黒胡椒植物の フィトフトラ・カプシチ の効果的な接種方法

ブラックペッパー(パイパーニグラムL.)は、ウッディクライマーであり、最も重要なスパイス作物の1つです。「スパイスの王様」¹として知られ、アジア、アフリカ、ラテンアメリカの40以上の国と地域で栽培されています。Phytophthora root rotは、黒胡椒の最も壊滅的な病気であり、卵菌Phytophthora capsiciによって引き起こされます。この病原体は、ウリ科植物、ナス、唐辛子、トマトにも感染します^2,3。黒コショウでは、作物全体がこの病気によって間引かれることがあります。コショウの植え付け面積の拡大は、抵抗性品種が利用できないために制限されており、中国の黒コショウ産業の発展を著しく妨げています。黒胡椒植物に対するPhytophthora capsiciの効果的な接種と正確なサンプリングシステムは、この植物 - 病原体相互作用を研究するために不可欠です。

生殖質資源中の抵抗性の同定とスクリーニングは、病原体の病原性および抵抗性品種の育種および利用を研究するための基本的な要件である。広く使用されているアプローチは、植物種および病原体群に基づく様々な同定方法を使用することである。現在の同定方法には、近年開発されている集団同定、個体同定、臓器同定、組織同定、細胞同定、生化学的同定、および分子同定が含まれる^4,5。これらの分野では成功していますが、多くの問題もあります。どの方法を選択しても、明確な目的、信頼性の高い結果、シンプルで迅速で標準化が容易な方法など、植物抵抗性の識別の基本的な要件は一貫しています。この原理は、黒胡椒耐性の同定においても従わなければならない。

自然界の条件下では、病害抵抗性の同定は多くの環境要因の影響を受ける可能性があります。そこで、剥離した葉や灌漑した根を実験室で使用して病害抵抗性を同定することが提案された。健康な植物由来の若葉を実験室 でインビトロで 接種し、病原体を接種して病原体を接種して病害葉面積を測定し、植物体の病害抵抗性を同定^した6。しかし、 in vitro 葉接種は、一般的な耐性同定にのみ使用でき、分子間相互作用研究には使用できません。それにもかかわらず、灌漑根接種において病害抵抗性状態がしばしば現れ、病害抵抗性のための分子育種の追跡研究において不確実性を引き起こす。したがって、迅速かつ簡単な屋内検出方法が不可欠です。本研究は、実験室における抵抗同定の方法を提供することを目的とする。

1.感染のための黒胡椒切断植物の調製

1. 消毒された剪定ナイフまたはセカテュールを使用して、黒コショウの健康で活発に成長している直交異方性の枝から、直径0.5cmの長さ約40cmの5節切断を行います。剽窃枝の下の3つの節を剪定し、上の2つの節には約10枚の葉がそのまま残っています。
2. 土壌と動物の糞尿(牛糞または羊糞)を含む発根基質を1:1の比率で準備する。発根基質をオートクレーブで121°Cで20分間処理した。
3. 3番目のノードが基板の表面に触れ、基板の上のこのノード上の腋窩芽がちょうど触れるように、約50°の角度で発根基板に挿し木を挿入します。
   注:ここで使用されるバッグの寸法は、高さ40~60 cm、直径25~30 cmです。
4. 植物の根の上に10〜20Lの水を注ぐ。挿し木を90%日陰の温室に25〜30°Cの温度で置き、発根と成長をします。

2. フィトフトラ・カプシチ (P. capsici)の伝播

注: Phytophthora capsici 培養のストックは、中国熱帯農業科学院スパイスおよび飲料研究所の植物保護研究所で維持されています⁷。

1. 水道水の下でジャガイモ塊茎をブラッシングしてきれいにし、200gのジャガイモを^1cm3の立方体に切ります。キューブの一部を800mLの二重蒸留水(_ddH2O)を含むビーカーに入れ、20分間沸騰させる。
2. 重力ろ過を使用して二重ガーゼを通してスープをろ過する。濾液にデキストロース20gと寒天15gを加え、混合物を_{121°Cで20分間ddH2O}オートクレーブで1Lまでの体積にトッピングすることによって、ジャガイモデキストロース寒天(PDA)^{を調製する8}。
3. 滅菌したPDA20mLを液体状で層流フード内の直径9cmの丸いシャーレに注ぐ。結露を防ぐ手段として、層流フードの内側に蓋を開けたPDAプレートを一晩放置してください。
4. 接種ループを使用して、試験管内の Phytophthora capsici ストックから菌糸体を拾います。PDAと接触する菌糸側を有する接種物をペトリ皿に入れる。

