このプロトコルは、タンパク質分析のためにマウスの桿体光受容体の細胞内区画を単離するための2つの技術を提示する。第1の方法は、生きた網膜とセルロース濾紙を使用してロッドの外側セグメントを分離し、第2の方法は凍結乾燥された網膜と粘着テープを使用してロッドの内側と外側のセグメント層を剥離する。
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この記事について
サマリー
要約
桿体光受容体は、異なる区画を有する高度に偏光された感覚ニューロンである。マウスの桿体は、長く(〜80μm)および薄く(〜2μm)、網膜の最外層である感光体層に横方向に充填され、類似の細胞下区画の位置合わせをもたらす。伝統的に、凍結したフラットマウント網膜の接線方向切片化は、異なる桿体区画内のタンパク質の動きおよび局在を研究するために使用されてきた。しかし、桿体優性マウス網膜の高い曲率は、接線切除を困難にする。コンパートメント間のタンパク質輸送の研究に動機づけられて、我々は、ウエスタンブロット用のロッド外側セグメント(ROS)および他の細胞下コンパートメントを確実に単離する2つの剥離方法を開発した。当社の比較的迅速かつ簡単な技術は、濃縮された細胞内特異的画分を提供し、正常な棒状体における重要な光受容体タンパク質の分布および再分布を定量的に測定する。さらに、これらの単離技術は、健康な網膜および変性網膜の両方内の他の細胞層のタンパク質組成を単離および定量的に調査するために容易に適合させることもできる。
概要
神経網膜の最外層にしっかりと詰め込まれた桿体視細胞は、薄暗い光の視覚の不可欠な部分です。忠実な光子カウンターとして機能するために、ロッドは、光変換と呼ばれるGタンパク質ベースのシグナル伝達経路を利用して、単一光子捕捉に対する迅速で増幅された再現可能な応答を生成する。光に対するこの応答は、最終的に原形質膜における電流の変化を引き起こし、その後、視覚系の残りの部分に信号を送る1。その名前が示すように、各桿体細胞は明確な棒状の形状を有し、外側セグメント(OS)、内側セグメント(IS)、細胞体(CB)、およびシナプス末端(ST)からなる高度に分極した細胞形態を示す。各細胞下区画には、特定のタンパク質機構(膜結合および可溶性)、生体分子的特徴、および視覚的光伝達、一般的なハウスキーピングおよびタンパク質合成、シナプス伝達などの重要な役割を果たすタンパク質複合体があります2,3。
30年以上前、細胞内タンパク質、特にトランスデューシン(OSから離れる)とアレスチン(OSに向かう)の光依存的な相互運動が最初に観察されました4,5,6,7。
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プロトコル
すべての実験は、南カリフォルニア大学(USC)の研究動物ケア委員会の現地機関のガイドラインに従って実施された。
1. 生細胞網膜剥離法
- エイムズのバッファーの準備、紙剥がし、解剖皿
- 鈍い先端の虹彩はさみ(または同等のはさみタイプ)を使用して、セルロースろ紙(グレード413)を約5mm x 2.5mmの長方形に切ります。将来の使用のために挿し木を保管してください。
- エイムズのミディアム、2.38 g HEPES、および0.877 gのNaClのボトルを組み合わせて、エイムズのHEPESバッファー1 Lを準備します。滅菌ガラス瓶に試薬を蒸留超純水で溶解し、浸透圧およびpHをそれぞれ280mOsmおよび7.4に調整する。フィルター(孔径0.2 μm)を滅菌し、蓋をパラフィンフィルムで密封し、4°Cで保存した。
- エイムズの培地の1本のボトルと1.9gのNaHCO3を組み合わせて、エイムズの重炭酸塩緩衝液1Lを調製する。滅菌ガラス瓶に試薬を蒸留超純水で溶解し、浸透圧およびpHをそれぞれ280mOsmおよび7.4に調整する。フィルター(孔径0.2 μm)を滅菌し、蓋をパラフィンフィルムで密封し、4°Cで保存した。
注:エイムズのHEPESおよびエイムズの重炭酸塩緩衝液は、事前に調製し、4°Cで1週間保存することができます。 - 3....
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結果
本戦略は、ウェスタンブロット分析のために特定の桿体細胞下区画間のタンパク質を単離および分析するための比較的迅速かつ簡単な方法を提供するために開発された。我々は、2つの逐次剥離技術(図1および図2)に続いてイムノブロッティングを適用し、これらの方法を使用して、暗適応動物および光適応動物の両方におけるロッドトランスデューシン(GNAT1)およびアレスチン(ARR1)の既知の分布を確実に検出できることを実証した。他の細胞層からの汚染なしに桿体細胞下区画を正確に単離する上での我々の2つのプロトコルの有効性を検証するために、イムノブロットはシトクロムC(Cyt C)、アクチン、およびGß5S/Gß5L26に対する抗体でプローブされた。使用した抗体および希釈液のリストを表1に示します。Cyt Cおよびアクチンは、近位網膜には豊富なタンパク質であるがROSには存在しないため、ROS純度を示した。GNAT127のGTPase活性化タンパク質(GAP)の成.......
