電子結晶学研究のための脂質単層法を用いたサンプル調製

Summary

脂質単層は、構造研究のための2次元(2D)タンパク質結晶を形成するための基礎として何十年も使用されてきました。それらは空気水の界面で安定しており、電子のイメージ投射のための薄い支持材料として役立つことができる。ここでは、生物学的研究のための脂質単層を調製するための実証済みのステップを紹介します。

Abstract

電子結晶学は、高解像度の構造決定のための強力なツールです。可溶性または膜タンパク質などの高分子は、好条件下で高度に順序付けられた二次元(2D)結晶に成長させることができます。成長した2D結晶の品質は、2D画像処理による最終的な再構成の分解能にとって非常に重要です。脂質単層は、末梢膜タンパク質や可溶性タンパク質の2D結晶化を促進する支持層として長年にわたり使用されてきました。この方法は、一体膜タンパク質の2D結晶化にも適用できますが、単層への仕切りを促進するために洗剤および透析条件を決定するために、より広範な経験調査が必要です。脂質単層は、水相および非極性のアシル鎖、尾部が空気中に仕切り、表面張力を破り、水面を平らにするような、空気水界面に形成される脂質一層である。頭部群の荷電性または特徴的な化学部分は、溶液中のタンパク質に親和性を提供し、2Dアレイ形成のための結合を促進する。2Dアレイを備えた新しく形成された単層は、結晶アレイを持ち上げて支持するために使用されるカーボンコート銅格子上の電子顕微鏡(EM)に容易に移動することができる。本研究では、極低温電子顕微鏡(クライオ-EM)イメージングのための脂質単層法学的方法論を説明する。

Introduction

2D結晶またはタンパク質のヘリカルアレイを介した電子回折は、好ましい症例^1、2、3においてサブナノメートル分解能^を達成することができる。特に興味深いのは、2D膜タンパク質アレイまたは結晶をほぼネイティブ環境で再構成する¹.結晶は特定の空間周波数での構造因子の強度を高める信号増幅器として機能するため、電子結晶学は、単粒子クライオEMよりも小分子などの高解像度で小さいサイズのターゲットを探査することを可能にします。電子ビームは、順序付けられた2Dアレイのタンパク質によって回折することができ、画像面が検出器⁴に記録される場所に応じて回折パターンまたは格子画像を生成する。回折強度を抽出し、結晶の2D投影構造を再構築するために処理することができます。電子はX線よりも大きな散乱断面を有し、その散乱は主に分子⁵内の電子と荷電原子とのクーロン相互作用に基づくラザフォードモデルに従う。2D膜結晶の厚さは、通常100nm未満であり、試料6内で動的散乱が起きることなく電子透過に適^している。電子結晶学的研究は、膜タンパク質および脂質タンパク質相互作用の高分解能構造情報^{を7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17}に対して強力なツールとして得ることを示している。

脂質単層は、空気水界面⁶で密に詰められたリン脂質からなる1つの脂質層であり、可溶性タンパク質または末梢膜タンパク質¹⁸に対する2Dアレイ形成を補助することができる。脂質の密度とそれらの横圧に応じて、脂質分子は、水溶液^1、6、19に露出したアシル鎖および親水性ヘッドグループに拡張された空気と水界面に秩序ある2Dアレイを形成することができる。脂質ヘッドグループは、静電相互作用を介してタンパク質と相互作用することができ、または特定のタンパク質ドメインに結合する親和性タグを提供するように改変することができる。例えば、DOGS-NTA-Ni(1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-[N-(5-アミノ-1-カルボキシペンチル)イミノジ酢酸)2-Ni^2+]は、ポリヒスチジンタグ20、21、22でタンパク質を結合する脂質単層を形成する際によく使用される。また、コレラ毒素Bは、構造研究^23,24のための脂質単層にガングリオシドGM1の特定の五糖類^を結合することができる。脂質のヘッドグループにタンパク質を固定することにより、脂質単層は、高解像度の電子結晶学的研究のために薄い2Dアレイの形成を支援することができます。脂質単層法は、ストレプトアビジン^2、25、アネキシン^V26、コレラ毒素^27、大腸菌ジラーゼBサブユニット^28、大腸菌RNAポリメラーゼ25、29、30、カルボキシ性シェルタンパク質³¹およびHIV-12血糖血症^{のタンパク質の構造研究のために電子結晶学に使用されてきた33.}脂質単層の安定性と化学的性質のために、サンプル調製のための異なる用途がクライオEMイメージング³⁴のために検討されている。しかし、タンパク質アレイ形成には最適化が必要です。

ここでは、クライオEMイメージングのための脂質単層の一般的な調製の詳細と、形成された単層の品質に影響を与える可能性のあるいくつかの考慮事項を提供します。

Protocol

1. テフロンブロックの準備

1. 耐薬品性PTFE(ポリテトラフルオロエチレン)樹脂からテフロンブロックを調製します。一般的なドリルを使用してブロックに穴を開け、その後に 図 1に示した寸法を使用します。

2. 単層脂質製剤

注:推定動作時間:30〜45分

1. 脂質ストック調製
   1. 0.01 mg/mL 脂質混合物を、クロロホルム 8.91 mL、メタノール 0.99 mL、10 mg/mL の脂質の 0.01 mL を使用して、9:1 (v/v) クロロホルム/メタノールで調製します。
2. テフロンプレート調製
   1. メタノールバスでテフロンプレートを5分間超音波処理します。
   2. お湯で15分洗います。
   3. 蒸留水ですすります。
   4. テフロンプレートをデシケータで30分間乾燥させ、使用していないときに真空下に置いてください(図1)。

