細菌スクリーニング、選択、および分離のための光分解性ヒドロゲルインターフェース

Summary

高分解光パタリングツールを利用して細菌細胞を単離するための光分解性ヒドロゲルの使用が報告されている。プロセスの基本的な実験手順、結果、および利点を検討します。この方法は、異種のコミュニティまたは集団からの稀またはユニークな機能を示す標的細菌の迅速かつ安価な分離を可能にする。

Abstract

生物学者は長い間、表現型と遺伝子型の関係を理解しようとしてきた。このつながりをよりよく理解するためには、下流の遺伝子解析のために、微視的細胞スクリーニングと細胞単離を高純度で結合する実用的な技術を開発することが重要です。ここでは、異種細胞集団からの独特な増殖表現型を有する細菌のスクリーニングおよび単離のための光分解性ポリ(エチレングリコール)ヒドロゲルの使用について説明する。この方法は、ヒドロゲルで細胞をカプセル化または包み込み、続いて培養、顕微鏡スクリーニング、次にヒドロゲル分解の時空間的制御および選択した細胞の取り出し液への放出のための高解像度光パターニングツールの使用に依存する。異なる光パターンを適用することで、抽出された細胞の形態を制御することができ、リングや十字架などのパターンを使用して、分離株へのDNA損傷を軽減するために、紫外線を最小限に抑えた細胞を取り出すことができます。さらに、ライトパターニングツールは、調整可能な光量を提供し、様々な劣化および細胞放出率を達成します。それは高分解能で分解を可能にし、ミクロンスケールの空間精度で細胞を取り出すことを可能にする。ここでは、バルクヒドロゲルおよびマイクロハブラボオンチップデバイスの両方から細菌をスクリーニングおよび回収するためのこの材料の使用が実証されている。この方法は安価でシンプルで、変異型ライブラリーからのまれな成長プロファイルを持つ細菌株の単離やゲノム特性評価のための出現した形質を有する細菌コンソーシアムの単離など、微生物学における一般的かつ新しい用途に使用することができる。

Introduction

複雑で異種の環境からユニークな行動を持つ細胞の単離は、生物学¹で遺伝情報を得るための基本である。微生物学では、ゲノム情報と観察可能な現象情報との関連を必要とする多くの用途において、観察後の希少微生物またはユニークな微生物の選択と分離が重要になります。これらのアプリケーションには、変異ライブラリー²から、典型的に希少株を選択し、複雑な微生物群集^3、4からキーストーン微生物を選択し、アイソジェニック集団から異種的に稀だが重要な細菌を選択する。細菌集団からの生存可能だが非培養可能な細胞(VBNC)の単離は、VBNC表現型を有する細胞が1:10²から1:10⁵比^5,6で細菌集団に隠されることが多い後者の重要な例である。細菌の分離における広範な困難のために、多くのフェノタイプの希少微生物について多くの未知のままである。これらの制限は、まず混合物から標的細胞を特定し、次に下流の分子解析のためにそれらを取り出して単離する細胞分離技術の必要性を強調する⁷.

細胞分離の最も一般的に確立された方法のいくつかは、フローサイトメトリーおよび蛍光活性化細胞選別(FACS)8、免疫磁性分離^9、10、およびマイクロ流体¹¹を含む。これらの分離方法は高い価値を持ちますが、使用を制限する欠点もあります。例えば、FACSは、フォローアップゲノム解析³のために単細胞レベルでルーチン微生物分離を提供することができるが、多くの場合、その可用性と費用、ならびに下流汚染問題¹¹によって制限される。マイクロ流体流量サイトメトリーのようなマイクロ流体ベースのアプローチは、多くの注目を集めているが、これは、従来のフローサイトメトリーと比較して、必要なサンプル体積の大幅な減少を^{可能にする12。}しかし、マイクロ流体デバイスからの個々または小さな細胞の集合の分離と検索は、多くの場合、より複雑なセットアップとデバイス設計¹³を必要とする困難な問題である。多くのマイクロ流体ベースのアプローチは、細胞が入力される前に遺伝的に特徴付け、デバイス¹⁴で観察され、機能画面を実行する際に観察される固有種の数を制限する。これらの制限を考えると、多くの研究室で広く使用するためには、細胞スクリーニングと分離に実用的な方法と材料の両方のさらなる革新が必要です。