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ディスカッション
多くの網膜疾患は桿体視細胞に影響を及ぼし、桿体死、そして最終的には完全な視力喪失につながります37。ヒト網膜変性の遺伝的および機械的起源のかなりの部分は、長年にわたって多数のマウスモデルで首尾よく再現されてきた。その文脈において、個々の桿体細胞下区画を小さなマウス網膜から容易かつ選択的に分離する能力は、網膜疾患の局在する生化学的および分子的基盤の理解を大幅に強化するであろう。さらに、神経網膜の層状の性質は、桿体光受容体のユニークで高度に偏光された配置と相まって、選択的剥離による桿体区画の単離を可能にする。この原稿は、イムノブロッティングのために桿体視細胞の個々の細胞下区画を単離するために使用される2つのプロトコールを記述する。どちらの方法も、既存の接線方向断面法9と比較してかなり高速で技術的に困難ではないだけでなく、密度勾配を使用したROSの一般的な生化学的単離よりもサンプルサイズも大幅に小さくする必要があります19。このようなROS勾配精製技術は、十分なROSを確実に回収するために8〜10匹の.......
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開示事項
著者らは、競合する利害関係はないと宣言している。
謝辞
この作業は、NIH Grant EY12155、EY027193、およびEY027387からJCへの支援を受けました。原稿の校正をしてくれたSpyridon Michalakis博士(米国パサデナ州Caltech)とNatalie Chen氏(USC、米国ロサンゼルス)に感謝しています。また、著者が提供した映像を収集するために必要な機器を提供してくれたSeth Ruffins博士(USC、米国ロサンゼルス)とJanos Peti-Peterdi博士(USC、米国ロサンゼルス)にも感謝します。出典:Kasey Roseら、タンパク質分析のためのマウス網膜における視細胞区画の分離、分子神経変性、出版[2017]、[Springer Nature]。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| チューブキャップアダプターを装備した100mLラボ用またはメディアボトル | N/A | N/A | |
| 100% O2タンク | N/A | N/A | |
| 1000mLボトルトップフィルター、PESフィルター素材、0.22 μm | ジェネシー サイエンティフィック | 25-235 | |
| 4X SDS サンプルバッファー | ミリポア シグマ | 70607-3 | |
| 50 mL ファルコン チューブ | フィッシャー サイエンティフィック | 14-432-22 | |
| 95% O2 and 5% CO2 タンク | N/A | N/A | |
| Ames'L-グルタミンを含む中程度、重炭酸塩なし | Sigma-Aldrich | A1420 | |
| CaCl2 (99%、二水和物) | Sigma | C-3881 | |
| Drierite (無水硫酸カルシウム、>98% CaSO4、>2% CoCl2) | WA Hammond Drierite Co Ltd | 21005 | |
| Falcon Easy-Grip Petri Dish (ポリスチレン、35 x 10 mm) | Falcon-Corning | 08-757-100A | |
| ファルコン イージーグリップ ティッシュ培養ディッシュ (60 x 15 mm) | ファルコンコーニング | 08-772F | |
| フェザーメス (No.10 40 mm) | VWR | 100499-578 | |
| フェザーメス (No.11 40 mm) | VWT | 100499-580 | |
| KCl (99%) | Sigma | P-4504 | |
| キンブル コンテス ペレット 乳棒 | Σ | z359971 | |
| Labconco 急速凍結フラスコ | Labconco | N/A | |
| LN2 (液体窒素) + デュワーフラスコまたは類似の真空フラスコ | N/A | N/A | |
| MgCl2 | Sigma | M-9272 | |
| Milli-Q/脱イオン水 | EMD Millipore | N/A | |
| Na2HPO4 (粉末)) | J.T. Baker | 4062-01 | |
| NaCl (crystal) | EMD Millipore | Sx0420-3 | |
| NaHCO3 | Amresco | 0865 | |
| OmniPur EDTA | EMD | 4005 | |
| OmniPur HEPES, 遊離酸 | EMD | 5320 | |
| パラフィルム M | Sigma-Aldrich | P7793 | |
| レイノルズラップアルミホイル | レイノルズブランド | N/A | |
| スコッチマジックテープ (12.7 mm x 32.9 m) | スコッチ-3M | N/A | |
| デオキシコール酸ナトリウム | Sigma-Aldrich | D67501 | |
| Spectrafuge ミニ遠心分離機 | Labnet International, Inc | C1301 | |
| 組織インキュベーションチャンバー(購入またはカスタムメイド) | N/A | N/A | |
| Tris-HCl | J.T.Baker | 4103-02 | |
| Triton X-100 | Signma-Aldrich | T8787 | |
| VirTis 卓上型 2K 凍結乾燥機または同等の機械 | SP Scientific | N/A | |
| VWR Grade 413 Filer Paper (diameter 5.5 cm, pore size 5 μm) | VWR | 28310-015 | |
| Whatman Grade 1 Qualitative Filter Paper (直径 9 cm、細孔サイズ 11 μm) | Whatman/GE Healthcare | 1001-090 | |
| 広口径トランスファーピペット、Global Scientific | VWR | 76285-362 |
参考文献
- Arshavsky, V. Y., Lamb, T. D., Pugh, E. N. G proteins and phototransduction. Annual Review of Physiology. 64, 153-187 (2002).
- Molday, R. S., Moritz, O. L. Photoreceptors at a glance. Journal of Cell Science. 128 (22), 4039-4045 (2015).
- Koch, K. W., Dell'Orco, D.
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再版と許可
