細胞外フラックス分析装置を用いたマウス造血幹および原始前駆細胞における細胞生体エネルギーの評価

サマリー

ここで提示された方法は、HSPCの細胞外酸性化速度(ECAR)および酸素消費速度(OCR)をリアルタイムで測定するために、細胞外フラックス分析装置を使用して、非付着性マウス造血幹および原始前駆細胞(HSPC)における細胞生体エネルギーを評価するための最適化されたプロトコルを要約する。

要約

定常状態では、造血幹細胞(HSC)は大部分が静止したままであり、そのエネルギー的ニーズを満たすために主に解糖系に依存していると考えられている。しかし、感染や失血などのストレス条件下では、HSCは増殖性になり、下流の前駆細胞を急速に産生し、それがさらに分化し、最終的に成熟した血液細胞を産生する。この移行および分化プロセスの間、HSCは静止から終了し、解糖系から酸化的リン酸化(OxPHOS)への代謝スイッチを急速に受ける。加齢、癌、糖尿病、肥満などの様々なストレス状態は、ミトコンドリア機能に悪影響を及ぼす可能性があり、したがって、造血中のHSCおよび前駆細胞の代謝リプログラミングおよび分化を変化させる可能性がある。HSCおよび前駆細胞の正常およびストレス条件下での解糖系およびミトコンドリア機能に関する貴重な洞察は、それぞれ細胞解糖系およびミトコンドリア呼吸の指標である細胞外酸性化速度(ECAR)および酸素消費速度(OCR)の評価を通じて得ることができる。

ここでは、細胞外フラックス分析装置を使用して、造血幹細胞および原始前駆細胞(HSPC)の両方を含むマウス骨髄由来系統陰性細胞集団におけるECARおよびOCRを測定するための詳細なプロトコールが提供される。このプロトコールは、マウス骨髄から系統陰性細胞を単離するためのアプローチを説明し、細胞播種密度および2-デオキシ-D-グルコース(2-DG、解糖系を阻害するグルコース類似体)およびこれらのアッセイで使用される様々なOxPHOS標的薬物(オリゴマイシン、FCCP、ロテノン、およびアンチマイシンA)の濃度を説明し、薬物治療戦略を説明する。解糖系、解糖系容量、解糖系予備量などの解糖系フラックスの主要なパラメータと、基礎呼吸、最大呼吸、プロトン漏れ、ATP産生、予備呼吸能力、カップリング効率などのOxPHOSパラメータは、これらのアッセイで測定できます。このプロトコルは、非付着性HSPCのECARおよびOCR測定を可能にし、あらゆるタイプの浮遊細胞の分析条件を最適化するために一般化することができます。

概要

造血は、高度に専門化された機能を有する様々なタイプの成熟血液細胞が^HSCs1から形成されるプロセスである。HSCは、自己複製および様々な多能性および系統特異的な前駆集団への分化が可能である。これらの前駆細胞は、最終的にリンパ系、骨髄系、赤血球系、および巨核球系譜の細胞を産生する。自己複製能力を維持するために、HSCは大部分が静止したままであり、他の組織幹細胞と同様に、ATP産生のためにミトコンドリアOxPHOSではなく解糖系に依存すると考えられている^2,3。細胞周期に入ると、呼吸とOxPHOSが増強され、HSCの維持と機能に有害な活性酸素種(ROS)のレベルが上昇します³。したがって、細胞分裂を繰り返すと、HSCの自己複製能力が低下し、最終的には枯渇する可能性があります。

成体造血では、HSCは主に非対称細胞分裂を受け、その間、娘細胞の1つがHSC電位を保持し、解糖系代謝に依存し続ける。もう一方の娘細胞は、自己複製能を失うが増殖し、最終的に分化した機能造血細胞⁴を生じさせる原始前駆細胞となる。HSCが分化して下流の祖先を産生すると、HSCが不活性なミトコンドリア塊^を有するという観察によって示唆されるように、解糖系からミトコンドリア代謝への切り替えが起こると考えられている⁵、HSCが不活性なミトコンドリア塊6、^7、8、9.対照的に、ミトコンドリア活性(リンクされたROSレベルによって示される)は、HSCs9、^10、11よりも系統コミットされた前駆細胞においてはるかに^高い。したがって、造血の初期段階で起こる代謝変化は、HSCの運命を調節する上でのミトコンドリアの直接的かつ重要な役割を示唆している。