本論文は、細菌のスクリーニングと単離のための新しい材料ベースのアプローチを提示する。この方法では、細胞カプセル化、培養、顕微鏡観察、およびユニークなフェノタイプを有する標的菌のオンデマンド放出および回収に光分解性ヒドロゲルを使用する。ヒドロゲルは、10 nmメッシュサイズを含む設計されており、各架橋にはo-ニトロベンジル基¹⁵が含まれています。この材料は、培養のために細胞との間で栄養素や廃棄物の拡散を可能にしながら、観察のために細胞をカプセル化またはトラップします。直立した顕微鏡を介してパターン化された365nm UV光源に材料を露出させることは、o-ニトロベンジル基^16,17の光切断を通じてヒドロゲルの局所分解を可能にする。分解は、ゲノム解析や、潜在的にプロテオミクスおよび転写分析を含む下流分析のための細胞の選択的放出を引き起こします。実験のセットアップとプロトコルは、比較的簡単で、安価で、微生物学の研究室への翻訳です。ヒドロゲル形成による細胞カプセル化、直立した明視野および蛍光顕微鏡による捕捉細胞の観察、および検索のためのパターン化されたUV光源による目的の細胞の照明のみを必要とする。

この材料ベースのスクリーニングアプローチの主な利点は、異なるスクリーニングフォーマットへの適応性です。最も基本的な形式では、材料はバルクヒドロゲルで異種細胞のコレクションをカプセル化することによってスクリーニングに使用することができる。次に、細胞は所望の表現型について観察され、目的の個々の細胞はゲノム特性解析のために除去される。より精巧なフォーマットでは、材料はまた、デバイスの所望の領域からの正確な細胞放出および検索を提供するために、ラボオンチップデバイスに統合することができる。両方の形式がここに記載されており、両方とも最近の新しい微生物スクリーニングと選択^{アプリケーション17、18、19}を可能にしています。この方法は、モデルグラム陰性生物(大腸菌、アグロバクテリウム・トゥメファシエンス)およびモデルグラム陽性生物(枯草菌)と共に、他の様々な細菌に容易に拡張された。

Protocol

1. 細菌株および培養プロトコル

1. 適切な成長培地を補った寒天プレート上の細菌のストリークコロニー。このレポートでは、B.スタイリス(株1A1135、バチルス遺伝ストックセンター)はATGN(0.079 M KH₂PO 4、0.015M(NH₄₎₂SO_4、0.6mM MgSO₄·7H₂O、0.06 mM CaCl_22H2O、0.0071mMMMMMMNで培養されています。H₂O, 0.125 M FeSO_4·7H₂O, 28 mMグルコース, pH: 7 ± 0.2, 15 g/L寒天) 寒天プレート 100 μg/mL 分光マイシンと大腸菌(株 25922, ATCC) ATGN寒天プレートに100 μg/mLアンピシリンを補った。
   注:以前のヒドロゲルカプセル化とFattahiららからこれらの材料で放出の以前の報告は^{、代わりに}A.tumefaciens C58細胞を使用しました
2. ATGN寒天プレートから望ましいコロニーを選び、一晩培養を開始します。ここで用いる 大腸菌 及び B.サチリス 株については、ATGN液培地中で215rpmで24時間振盪しながら37°Cで培養する。細胞培養物を-80°Cで50%保存し、今後使用する。
3. 無菌接種ループを使用してグリセロールストックから両方の株のコロニーを選び、37°Cと215 rpmで24時間ATGN液体培地でインキュベートします。

2. ヒドロゲル形成に必要な材料の調製

1. 光分解性PEG-o-NB-ダイアクリレート合成
   注:PEG-o-NB-diacrylateの社内合成は、よく説明されており、以前に報告された^16、17。あるいは、合成が日常的であるため、化学合成施設から外注することができる。
2. 架橋バッファ
   1. 細菌株のために選択された培地のレシピを取り、2倍の栄養素でメディアを準備します。リン酸塩を加える、例えば_{、NaH2PO4、}培地を100mMの最終濃度にする。次に、5 M NaOH(aq)を使用してpH値を8に調整します。
   2. バッファー溶液を殺菌し、さらに使用するまで-20 °Cで保管してください。
      注:これらの金属は、ジスルフィドにチオールの酸化を触媒するので、メディアに存在する任意の遷移金属を除外します。
3. PEG-o-NB-ダイアクリレート溶液
   1. アリコートPEG-o-NB-diacrylate(3,400 Da分子量)粉末のmgごとに、3.08μLの超純水を加え、PEG-o-NB-diacrylate(98 mMアクリレート濃度)の49 mM濃度に達します。
   2. 溶液がよく混ざるまでボルテックスし、さらに使用するまで-20°Cで保存する。
4. 4アームPEGチオール溶液
   1. 4アームPEG-チオール(10,000 Da分子量)調製のために、mg粉末あたり4μLの超純水を加えて20mM濃度(80mMのチオール濃度)に達します。
   2. この溶液が十分に混合されるまでボルテックスし、さらに使用するまで-20°Cで保存します。

