使用する場合は、網膜/ろ紙のサンプルを保持するために、より大きなペトリ皿または複数の小さなペトリ皿を使用することを検討してください。
    12. 皿全体をアルミホイルでしっかりと包みます。アルミホイルの端が固定され、ペトリ皿の底にスムーズに押し込まれていることを確認します。アルミホイルの蓋に0.1~0.2mmの穴を数個穿刺します(図2A)。
    13. 金属トングを用いて、アルミ箔で覆われたシャーレを液体窒素中に徐々に下げる。凍結乾燥の準備が整うまで、サンプルを液体窒素(<10分)に保管してください。
  4. 凍結 乾燥
    1. アルミホイルで覆われたペトリ皿を凍結乾燥フラスコに入れ、製造業者のプロトコルに従って凍結乾燥機に取り付ける。網膜を30分間凍結乾燥する。
    2. フラスコを凍結乾燥機から取り外し、製造元に応じて機械を遮断します。
    3. アルミホイルを取り出し、凍結乾燥したサンプルを同じ日に処理するか、適切にラベル付けされた1 mLマイクロ遠心チューブに保管してください。これらのチューブを無水乾燥剤で満たされた容器(50mL円錐管など)に入れ、サンプルを-80°Cで保存する。
  5. ロッド外側と内側のセグメントは粘着テープ剥離による収集。
    1. 透明な粘着テープ(1〜2cm)のストリップをカットし、テープディスペンサー/ラボベンチなどの端にストリップを保管して、すばやく使用できるようにします。
    2. 1つの網膜サンプルをプラスチック製の60 x 15 mmペトリ皿の蓋に移動して剥離します。ろ紙の最外縁だけをつかみ、網膜に触れないようにしてください。
    3. 鈍い先端の虹彩はさみ(または同等のはさみタイプ)を使用して、組織のおおよそのサイズ(1.5 x 2.5 mm)に小さな長方形のテープを切断します。
    4. 凍結乾燥網膜の上に小さなテープを慎重に置き(図2B)、ピンセットでわずかな圧力をかけて、感光層(オレンジ/ピンク色の最上層)と接着することを確認します。
    5. テープをゆっくりとはがします。ロッドアウターセグメント(ROS)とロッドインナーセグメント(RIS)の両方がテープに接着されます(図2B)。
    6. 破断面に薄い白い膜があることを確認します。これは、RISを分離し、別のテープを置 RIS.To、テープを破断面に押し下げることです(図2B)。
      メモ:薄い白い層全体を取り外すには、複数のテープが必要になる場合があります。
    7. オレンジ/ピンクの層だけを含むテープを、+ROSとラベルの付いた微量遠心管に入れます。
    8. 薄い白い層が付いたテープを、+RISとラベルの付いた微量遠心管に入れます。
      注:凍結乾燥された網膜をテープで分離するには練習が必要です。テープに加えられる圧力の量は、凍結乾燥されたサンプルがどのように分画されるかに影響します。サンプル上のテープに過度の圧力がかかると、凍結乾燥された網膜全体がろ紙を剥がし、テープにくっつきます。テープに加える圧力が少なすぎると、オレンジ/ピンクの最上層(+ROS)がテープにくっつきません。
    9. ろ紙上に位置する残りの網膜組織(ROS層とRIS層を失った、-OIS)をテープを用いてろ紙から厚く白い層を剥がして集める。分離液を -OIS とラベルの付いたチューブに入れます。
    10. 半分にした網膜サンプルごとにこれらの手順を繰り返します。
    11. 凍結乾燥網膜から単離した層を、タンパク質定量、ゲル電気泳動、およびタンパク質イムノブロットを同じ日に行う場合は室温で保存するか、後で使用するために-80°Cの無水乾燥剤を充填した容器(50mL円錐管など)に保管する。