老化、癌、糖尿病、肥満などの様々なストレス条件下で存在する機能不全のミトコンドリア12は、HSCの自己複製能力を妨害し、過剰な量のROSを産生し、ATP産生を損ない、および/または他の代謝プロセスを変化させることによってHSC/前駆分化の不均衡を誘発する可能性がある^9,12,13.HSC/前駆分化における代謝恒常性における摂動は、造血に重大な影響を及ぼし、血液学的異常の発症に寄与する可能性がある¹³。解糖系およびミトコンドリアOxPHOSがHSCのステムネスおよび分化に及ぼす重大な影響を考えると、正常およびストレス条件下で両方の代謝パラメータを調査することが興味深い。HSCおよび前駆細胞の解糖系およびミトコンドリア機能に関する貴重な洞察は、細胞の解糖系およびミトコンドリア呼吸の指標であるECARおよびOCRをそれぞれ評価することによって得ることができる。

タツノオトシゴ細胞外フラックス分析計は、生細胞中のECARおよびOCRを同時に測定するためにウェルあたり2つのプローブを備えた強力な装置であり、したがって、様々な基質または阻害剤に応答して、細胞の生体エネルギーをリアルタイムで評価するために使用することができる。分析装置で使用されるアッセイカートリッジには、アッセイ中に自動注入用の最大 4 つの薬物を保持する注入ポートが含まれています。典型的な解糖系ストレス試験のスキームを 図1Aに示す。アッセイは、グルコースまたはピルビン酸を含まないグルタミンを含む解糖系ストレス試験培地中でインキュベートした細胞のECARの測定から始まる。これは、細胞の非解糖系活性のために起こる酸性化を表し、非解糖系酸性化として報告されている。これに続いて、飽和濃度でのグルコースの注射が続く。解糖系を介して、細胞内のグルコースはピルビン酸に変換され、これはさらに細胞質内で代謝されて乳酸塩を生成し、またはミトコンドリア内で_CO2 および水を生成する。

グルコースから乳酸への変換は、細胞外培地へのプロトンの正味産生およびその後の放出を引き起こし、その結果、ECAR^14、15、16の急速な増加をもたらす。ECARにおけるこのグルコース刺激変化は、基礎条件下で解糖系として報告される。2回目の注射は、ミトコンドリアATP産生を阻害するオリゴマイシン(ATP合成酵素、別名複合体^V17の阻害剤)からなる。オリゴマイシン媒介性OxPHOS阻害の間、細胞は解糖系を最大限アップレギュレートして、その精力的要求を満たす。これはECARのさらなる増加を引き起こし、細胞の最大解糖系能力を明らかにする。最大解糖系容量と基礎解糖系との差を解糖系予備量と呼ぶ。最後に、2-DGが注入され、これはECARの有意な低下を引き起こし、通常は非解糖系酸性化レベルに近い。2-DGは、ヘキソキナーゼに競合的に結合し、解糖系¹⁸の阻害をもたらすグルコース類似体である。したがって、ECARの2-DG誘導性減少は、解糖系が実際にグルコースおよびオリゴマイシン注射後に観察されるECARの供給源であることをさらに確認する。

図1B は、典型的なミトコンドリアストレス試験の概略を示す。アッセイは、細胞のベースラインOCR測定から始まり、グルコース、グルタミン、およびピルビン酸を含むミトコンドリアストレス試験培地中でインキュベートする。基礎OCR測定に続いて、このアッセイにおいてオリゴマイシンが注入され、これは錯体Vを阻害し、それによって電子輸送鎖(ETC)を通る電子流を減少させ^る17。その結果、オリゴマイシン注射に応答してOCRが減少し、このOCRの減少がミトコンドリアATP産生と関連している。2回目の注射は、カルボニルシアン化物-4(トリフルオロメトキシ)フェニルヒドラゾン(FCCP)、プロトノフォアおよびミトコンドリアOxPHOS¹⁷のアンカプラーからなる。FCCPは、ミトコンドリア内膜を横切るプロトンの流れを可能にすることによってミトコンドリアプロトン勾配を崩壊させる。FCCP注入のために、ETCを通る電子流は抑制されず、錯体IVは最大レベルで酸素を消費する。最大OCRと基礎OCRの差は予備呼吸能力と呼ばれ、ストレス条件下でのエネルギー需要の増加に応答する細胞の能力の尺度である。最後に、2つのETC阻害剤(ロテノン、複合体I阻害剤、およびアンチマイシンA、複合体III阻害剤¹⁷)の混合物が注入され、電子の流れが完全に遮断され、OCRは低レベルに低下する。ロテノンおよびアンチマイシンA注射後に測定されたOCRは、細胞内の他のプロセスによって駆動される非ミトコンドリアOCRに対応する。非ミトコンドリアOCRは、基礎呼吸、陽子漏れ、および最大呼吸の計算を可能にします。