3.黒胡椒の感染

1. 潜伏
   1. 接種のために、基質表面から5cm上および根に近い領域を特定する。
   2. ストッパーボーラーを用いてPDA上の Phytophthora capsici 培養物の成長端に直径0.5cmの菌糸体のディスクをペトリ皿にコアアウトする。
   3. シリンジ針を使用して茎を損傷し、選択した接種領域で三角形のパターンに3つの穴を開けます。各穴を菌糸体ディスクで覆います。穴を互いに近づけて、傷ついた部分が菌糸体ディスクで完全に覆われていることを確認します。
   4. 菌糸体ディスクを滅菌湿らせた綿パッドで覆い、乾燥を防ぐ手段として。パッドをポリエチレンストリップでステムに結び付けて、接種ディスクの位置を維持します。
      注:接種後8時間で、接種された穴は黒くなり、時間が経つにつれて病変が拡大しました。葉は黄色に変色して落ち、接種した植物は接種後7〜10日で死亡した。対照植物に病変は発生しなかった。ほとんどの遺伝子は、対照群と比較して 、Phytophthora capsici の接種後に異なって発現した。感染組織の組織病理学的分析は、 Phytophthora capsici が木部にコロニー形成したことを実証した。
2. 目的の植物材料をサンプリングし、その後の研究で使用するために液体窒素中で-80°Cで保存します。
   注:液体窒素、ビニール袋、マーカーペン、枝はさみ、およびその他の材料は、実験前に調製されました。
3. 特定の植物材料が使用のためにサンプリングされた後、残りのすべての植物材料、残った Phytophthora capsici 培養および培養培地、ならびにこの接種作業で使用されるすべての器具および実験器具をオートクレーブで処理する。

図1 は、 トウガラ シ菌接種後の黒コショウ葉の症状を示す。 図2 は、 トウガラ シ菌接種後の黒コショウ茎の症状を示す。病原体は基底茎の黒胡椒に感染した。葉の黄変、しおれの現れ、木部の褐変、血管の黒化などの症状が徐々に現れます。図3 は、 Phytophthora capsici の接種後に対照群と比較して異なる発現を示した遺伝子のほとんどを示す。 図4 は、感染組織の病理組織学的解析により木部にコロニー化した Phytophthora capsici を実証した。

図1: トウガラシ菌 接種後の黒胡椒葉の症状7. CK:制御群;接種:接種後。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2: トウガラシ菌 接種後の黒コショウ茎の症状7. 接種:接種後。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:黒胡椒の根における遺伝子の詳細な発現プロファイル。 図中のエラーバーは、3回の生物学的複製からの発現レベルの標準誤差を示す。X軸上のCK-8、CK-12、CK-24、CK-48、8、12、24、および48は、 P. capsiciとの接種後、対照上の8、12、24、および48時間、および8、12、24、および48時間を指す。y軸は、ユビキチンと比較した相対的発現量を表す。各列は、3つの生物学的複製物からの平均値にSD(標準偏差)を加えたものを表す。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:感染組織の病理組織学的解析 トルイジンブルーO単独染色(左カラム)とコットンブルーとサフラニンO二重染色(右カラム)との比較(20X)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

In this study, the basal head was pinpricked to damage and provide an effective inoculation system in the black pepper plant. Mycelial pellets then covered the three holes to retain moisture and enable the pathogen to infect the plant well. Following inoculation, the leaves turned yellow and dropped off and the inoculated plants died. No lesions developed in the control plants. Most genes expressed differently following inoculation with Phytophthora capsici in comparison to the control group. Fungal diseases are responsible for structural and physiological disorders in a significant number of crops, leading to decreased productivity and economic losses for their producers. Structural studies employing histological techniques on the mode of penetration and colonization of plant tissues by fungi provide a detailed indication of the interactions between the pathogen and the plant tissue. These studies have revealed important aspects to help understand the monocycle of diseases. Histopathological analysis of infected tissues demonstrated Phytophthora capsici colonized in the xylem. This method provides a better means for solving the instability that is caused by traditional inoculation methods including soil drench or root dipping. An effective inoculation and precise sampling system for Phytophthora capsici on black pepper plants are essential for studying this plant-pathogen interaction. It also provides a promising means for studying the mode of action between plants and other soil-borne plant pathogens in agricultural precision breeding.

At the same time, this protocol represents a more efficient way of providing reference for the incubation of woody vine. In previous studies, pathogens were inoculated by root dipping with spore suspensions cultured in V8 medium⁹. It takes 7 days for the spore suspension to be ready, whereas the use of PDA to culture Phytophthora capsici takes just 5 days. The PDA plate was sealed using permeable surgical tape as a means of avoiding contamination from other bacteria and fungi. The cultures were kept at room temperature. The method used in this study can save more time and be performed more rapidly. Black pepper is a woody vine with many sugars and phenols¹⁰, and the zoospores produced by Phytophthora capsici generally occur in soils, making it difficult to infect black pepper vines and cause infection instability in the root¹¹. This protocol provides better results, enabling a strong interaction between vine plants and soil-borne pathogens. The detection of the dynamic process between plants and pathogens is visible and convenient.

The irrigating root method is fast and time-saving, but a problem remains unsolved for black pepper. Phytophthora capsici is a soil-borne pathogen that generally infects plant roots via sporangia and zoospores¹². In nature, the sporangia is able to spread via rain and irrigation. Once the zoospores become attached to the plant surface, the germ tubes may quickly develop and penetrate the plant tissue, which results in infection^13,14. This can cause uncertainty that choosing hyphae as an infection source will be similar to the spore suspension. The method used in this study starts with pinpricking the basal head of the black pepper plant to damage it. The damaged area is then covered with Phytophthora capsici and moisture is retained, ensuring that the pathogen can infect the plant well. This method is better at solving the instability caused by traditional inoculation methods including soil drench or root dipping. It is also a promising method for studying the mode of action between plants and other soil-borne plant pathogens in agricultural precision breeding.