このプロトコルは、 ストレプトマイセスベネズエラ 細胞非転写変換(TX-TL)システムから組み換えタンパク質の高収率を合成するための強化された方法を詳述する。
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この記事について
サマリー
要約
ストレプトマイセス spp.は、臨床抗生物質および工業薬品の主要な供給源である。 ベネズエラのレンサトミース ATCC 10712は、成長が急速に進む菌株であり、クロラムフェニコール、ヒドマイシン、ピクロマイシンの天然生産者であり、次世代の合成生物学シャーシとして魅力的な候補です。したがって、 S.ベネズエラ ATCC 10712の開発を加速する遺伝的ツールは、他の ストレプトマイセス spp.モデルと同様に、天然物工学および発見のために非常に望ましい。この上、専用 のS.ベネズエラ ATCC 10712無細胞システムは、高G+C(%)遺伝子の高収率異種発現を可能にするために、このプロトコルに提供されています。このプロトコルは、96ウェルまたは384ウェルプレート形式の小規模(10-100 μL)バッチ反応に適していますが、反応はスケーラブルである可能性があります。無細胞システムは堅牢で、最小限のセットアップで組み換えタンパク質の範囲のための高収率(〜5-10 μ M)を達成することができます。また、mRNAやタンパク質合成のリアルタイム測定、タグ付きタンパク質のインゲル蛍光染色用の広範なプラスミドツールセットも組み込まれています。このプロトコルは、高スループットの遺伝子発現特性解析ワークフローや、アクチノマイセテスゲノムに存在する高G+C(%)遺伝子からの酵素経路の研究と統合することもできる。
概要
無細胞転写翻訳(TX-TL)システムは、合成生物学の概念的なエンジニアリングフレームワークである迅速な設計構築テスト学習サイクルを実装するための、合成生物学のための理想的なプロトタイピングプラットフォームを提供します。また、開放反応環境における高価値組換えタンパク質生産に対するTX-TLシステムへの関心が高まっている2は、例えば、抗体薬物コンジュゲート3に非標準アミノ酸を組み込む。具体的には、TX-TLは、細胞抽出物、プラスミドまたは線形DNA、およびバッチまたは半連続反応でタンパク質合成を触媒するエネルギー溶液を必要とする。エシェリヒア・コリTX-TLは、支配的な無細胞システムである一方で、多くの非モデルTX-TLシステムは、さまざまなアプリケーションのために注目を集めています 4,5,6,7,8.TX-TLの主な利点は、柔軟な拡張性(ナノリットルからリットルスケール)
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プロトコル
注:GYM培地と寒天プレート、S30AおよびS30B洗浄バッファのレシピについては、 表1 と 表2 を参照してください。
1. ソリューションの作成と一般的なガイダンス
- 例外が記載されていない限り、すべての溶液、細胞(成長後)、および細胞抽出物を調製後に氷上に保管してください。
- 1 M Mg-グルタミン酸、4 M K-グルタミン酸、40%(w/v)PEG 6000、室温で1 g/mLポリビニルスルホン酸、および-80°Cで他のすべての株式を保管します。 化学分解を避けるために、フリーズ融解サイクルの数を最小限に抑えます。
- 3-PGA(pH調整が必要)などのエネルギー溶液ストック( 表3参照)の調製については、 大腸菌 TX-TLプロトコル41に記載のガイダンスに従ってください。
注:すべての成分はddH2Oに完全に溶解し、-80°Cの冷凍庫にアリコートとして保存されます。 - 氷上の個々の在庫またはエネルギーソリューション(後述)を解凍します。42°Cでアミノ酸ストックを熱し、渦を〜15〜30分間加熱し、すべてのアミノ酸を可溶化します。
- 一部のアミノ酸(L-Cys、L-Tyr、L-Leu....
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結果
この詳細なプロトコルは、S. ベネズエラ ATCC 10712 モデル株に基づいてストレプトマイセス TX-TL システムを確立するユーザーを支援する例として提供されています(図 1)。ユーザーは、他のストレプトマイス株を研究しようとするかもしれません;ただし、より長い倍率の時間または明確な成長の好みを持つ他の株の成長/収穫段階は、ピーク結果を達成するためにカスタム最適化する必要があります。代表的な結果については、pTU1-A-SP44-mScarlet-I標準プラスミド(図2および図3)からのmScarlet-I蛍光タンパク質を、S.ベネズエラTX-TLにおいて高収率発現を検出方法の範囲(SDS-PAGE、蛍光)で提供するように最適化した。また、この標準的なプラスミドを、S.リモサス由来の一部の二次代謝産物酵素の合成を.......