基礎呼吸は、ベースラインOCRと非ミトコンドリアOCRとの差を表す。プロトンリークは、オリゴマイシン注射後のOCRと非ミトコンドリアOCRとの差を指す。最大呼吸は、FCCP注射後のOCRと非ミトコンドリアOCRとの差を表す。結合効率は、基礎呼吸数に対するATP生産率の割合として計算される。この方法論文は、タツノオトシゴXFe96細胞外フラックス分析装置を使用して系統陰性HSPC中のECARおよびOCRを測定するための詳細なプロトコルを提供する。このプロトコールは、マウス系統陰性HSPCを単離するためのアプローチを説明し、細胞播種密度および細胞外フラックスアッセイで使用される様々な薬物の濃度の最適化を説明し、薬物治療戦略を説明する。

プロトコル

すべての脊椎動物実験は、ミシガン大学動物の使用および世話に関する委員会の規則に従って承認され、実施された。

アッセイ前日(合計時間:〜10分)

1. センサーカートリッジの水分補給(ステップ時間:〜10分)
   1. 細胞外フラックスアッセイキットを開き、センサーカートリッジとユーティリティプレートアセンブリを取り外します。翌日に使用するためにローディングガイドフラットを保存します。
   2. センサーカートリッジ(蓋付きの上部の緑色の部分)をユーティリティプレート(下部の96ウェルマイクロプレート)から手動で分離し、ユーティリティプレートの横に逆さまに置きます。
   3. マルチチャンネルピペットを使用して、ユーティリティプレートの各ウェルに、フラックスアッセイキットに付属の200 μLのキャリバートを充填します。
   4. センサーカートリッジをユーティリティプレートに戻し、センサーをキャリバーントに完全に浸してください。
   5. キャリブラントで組み立てられたセンサーカートリッジとユーティリティプレートを非_CO2 37°Cインキュベーターに一晩置きます。キャリバートの蒸発を防ぐために、インキュベーターが適切に加湿されていることを確認してください。非_CO2 37°Cインキュベーションに通常のオーブンインキュベーターを使用する場合は、インキュベーター内部に水を入れたオープンビーカーを置き、それを加湿する。利用可能な場合は、すべての非_CO2 37°CインキュベーションにXFプレップステーションを使用してください。
      注:あるいは、センサーカートリッジは、非CO2 37°Cインキュベーター内の滅菌超純水1ウェルあたり200μLで一晩水和することができます。アッセイ当日に注入口を装填する前に、少なくとも45〜60分前に、37°Cに予温したキャリバートのウェルあたり200μLで水を交換してください。

アッセイの日(合計時間:〜9時間30分)