3. パーフルオロアルキレートド(非反応性)カバーリップの調製

1. ポリプロピレン製スライドメーラーの中に最大5枚のスライド(25mm x 75 mm x 1 mm)を入れます。2%(w/v)洗剤溶液(表)で20分間スライドを超音波処理します。
2. 超純水でスライドを3回リンスし、20分間水でスライドを超音波処理します。N₂のストリームを使用してスライドを乾燥させます。
3. 2分間のセクション4.1のプロトコルに従って、ガラススライドの両側のプラズマクリーン( 材料表を参照)
4. プラズマクリーニングスライドをスライドメーラーに戻し、トルエンのトリクロロ(1H、1H、2H、2H、パーフルオロオクチル)シランの0.5%(v/v)溶液で容器を満たします。これらのガラススライドを室温(RT)で3時間機能させます。
5. スライドが機能した後、スライドメーラー内のスライドを、まずトルエンと次のエタノール(各溶媒で3回ずつ)ですすます。次に、各機能化スライドを_N2のストリームで乾燥させます。

4. チオール機能化(塩基)カバーリップの調製

1. プラズマクリーナーを使用したガラスカバーリップのクリーニング
   1. ペトリ皿に18 mm x 18 mmのカバーリップを入れます。次に、ペトリ皿をプラズマクリーナーチャンバーに入れ、プラズマクリーナーの電源をオンにします。
   2. 真空ポンプをオンにして、圧力計が400 mTorrを読み取るまでチャンバー内の空気をクリアします。
   3. 計量弁を開けて、圧力計が安定した圧力(800-1000 mTorr)に達するまで空気をチャンバーに入れます。次に、「Hi」モードでRFを選択し、3分間カバーリップを露出させます。
   4. 3分後、RFモードと真空ポンプをオフにします。
   5. ペトリ皿をチャンバーから取り出し、カバーリップをひっくり返し、チャンバーに戻してガラスカバースリップの反対側をプラズマに戻します。
   6. ステップ 4.1.2~ 4.1.4 を繰り返して、ガラスカバースリップの未処理の側をプラズマクリーニングします。
   7. プロセスが完了したら、チャンバーからペトリ皿を取り出し、プラズマクリーナーと真空ポンプをオフにします。
2. ピラニア溶液を用いてカバーリップの洗浄とヒドロキシル化
   注:標準的なピラニアクリーニングプロトコルは、ガラススリップのクリーニングおよびヒドロキシ化に使用できます。ピラニア溶液は_{、H2 O2}と_{H2 SO4}の30:70(v/v)_{混合物である。}ガラスカバーリップを洗浄する別の方法も使用できます。
   注意:ピラニア溶液は、有機溶媒と強く腐食性と爆発性であり、細心の注意を払って処理する必要があります。適切な個人用保護具(ラボコート、耐薬品性エプロン、安全メガネ、フェイスシールド、耐酸性ブチル手袋)の使用など、適切な安全性と封じ込め対策を実施する必要があります。ピラニア溶液に接触するすべてのガラス製品および作業面は、使用前に清潔で乾燥し、有機残渣を含まない必要があります。ピラニア溶液は、部分的に閉じた容器または閉じた容器に保管しないでください。
   1. ヒュームフードの下に調整可能な攪拌速度を備えたホットプレート磁気スターラーにクリーンな100mm x 50 mmガラス皿を置き、14 mLのH₂SO₄ を皿に加えます。
   2. 皿の中にテフロンコーティングされた鉗子を使用して、小さなテフロンコーティングされた磁気スターバーをそっと置きます。その後、酸の飛散を避けるためにゆっくりと攪拌機を回します。
   3. 次に、6 mLの_H2O2を皿に加え、溶液をよく混ぜるようにします。
   4. スターラーをオフにし、鉗子を使用して皿からかき混ぜるバーを取り除きます。次に、鉗子を使用して皿の中にカバースリップをそっと入れ、温度を60〜80°Cに設定します。
   5. 30分後、鉗子を使用してカバーリップを静かに取り出し、脱イオン水(DI)水に2回沈め、残留ピラニア溶液を洗い流します。
   6. 水ですすった後、さらに使用するまでRTでDI水にカバーリップを保管してください。
   7. ホットプレートをオフにし、ピラニア溶液を冷却させます。
   8. ピラニア溶液を処分するには、冷却されたピラニア溶液を含む100mm x 50mmガラス皿を、少なくとも1.5Lの体積のより大きな空のガラスビーカーにそっと入れます。その後、水1Lを加え、希釈し、炭酸水素ナトリウム粉末を加え中和します。炭酸水素ナトリウムはバブリングと発熱を引き起こし、非常にゆっくりと添加する必要があることに注意してください。そうでなければバブリングは酸の飛散につながる可能性があります。さらに炭酸水素ナトリウムを添加してもバブリングを起こさない場合は、pH紙でpHをチェックして中和されていることを確認してください。溶液が中和され冷却されたら、それはシンクを注ぎ込むことができます。
3. カバーリップのチオール機能化
   1. 乾燥トルエンで(3-メルカプトプロピル)トリメトキシシラン(MPTS)溶液の269 mMの5%(v/v)溶液を調製する。
   2. 個々の50 mL円錐形遠心分離チューブに溶液の10 mLを加え、各チューブに1つのクリーニングカバースリップを入れて、溶液内に沈めます。
      注:50 mLチューブあたり1つのカバースリップは、他の基板によって妨げられることなく、基板の両側のティラクションを保証するために使用されます。
   3. 4時間後、各カバースリップ(カバースリップあたり4回の洗浄)をトルエン、1:1(v/v)エタノール:トルエン混合物、およびエタノールで洗浄します。
      注:これは、記載されたソリューションを含む円錐形遠心分離管に各カバースリップを順次浸漬することによって行われます。
   4. 基材をすすいた後、エタノールに浸し、さらに使用するまで4°Cで保管してください。
      注: カバーリップの数によっては、カバーリップを一度に 1 つずつ処理するため、この方法は面倒になる可能性があります。複数のカバーリップの場合、同時に複数のカバーリップにフィットするコロンビアの瓶を使用できます。