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ディスカッション
この原稿では、高収率のS.ベネズエラTX-TLプロトコルは、TX-TLシステムの経験豊富なユーザーと新しいユーザーの両方のために行う簡単な詳細な手順で説明されています。既存のストレプトマイセス45および大腸菌TX-TL41プロトコルからいくつかの機能が削除され、S.ベネズエラTX-TL5,26の最小かつ高収率プロトコルが確立されました。ここで推奨されるワークフローは、S.ベネズエラが選択された豊かな媒体で急速に成長していることを確認し、夕方に最終的な文化を接種できるようにすることです。これは、翌朝のピーク成長時に細胞の収穫を可能にし、ユーザーは、同じ日に活性細胞抽出物を収穫し、準備することができます。この合理化されたプロトコルに従うことで、1人の研究者が3日間の枠組みでプロトコルを便利に完成させることが期待されます。mRNA/タンパク質分.......
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開示事項
著者らは、競合する財政的利益はないと宣言している。
謝辞
著者らは、PSFを持つPDRAとしてのSJMのためのEPSRC[EP/K038648/1]の研究支援を認めたいと思います。ウェルカムトラストは、インペリアル・カレッジ・ロンドンのPSFとSJMのためのISSFフェローシップを後援しました。王立協会研究助成金[RGS\R1\191186];ケント大学のSJMに対するウェルカムトラストSEEDアワード[217528/Z/19/Z]。そして、グローバルチャレンジ研究基金 (GCRF) ケント大学のKCのための博士号の奨学金.
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 2.5 L UltraYield フラスコ | Thomson | 931136-B | |
| 3-PGA (>93%) | Sigma | P8877 | |
| 384 ウェル ブラック/クリア ボトムプレート | ThermoFisher | 10692202 | |
| 塩化アンモニウム (98%) | Fluorochem | 44722 | |
| ATP, CTP, UTP, GTP (100 mM 溶液、>99%) | ThermoFisher | R0481 | |
| カルベニシリン(純度については供給者にお問い合わせください) | メルフォード | C46000-25.0 | |
| D-(+)-グルコース(純度については供給者に連絡してください) | メルフォード | G32040 | |
| DFHBI(≥98% - HPLC) | Sigma | SML1627 | |
| DTT (純度についてはサプライヤーにお問い合わせください) | Melford | MB1015 | |
| FlAsH-EDT2 (純度についてはサプライヤーにお問い合わせください) | Santa Cruz Biotech | sc-363644 | |
| Glucose-6-phosphate (>98%) | Sigma | G7879 | |
| HEPES Free Acid (純度についてはサプライヤーにお問い合わせください) | Melford | B2001 | |
| L-グルタミン酸ヘミマグネシウム塩四水和物(>98%) | シグマ | 49605 | |
| マグネシウム(98%) | フルオロケム | 494356 | |
| 麦芽抽出物 | シグマ | 70167-500G | |
| PEG-6000 | グ | マ807491 | |
| ピアス96ウェルマイクロダイアリシスプレート、10K MWCO | サーモフィッシャー88260 | ||
| ポリ(ビニール硫酸塩カリウム | Sigma 271969 | ||
| グルタミン酸カリウム (>99%) | Sigma | G1149 | |
| RTS アミノ酸サンプラー | 5 Prime | 2401530 | |
| 塩化ナトリウム (99%) | Fluorochem | 94554 | |
| Supelclean LC-18 SPE C-18 SPE カラム (1 g) | Sigma | 505471 | |
| 酵母エキス | メルフォード | Y1333 | |
| <ストロング>イクイップメント | |||
| プレートリーダー | BMG | オメガ |
参考文献
- Carbonell, P., et al. An automated Design-Build-Test-Learn pipeline for enhanced microbial production of fine chemicals. Communications Biology. 1, 66(2018).
- Gregorio, N. E., Levine, M. Z., Oza, J. P. A user's guide to cell-free protein synthesis.
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再版と許可