メモ: 上記の合計時間には、ステップ 2.5 またはステップ 2.6 に加えて、ステップ 2.1 ~ 2.4 の累積継続時間が含まれます。

1. 細胞接着コーティングマイクロプレートの調製(ステップ時間:〜1時間30分)
   メモ:バイオセーフティキャビネットのすべての手順を実行します。
   1. 56 μgの細胞接着液を適当な量のフィルター滅菌した0.1 M炭酸水素ナトリウム(pH 8.0)に溶解し、直ちに1 N水酸化ナトリウムを、使用した細胞接着ストックの半分の容量で加えることにより、96穴細胞培養マイクロプレートあたり2.5 mLの細胞接着溶液(22.4 μg/mL、 材料表参照)を調製する。渦またはピペットを上下にして混合します。
   2. 96ウェル細胞培養マイクロプレート(フラックスアッセイキットに付属)を開き、調製した細胞接着溶液25 μLを各ウェルの底に分注する。マイクロプレートを蓋で覆い、フード内の室温で30分間インキュベートします。
   3. インキュベーション後、マルチチャンネルピペットまたはアスピレーターを用いて余分な細胞接着溶液を除去して廃棄し、各ウェルを200μLの滅菌超純水で2回洗浄する。蓋を外した状態で、フード内でプレートを30〜45分間空気乾燥させます。
      注:細胞接着コーティングされた細胞培養マイクロプレートは、4°Cで最大1週間保存することができる。 4°Cで保存されたプレコートマイクロプレートは、細胞を播種する前にフード内の室温まで温める必要があります。
2. アッセイ培地の調製(ステップ時間:〜30分)
   1. 解糖系ストレス試験用アッセイ培地の調製
      1. 100mLのベース培地( 材料表を参照)を1mLの200mM L-グルタミンで補足する。
         注:アッセイ培地中の最終L-グルタミン濃度は2mMである。
      2. L-グルタミン添加培地をウォーターバス中で37°Cに温める。
      3. 温培地のpHを1N NaOHで7.4に調整する。
      4. 培地を0.2μmフィルターでろ過滅菌し、使用できる状態になるまで37°Cに保ちます。
   2. ミトコンドリアストレス試験用アッセイ培地の調製
      1. 100 mLのベース培地に0.45 gのグルコース、1 mLの200 mM L-グルタミン、および1 mLの100 mM ピルビン酸ナトリウムを補充する。
         注:最終アッセイ培地は、25 mM グルコース、2 mM L-グルタミン、および 1 mM ピルビン酸ナトリウムを含有する。
      2. グルコース、L-グルタミン、ピルビン酸ナトリウム添加培地をウォーターバス中で37°Cに温めた。
      3. 温培地のpHを1N NaOHで7.4に調整する。
      4. 培地を0.2μmフィルターでろ過滅菌し、使用準備が整うまで37°Cに保ちます。
3. マウス系統陰性HSPC(ステップタイム:〜3時間)を収穫する
   1. ハンクのバランス塩溶液に4%ウシ胎児血清を補充してアッセイバッファーを調製します。5xストックを滅菌蒸留水で希釈することによって1x濃縮緩衝液を調製する。使用時まで両方のバッファーを氷の上に保管してください。
   2. CO2を用いてマウスを人道的に安楽死させ、続いて子宮頸部脱臼を行い、ハサミで後肢を除去する。骨からすべての組織を慎重に取り除き、はさみを使って大腿骨と脛骨の両側から端を切り取ります。アッセイバッファーを使用して大腿骨および脛骨から骨髄細胞を洗い流す。洗い流した細胞を滅菌70μmフィルターに通し、ろ液を200×gで4°Cで5分間遠心分離し、上清を捨てる。
   3. 細胞ペレットを500 μLのACK緩衝液(150 mM NH₄Cl、10 mM KHCO₃、0.1 mM EDTA、pH 7.2)に再懸濁して赤血球を溶解する。氷上で1分間溶解した後、1mLのアッセイバッファーおよび遠心分離機で200× g を加えて4°Cで5分間サンプルを洗浄する。 上清を捨てる。
   4. 洗浄後、CD2(1:200希釈)、CD3(1:200希釈)、CD5(1:200希釈)、CD8(1:200希釈)、Ter-119(1:200希釈)、B220(1:200希釈)、およびGr-1(1:800希釈)に対するビオチン化抗体のカクテルと共に、アッセイバッファーの全容量500μL中で氷上で45分間、サンプルをインキュベートする。
   5. 上記のように遠心分離で1mLのアッセイバッファーでサンプルを洗浄する。
   6. 上記のように遠心分離で1mLの1x濃縮緩衝液でサンプルを洗浄する。
   7. サンプルを20 μLのストレプトアビジンナノビーズおよび100 μLの1x濃縮バッファーとともに氷上で15分間インキュベートします。
   8. 上記のように遠心分離で1mLの1x濃縮緩衝液でサンプルを洗浄する。
   9. サンプルを2.5 mLの1x濃縮バッファーに再懸濁します。それらを分離磁石の上に5分間置きます。上清を15mL円錐管に別々に集める。
   10. マグネット分離したサンプルを追加の2.5 mLの1倍濃縮バッファーに再懸濁し、再び分離マグネット上に5分間置きます。ステップ2.3.9から15mLの円錐管で以前のコレクションに上清を集めて組み合わせます。
       注:上清には、系統陰性細胞画分が含まれています。
   11. 負に選択された細胞を含む15mL円錐管を4°Cで200× g で5分間遠心分離する。