3. 剥離単離のためのウェスタンブロットサンプル調製

  1. RIPA溶解バッファーの調製
    1. 100 mL の保存ボトルに試薬を加え、終濃度 50 mM トリス塩酸 pH 7.4、150 mM NaCl、1% トリトン X-100、1% デオキシコール酸ナトリウム、0.1% SDS、および 1 mM EDTA を得た。脱イオンした超純水100mLを加え、よく混ぜる。
      注:RIPA溶解緩衝液は、2〜8°Cで2〜3週間保存することができる。より長い保存のために、アリコートして-20°Cの冷凍庫に保管してください。
    2. 実験当日、プロテアーゼ阻害剤カクテル(0.1M PMSF、1:1000アプロチニン、1:1000ロイペプチン)をRIPA溶解バッファーに加え、氷上に保管する。
  2. ウェスタンブロット用濾紙剥離溶解液調製
    1. ろ紙の皮と剥がれた残りの網膜を含むチューブが氷上に維持されていることを確認するか(同日の実験用)、-80°Cの冷凍庫保管から取り出して氷上に置きます。
    2. ろ紙が剥がれた微量遠心管の底部から余分な液体を取り除きます。ミニ遠心分離機で2〜4秒間素早く回転させ、残りの液体を捨てます。
    3. 45~55 μLの冷RIPA緩衝液を濾紙を含むチューブにピペットで分離する。
    4. 各サンプルを清潔なオートクレーブ処理乳棒ミキサーで1分間均質化します。ろ紙が乳棒ミキサーに接触していることを確認します。ろ紙は、各チューブの底面ではなく側面に保管してください。
    5. ピンセットで、ろ紙を各チューブの側面に移動し、ミニ遠心分離機で2〜4秒間回転させます。これにより、ろ紙からRIPAバッファーが除去されます。
    6. 乾燥したろ紙を取り出し、必要に応じて各チューブ内のすべてのろ紙について繰り返します。
    7. ホモジネートを新しいチューブに移し、適切にラベル付けします。
      注:これは最も時間のかかるステップであり、適切に完了しないと、サンプルの大部分がろ紙に吸収されます。
    8. 60-80 μLの冷たいRIPA緩衝液を個々のチューブにピペットし、残りの剥離した網膜を入れた。
    9. 各サンプルを清潔なオートクレーブ処理乳棒ミキサーで1分間均質化します。
  3. ウェスタンブロットのためのテープ剥離ライセート調製
    1. RT凍結乾燥サンプルまたは-80°Cサンプルを氷上に置く。
    2. +ROSおよび+RISを含む各チューブに50〜70μLの冷たいRIPA緩衝液のピペットが剥がれる。
    3. 残りの凍結乾燥網膜を含む-OISチューブに60〜80μLの冷溶解緩衝液をピペットし、ROSおよびRISを除去した。
    4. 各サンプルを清潔な乳棒ミキサーで1分間均質化します。個々のチューブ内のテープが乳棒ミキサーおよび溶解バッファーに接触していることを確認します。
    5. 滅菌ピンセットで、テープをチューブの側面に移動し、ミニ遠心分離機で2〜4秒間回転させます。これにより、テープから液体が除去されます。乾燥したテープをチューブから取り出します。
      注:この時点で、ビシンコニン酸アッセイ(BCA)を実行するのに十分な体積を確保するために、「ろ紙剥離」または「テープ剥離」法のいずれかのために、同じ網膜からの2つの半網膜分離株を組み合わせることができます。

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結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本戦略は、ウェスタンブロット分析のために特定の桿体細胞下区画間のタンパク質を単離および分析するための比較的迅速かつ簡単な方法を提供するために開発された。我々は、2つの逐次剥離技術(図1および図2)に続いてイムノブロッティングを適用し、これらの方法を使用して、暗適応動物および光適応動物の両方におけるロッドトランスデューシン(GNAT1)およびアレスチン(ARR1)の既知の分布を確実に検出できることを実証した。他の細胞層からの汚染なしに桿体細胞下区画を正確に単離する上での我々の2つのプロトコルの有効性を検証するために、イムノブロットはシトクロムC(Cyt C)、アクチン、およびGß5S/Gß5L26に対する抗体でプローブされた。使用した抗体および希釈液のリストを表1に示します。Cyt Cおよびアクチンは、近位網膜には豊富なタンパク質であるがROSには存在しないため、ROS純度を示した。GNAT127のGTPase活性化タンパク質(GAP)の成...