3. バッファーリザーバー上の脂質単層の形成

注:推定動作時間:1.5時間

1. 実験当日にクロロホルム/メタノールの9:1混合物に0.01mg/mLの脂質混合物を作り上げます。
2. ペトリ皿にタイプ1のフィルターペーパーを入れ、フィルターペーパーの上にテフロンブロックを並べます。
3. テフロンプレートのウェルに60 μLのバッファーを充填します。
4. ハミルトンシリンジを使用して、バッファー表面のドロップ(理想的には1 μL/ドロップ)の上に脂質混合物を慎重に追加します。
5. ペトリ皿の湿度を保つために蒸留水でフィルター紙を濡らします。
6. 室温で60分間インキュベートします。クロロホルムは蒸発し、バッファーの表面に脂質の単層が形成されるべきである。

4. 脂質単層上のEMグリッドの適用

注:推定動作時間:1.5時間

1. グロー放電なしで、カーボンサイドダウン、各バッファーリザーバの上部に、穴のあいたカーボンコーティングされたEMグリッドを穏やかに配置します。
2. 慎重にサイドインジェクションによくタンパク質を注入.1 μM前後のタンパク質の井戸内の最終的なタンパク質濃度を出発点として使用します。実験前にタンパク質濃度を事前に最適化します。
3. 室温で60分間インキュベートします。
4. 約20~30μLのバッファーをサイドインジェクションポートに静かに注入します。これにより、グリッドがテフロン ブロックのサーフェスの上に上がります。
5. すぐにトゥイザーでグリッドを拾い、液滴から垂直に持ち上げます。
6. 負の染色またはクライオ-TEMイメージング用の単層サンプルを準備する(図2)。タンパク質が2Dアレイを形成する場合、画像パワースペクトルまたはフーリエ歯級数は、結晶対称性に基づいて空間周波数で回折強度を示します。パワースペクトルに回折スポットが見えない場合、タンパク質が2D結晶を形成する可能性は低い。
7. 透過型電子顕微鏡(TEM)を用いて、EMグリッド上の脂質単層の被覆範囲を確認します。下方拡大された電子画像は、被覆単層の形態を識別するのに役立ちます。通常、単層で覆われた領域の画像コントラストは、被覆領域のコントラストよりもわずかに低くなります。さらに、計算された2D画像パワースペクトルは、2D結晶の位置を特定するのに役立ちます。

Results

EMグリッド上に堆積した脂質単層は、染色せずに透過型電子顕微鏡(TEM)下で可視化することができる。この単層存在は、ビーム経路に標本を含まない領域とのコントラスト差によって認識することができる。脂質単層被覆率の領域は、空のホールを通る電子ビームは散乱がなく、明るい照明を示すため、カバレッジのない領域よりも局所的なコントラストが低い(図3)。

2D単層結晶化の条件をスクリーニングするには、陰性染色EMまたはクライオEMイメージングを使用して検体の画像を調べる。単層が穴を覆うかどうかは、ステージが傾いたときにより強いエッジコントラストによって観察することができる。結晶が形成されている場合、画像のパワースペクトルまたは歯角はフーリエまたは回折スポットを示します。小さいサイズ(<200 nm)およびランダムに配向された結晶は、パワースペクトルに高輝度のリングを示し得る。結晶が成長していない場合、パワースペクトルはフーリエスポットを表示しません。

Discussion

脂質単層は、生体高分子の構造研究のための大きな2D結晶の成長を促進する強力なツールです。空気と水の界面で無傷の脂質単層を作製するには、実験当日に脂質を新たに調製することを強く推奨します。粉末形態で購入した脂質は、リン脂質³⁵を溶解するために一般的に使用されるクロロホルム:メタノール溶媒の混合物を使用して溶解する必要があります。クロロホルム:メタノール溶媒は、あらかじめ作製し、密閉ガラスバイアルに保存することができます。溶存脂質は空気と水の界面で適用されますが、クロロホルム:メタノール溶媒がバッファーから完全に蒸発するまで待ちます。この実験では、脂質単層の形成と2D結晶の形成に必要不可欠な時間です。典型的には、脂質単層および2Dアレイの形成は、インキュベーション時間¹⁸の約30〜60分以内に行うことができる。

脂質単層が適切に形成される場合には、2D結晶アレイ形成が脂質によって効果的に促進されることを確認する。特にDOGS-NTA-Ni脂質が^18,36<...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
14:0 PC (DMPC)	Avanti Lipids	850345	1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン, 1 x 25 mg, 10 mg/mL, 2.5 mL
小型ピペット用バルブ	Fisher Scientific	03-448-21
クロロホルム	Sigma-Aldrich	C2432
デシケーター真空	Southern Labware	55207
EM グリッド	電子顕微鏡科学	CF413-50	CF-1.2 / 1.3-4C 1.2 & マイクロ;m穴、1.3µm space
濾紙	GE Healthcare Life Sciences	1001-090	直径 90 mm
ガラス パスツールピペット	Fisher Scientific	13-678-20A
ハミルトン シリンジ (25 & マイクロ;L)	ハミルトン	カンパニー80465
ハミルトンシリンジ(250µL)	ハミルトン	カンパニー81165
ハミルトンシリンジ(5µL)	ハミルトン	カンパニー87930
ハミルトンシリンジ(500µL)	ハミルトン	カンパニー203080
メタノール	シグマ-アルドリッチ	M1775-1GA
ペトリ皿	VWR	25384-342	100 mm× 15 mm
フロンブロック	グレイン	ジャー55UK05	60 & マイクロ;側面注入ポート付きLウェル、手動で作られた
ピンセット	顕微鏡科学	78325	さまざまなスタイル
超純水
超音波洗浄機	VWR	97043-996