   12. 細胞ペレットを1mLのアッセイバッファーに再懸濁し、トリパンブルーを手動で使用するか、Countess 3などの自動細胞カウンターを介して細胞数をカウントします。
       注:上記のアプローチに従って、〜6〜¹⁰⁶ ×系統陰性HSPCは、単一のマウスの後肢から容易に精製されるべきである。アッセイバッファー、1x濃縮バッファー、系統特異的抗体カクテルなどの試薬を実験の前日に調製した場合、4匹のマウスからHSPCを濃縮するのに約2.5~3時間かかります。この数を超えると、マウスごとにさらに10分かかります。
4. 細胞接着コーティングされたマイクロプレートに細胞を播種する(ステップ時間:〜1時間)
   1. ステップ2.3.12から細胞を200× g で室温で5分間遠心分離する。
   2. 上清を除去し、細胞ペレットを適切なアッセイ培地(解糖系ストレス試験培地またはミトコンドリアストレス試験培地)に再懸濁する。200 × g で室温で5分間遠心分離する。
   3. 手順 2.4.2 を繰り返します。上清を除去し、細胞を適切な加温アッセイ培地に再懸濁して、50 μLあたり2.5 ×^105細胞 または1mLあたり5×106^の 濃度にする。
   4. 50 μLの細胞懸濁液を室温細胞接着コーティングされた96ウェル細胞培養マイクロプレートの各ウェルの側面に沿ってピペットする。アッセイ培地50 μLをコーナーバックグラウンド測定ウェルにピペットする。細胞プレーティングにはマルチチャンネルピペットを使用して、一貫性を確保します。
   5. コーティングされていない96ウェル細胞培養マイクロプレートのウェルあたり50μLの水を加えて遠心分離機バランスプレートを作成します。
   6. プレート中の細胞を200 × g で室温で1分間遠心分離する。ブレーキをかけないでください。プレートを非_CO2 37°Cインキュベーターに25〜30分間移し、細胞が完全に付着したことを確認する。マイクロプレート表面に細胞が安定に接着していることを顕微鏡で目視で確認する。
      注:1匹のマウスの後肢から〜^6×106 系統陰性HSPCを採取することができるので、4匹のマウス(〜2.4×¹⁰⁷ 細胞)から単離されたHSPCは、 複数の介入をエキソビボ で並行してスクリーニングすることである場合、96ウェルプレート全体を満たすために必要である。しかし、遺伝子改変または介入が 生体内のHSPCの代謝パラメータに及ぼす影響を調査することが目的である場合、複数の対照マウスおよび試験マウスから単離されたHSPCは、単一のプレートを使用して複数の技術的複製で並行して分析することができる。
5. 細胞外フラックス分析装置を用いて解糖系ストレス試験を行う(工程時間:〜3時間30分)
   1. コンパウンドを注入するローディングセンサーカートリッジ
      1. 100 mM グルコース、20 μM オリゴマイシン、および 500 mM 2-DG 溶液を、加温した解糖系ストレス試験アッセイ培地 (pH 7.4) に調製します。
         注:すべての注入化合物溶液は10倍の濃度で作られています。最終ウェル濃度は、グルコースで10 mM、オリゴマイシンで2 μM、2-DGで50 mMです( 表1参照)。
      2. ステップ 1.1.5 から非_CO2 37 °C インキュベーターから水和センサーカートリッジを取り外します。センサーカートリッジをキャリブラントから持ち上げ、キャリブラントと同じユーティリティプレートに交換して、ユーティリティプレートのキャリブラントから気泡を取り除きます。
      3. A/Dローディングガイド(細胞外フラックスアッセイキットに付属)をセンサーカートリッジの上部に平らに置き、文字「A」が左上隅に位置するように向きを変えて、ポートAのみがロードに使用できるようにします。マルチチャンネルピペットを使用して、ポートAに20 μLの100 mMグルコース溶液を分注します。
      4. A/D ローディングガイドをフラットな B/C ローディングガイドに交換し、文字「B」が左上隅に位置するように方向を変えて、ポート B のみがロードに使用できるようにします。マルチチャンネルピペットを使用して、ポートBに22 μLの20 μMオリゴマイシン溶液を分注します。
      5. B/Cローディングガイドの向きを平らにして、ポートCをロードするための左上隅の文字「C」を見つけます。マルチチャンネルピペットを使用して、ポートCに25 μLの500 mM 2-DG溶液を分配します。
      6. ローディングガイドのフラットを取り外して廃棄します。
         注:バックグラウンドウェルのポートを含むすべての96ウェルの各ポートシリーズに、同じ容量の注入化合物を完全に装填することが重要です。
   2. テンプレートの作成、キャリブレーション、測定
      1. 解糖系ストレス テストのテンプレートを作成またはコントローラーに読み込みます。注射戦略、治療条件、および細胞タイプに関する詳細を入力し、 生成グループを押します。 プレートマップ に移動し、分析する各グループにウェルを割り当てます。バックグラウンド測定用に4つのコーナーウェルを割り当てます。
      2. プロトコルでは、初期化ステップでキャリブレーションと平衡化がチェックされていることを確認します。
      3. ベースライン測定および各注射後の測定(グルコース、オリゴマイシン、および2-DG)については、測定サイクル数を3に設定し、混合-待機-測定時間を3分~0分~3分に設定します(表2参照)。