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ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

多くの網膜疾患は桿体視細胞に影響を及ぼし、桿体死、そして最終的には完全な視力喪失につながります37。ヒト網膜変性の遺伝的および機械的起源のかなりの部分は、長年にわたって多数のマウスモデルで首尾よく再現されてきた。その文脈において、個々の桿体細胞下区画を小さなマウス網膜から容易かつ選択的に分離する能力は、網膜疾患の局在する生化学的および分子的基盤の理解を大幅に強化するであろう。さらに、神経網膜の層状の性質は、桿体光受容体のユニークで高度に偏光された配置と相まって、選択的剥離による桿体区画の単離を可能にする。この原稿は、イムノブロッティングのために桿体視細胞の個々の細胞下区画を単離するために使用される2つのプロトコールを記述する。どちらの方法も、既存の接線方向断面法9と比較してかなり高速で技術的に困難ではないだけでなく、密度勾配を使用したROSの一般的な生化学的単離よりもサンプルサイズも大幅に小さくする必要があります19。このようなROS勾配精製技術は、十分なROSを確実に回収するために8〜10匹の...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らは、競合する利害関係はないと宣言している。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この作業は、NIH Grant EY12155、EY027193、およびEY027387からJCへの支援を受けました。原稿の校正をしてくれたSpyridon Michalakis博士(米国パサデナ州Caltech)とNatalie Chen氏(USC、米国ロサンゼルス)に感謝しています。また、著者が提供した映像を収集するために必要な機器を提供してくれたSeth Ruffins博士(USC、米国ロサンゼルス)とJanos Peti-Peterdi博士(USC、米国ロサンゼルス)にも感謝します。出典:Kasey Roseら、タンパク質分析のためのマウス網膜における視細胞区画の分離、分子神経変性、出版[2017]、[Springer Nature]。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
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チューブキャップアダプターを装備した100mLラボ用またはメディアボトルN/AN/A
100% O2タンクN/AN/A
1000mLボトルトップフィルター、PESフィルター素材、0.22 μmジェネシー サイエンティフィック25-235
4X SDS サンプルバッファーミリポア シグマ70607-3
50 mL ファルコン チューブフィッシャー サイエンティフィック14-432-22
95% O2 and 5% CO2 タンクN/AN/A
Ames'L-グルタミンを含む中程度、重炭酸塩なしSigma-AldrichA1420
CaCl2 (99%、二水和物)SigmaC-3881
Drierite (無水硫酸カルシウム、>98% CaSO4、>2% CoCl2)WA Hammond Drierite Co Ltd21005
Falcon Easy-Grip Petri Dish (ポリスチレン、35 x 10 mm)Falcon-Corning08-757-100A
ファルコン イージーグリップ ティッシュ培養ディッシュ (60 x 15 mm)ファルコンコーニング08-772F
フェザーメス (No.10 40 mm)VWR100499-578
フェザーメス (No.11 40 mm)VWT100499-580
KCl (99%)SigmaP-4504
キンブル コンテス ペレット 乳棒Σz359971
Labconco 急速凍結フラスコLabconcoN/A
LN2 (液体窒素) + デュワーフラスコまたは類似の真空フラスコN/AN/A
MgCl2SigmaM-9272
Milli-Q/脱イオン水EMD MilliporeN/A
Na2HPO4 (粉末))J.T. Baker4062-01
NaCl (crystal)EMD MilliporeSx0420-3
NaHCO3Amresco0865
OmniPur EDTAEMD4005
OmniPur HEPES, 遊離酸EMD5320
パラフィルム MSigma-AldrichP7793
レイノルズラップアルミホイルレイノルズブランドN/A
スコッチマジックテープ (12.7 mm x 32.9 m)スコッチ-3MN/A
デオキシコール酸ナトリウムSigma-AldrichD67501
Spectrafuge ミニ遠心分離機Labnet International, IncC1301
組織インキュベーションチャンバー(購入またはカスタムメイド)N/AN/A
Tris-HClJ.T.Baker4103-02
Triton X-100Signma-AldrichT8787
VirTis 卓上型 2K 凍結乾燥機または同等の機械SP ScientificN/A
VWR Grade 413 Filer Paper (diameter 5.5 cm, pore size 5 μm)VWR28310-015
Whatman Grade 1 Qualitative Filter Paper (直径 9 cm、細孔サイズ 11 μm)Whatman/GE Healthcare1001-090
広口径トランスファーピペット、Global ScientificVWR76285-362

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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