      4. コンパウンド装填および水和センサーカートリッジから蓋を取り外し、ユーティリティプレートのキャリブラントに沈めます。細胞外フラックス分析装置の作業トレイに置き、実行を開始します。
         注:最初のステップはキャリブレーションで、通常は約20分かかります。
      5. 細胞を入れたマイクロプレートを非_CO2から 取り出し、37°Cのインキュベーターからステップ2.4.6から25~30分のインキュベーションが終わった後。細胞を乱すことなく、ウェルあたり130 μLの予温解糖系ストレス試験アッセイ培地(pH 7.4)をゆっくりと加えて、各ウェルの培地容量を180 μLにし、プレートを非_CO2 37°Cインキュベーターに戻してさらに15〜20分間。
         注:遠心分離後の合計インキュベーション時間は45〜60分が好ましい。
      6. 較正が終了したら、ユーティリティプレートを細胞を含むアッセイマイクロプレート(蓋なし)と交換する。 ロードセルプレートを押して測定を開始すると、アッセイの完了に約1.5時間かかります。
      7. 測定が終わったら、細胞を含むアッセイマイクロプレートを収集し、細胞を乱すことなくアッセイ培地を除去する。細胞を脱落させることなく、250 μLの1xリン酸緩衝生理食塩水で1回穏やかに洗浄する。
      8. 10 μLのRIPA溶解バッファー(50 mM Tris-HCl、pH 7.4、1% NP-40、0.5 % Naデオキシコール酸、0.1% ドデシル硫酸ナトリウム、150 mM NaCl、2 mM EDTA、50 mM NaF)を加え、1xプロテアーゼ阻害剤カクテルを添加し、各ウェルに、シェーカー上でプレートを10分間攪拌する。プレート全体を-80°Cで凍結する。
      9. プレートを解凍し、製造元の指示に従ってデータ正規化のためのタンパク質測定アッセイを行う。
      10. データを取得して分析します。Waveデスクトップソフトウェアを使用してデータファイルを開きます。[正規化]をクリックし、各ウェルの正規化値を貼り付けます。[適用]をクリックしてデータを正規化します。[エクスポート]をクリックし、[解糖系ストレステストレポートジェネレータ]を選択して、分析データをレポートジェネレータにエクスポートします。または、データを外部アプリケーションにエクスポートします。
          注:あるいは、各ウェル中の核DNAの総含有量を使用して、データを正規化することもできます。核酸に結合するCyQuantなどの蛍光色素を使用して、ウェルあたりの総核DNA含有量を評価することができます。
6. 細胞外フラックス分析装置を用いてミトコンドリアストレス試験を行う(ステップ時間:〜3時間30分)
   1. コンパウンドを注入するローディングセンサーカートリッジ
      1. 20 μM オリゴマイシン、20 μM FCCP、および 5 μM ロテノン + 5 μM アンチマイシン A 溶液を、予温したミトコンドリアストレス試験アッセイ培地 (pH 7.4) に調製します。
         注:すべての注入化合物溶液は10倍の濃度で作られています。最終ウェル濃度は、オリゴマイシンで2 μM、FCCPで2 μM、ロテノンとアンチマイシンAでそれぞれ0.5 μMです( 表3参照)。
      2. ステップ 1.1.5 から 37 °C インキュベーターから水和センサーカートリッジを取り外し、ステップ 2.5.1.2 で前述したように気泡を除去します。
      3. 手順 2.5.1.3 ~ 2.5.1.6 に従って、ポート A に 20 μL の 20 μM オリゴマイシン、ポート B に 22 μL の 20 μM FCCP、ポート C に 5 μM ロテノンと 5 μM アンチマイシン A の混合物 25 μL を分注します。
         注:バックグラウンドウェルのポートを含むすべての96ウェルの各ポートシリーズに、同じ量の注入化合物を完全にロードすることが重要です。
   2. テンプレートの作成、キャリブレーション、測定
      1. ミトコンドリアストレステスト用のテンプレートを作成またはコントローラにロードします。注射戦略、治療条件、および細胞タイプに関する詳細を入力し、 生成グループを押します。 プレートマップ に移動し、分析する各グループにウェルを割り当てます。バックグラウンド測定用に4つのコーナーウェルを割り当てます。
      2. プロトコルでは、初期化ステップでキャリブレーションと平衡化がチェックされていることを確認します。
      3. ベースライン測定および各注射後の測定(オリゴマイシン、FCCP、およびロテノン+アンチマイシンA)について、測定サイクル数を3に設定し、混合-待機-測定時間を3分~0分~3分に設定します(表4参照)。
      4. 実行を開始して、ステップ 2.5.2.4 のようにキャリブレーションを実行します。
      5. ステップ2.5.2.5において、予め加温したミトコンドリアストレス試験アッセイ培地(pH7.4)をウェルあたり130μL加える。
      6. 測定を開始します。手順 2.5.2.6 から 2.5.2.10 のようにデータを取得して分析します。分析したデータを ミトコンドリアストレステストレポートジェネレーター または外部アプリケーションにエクスポートします。

結果

このプロトコールを使用して、細胞数および様々なOxPHOS標的薬(細胞外フラックスアッセイに使用)の濃度を最適化し、24週齢の雌C57BL/6マウスから単離されたHSPCのECARおよびOCRを測定した。まず、細胞数およびオリゴマイシン濃度を最適化するために解糖系ストレス試験を行った。このアッセイでは、5 ~¹⁰⁴ ~ 2.5 × 105 の範囲のウェルあたりのさまざまな数のHSPC^×使用しました。図2Aおよび図2Cに示すように、非解糖系酸性化率は、細胞数が5×¹⁰⁴から2.5×¹⁰⁵に増加するにつれて上昇するが、2×105〜^2.5×¹⁰⁵細胞の間では最小限にしか増加しない。予想通り、10mMグルコースの注射は、すべての細胞数で解糖系を刺激し、CARの最大増加は1ウェル当たり2.5×¹⁰⁵細胞で観察される。しかし、2μMのオリゴマイシンの注射は、そうでなければ予想され...

ディスカッション

この方法論文は、タツノオトシゴ細胞外フラックス分析装置を用いてマウスHSPCにおける細胞生体エネルギー学(解糖系およびOxPHOS)の評価のための最適化されたプロトコールを記載している。この装置は、解糖系およびミトコンドリア呼吸の指標である生細胞のECARおよびOCRを同時に測定する強力なツールである。したがって、細胞生体エネルギー学をリアルタイムで評価するために使用することができる。さらに、96ウェルマイクロプレートベースのプラットフォームは、高感度でハイスループット定量を提供し、別の高分解能呼吸計、2つのサンプルを同時に分析できるOroboros O2k、または古典的なクラーク電極²⁰と比較して、単一のプレートを使用して複数のサンプルを同時に分析することができます。

細胞外フラックス分析計は、細胞が単層に存在する必要があり、懸濁状態で増殖した細胞を分析することがより困難になるため、主に付着細胞型の分析に使用されてきました。また、ポートからの薬物注入後、測定前のウェルにおける薬物・培地混合サイクル中に乱流が生じ、細胞が脱落することが...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.2 μmフィルター	コーニング	430626	アッセイ培地のろ過滅菌に使用
100 mM ピルビン酸ナトリウム	ライフテクノロジー	11360-070	ミトコンドリアストレステストアッセイ媒体の成分
15mL 円錐形ファルコンチューブ	コーニング	352096	HSPCの収穫時に使用され、アッセイ薬液の調製に使用
200 mM L-グルタミン	ライフテクノロジー	ズ 25030-081	解糖ストレステストおよびミトコンドリアストレステストアッセイ培地の成分
2-デオキシ-D-グルコース (2-DG)	Sigma-Aldrich	D8375	解糖ストレステスト中の3回目の薬物注射
5倍濃縮バッファー (MojoSort)	バイオレジェン	480017	HSPC収穫時の洗浄に使用
塩化アンモニウム (NH4Cl)	フィッシャーサイエンティフィック	A661-3	ACK溶解の成分バッファー
アンチマイシン A	Sigma-Aldrich	A8674	ミトコンドリア負荷試験中の 3 回目の薬物注射
Bio-Rad DC タンパク質アッセイキット	Bio-Rad	500-0112	製造元の指示に従って使用
シアン化カルボニル-4 (トリフルオロメトキシ) フェニルヒドラゾン (FCCP)	Sigma-Aldrich	C2920	ミトコンドリアストレス試験中の 2 回目の薬物注射
Cell-Tak	コーニング	354240	セル接着剤。細胞マイクロプレートのコーティングに使用
カウント3 自動セルカウンター	サーモフィッシャーサイエンティフィック		細胞計数用
EDTA	フィッシャーサイエンティフィック	O2793-500	ACK溶解バッファーおよびRIPA溶解バッファーの成分
ファルコン70 μmフィルター	フィッシャーサイエンティフィック	08-771-2	HSPCの収穫時に細胞ストレーナーとして使用
Gibco Fetal wevine serum (FBS)	フィッシャーサイエンティフィ	26400044	HSPCの収穫時にアッセイバッファーを調製するために使用
Gibco HBSS	フィッシャーサイエンティフィック	14175095	HSPCの収穫時にアッセイバッファーを調製するために使用
グルコース	Sigma-Aldrich	G7528	ミトコンドリア負荷試験アッセイ媒体の成分と解糖ストレス試験の最初の注射
オリゴマイシン	Sigma-Aldrich	O4876	解糖ストレステスト中の2回目の薬物注射とミトコンドリアストレステスト中の1回目の薬物注射
PBS	Life Technologies	10010-049	タンパク質定量のためのアッセイ後に細胞を洗浄するために使用
重炭酸カリウム (KHCO3)	フィッシャーサイエンティフィック	P235-500	ACK溶解バッファー
プロテアーゼ阻害剤カクテル(PIC)	ロシュ	11836170001	の成分 錠剤として供給されます。1錠を10 mLのRIPAバッファーに溶解して、1x PICを調製しました。
ラットビオチン抗マウス-B220、クローンID:RA3-6B2	Biolegend		103203 HSPCs収穫中の系統枯渇に使用
ラットビオチン抗マウス-CD2、クローンID:RM2-5	Biolegend	100103	HSPC収穫中の系統枯渇に使用
ラットビオチン抗マウス-CD3、クローンID:17A2	Biolegend	100243	HSPC収穫中の系統枯渇に使用
ラットビオチン抗マウス-CD5、クローンID: 53-7.3	Biolegend	100603	HSPCs収穫時の系統枯渇に使用
ラットビオチン抗マウス-CD8, クローンID: 53-6.7	Biolegend	100703	HSPCs収穫時の系統枯渇に使用
ラットビオチン抗マウス-Gr-1, クローンID: RB6-8C5	バイオレジェン	108403	HSPCs収穫時の系統枯渇に使用
ラットビオチン抗マウス-Ter-119, クローンID: TER-119	Biolegend	116203	HSPC収穫時の系統枯渇に使用
ロテノン	Sigma-Aldrich	R8875	ミトコンドリアストレステスト中の3回目の薬物注射
タツノオトシゴ XFe96 細胞外フラックス分析装置	タツノオトシゴ バイオサイエンス社 アジレント		ECARおよびOCR測定をリアルタイムで行うことができます。
重曹	Sigma-Aldrich	S5761	マイクロプレートコーティング用細胞接着液の製造に使用
塩化ナトリウム(NaCl)	フィ	ッシャーBP358	RIPA溶解緩衝液の成分
デオキシコール酸ナトリウム	Sigma-Aldrich	D6750	RIPA溶解緩衝液の成分
フッ化ナトリウム(NaF)	Sigma-Aldrich	S7920	RIPA溶解緩衝液の成分
水酸化ナトリウム(NaOH)	Sigma-Aldrich	S8045	1 N溶液を調製しました。pHの正常化に使用
ストレプトアビジンナノビーズ(MojoSort)	バイオレジェンド	480015	HSPCs収穫中の系統枯渇に使用
Tris-HCl	Fisher	BP153	RIPA溶解バッファーXF
ベース培地	Agilent	102353-100	ベース培地 解糖ストレステストおよびミトコンドリアストレステストアッセイ培地
XFプレップステーション	タツノオトシゴバイオサイエンス		非CO<サブ>2 37 °C インキュベーション
XFe96 細胞外 FluxPak	Agilent	102416-100 または 102601-100	ユーティリティプレート付きアッセイカートリッジ、アッセイカートリッジに薬物 をロードするためのローディングガイドフラット、XFキャリブラント溶液、XF細胞培養マイクロプレートが含まれています