5. シリコンマイクロウェルアレイの製造

1. パリレンコーティング: 前の研究記事^20,21に記載されている標準プロトコルを使用して^、シリコンウェーハにパリレンをコーティングします。
2. マイクロファブリケーション: Barua ら¹⁸ で説明したプロトコルに従って、マイクロウェルアレイを設計および製造します (補足図 1)。
   注:Timmららで説明した標準的なフォトリソグラフィー^技術を、 パリレンコーティングされたシリコンウェーハ上のマイクロウェルアレイを作製するために適用されました。

6. ヒドロゲル形成

1. ガラスカバーリップ上のバルクヒドロゲル形成
   1. ヒドロゲル前駆体溶液:0.5 mLマイクロ遠心分離チューブに12.5μLの架橋バッファーを加え、PEG-o-NB-ジアクリレート溶液を5.6 μL加えます。最後に、6.9 μLの4腕PEG-チオール溶液を混合物に加えます。
      注:混合物に4腕PEGチオールを加えることは、架橋反応を開始します。したがって、ヒドロゲル前駆体溶液は、混合後すぐに使用されるべきである。
   2. ヒドロゲル前駆体溶液の細胞カプセル化については、手順 6.1.3-6.1.9 に従ってください。
   3. 細胞カプセル化の場合、ステップ6.1.1の前に、目的の細胞密度で架橋バッファを接種する。19に報告されたように、架橋バッファー内の7.26×10⁷ CFU/mLの細胞密度が、ヒドロゲルを横切って封入された~90細胞^/mm2の密度に相関することが観察された。
   4. きれいなペトリ皿の上にチオラ化されたベースカバースリップを置きます。カバースリップの 2 つの反対側に 2 つのスペーサー (「 材料表」を参照) を配置します。
      注:カバーリップのチオール機能化は、カバースリップ表面へのヒドロゲルの共有結合に必要です。これは、ヒドロゲル前駆体溶液中に存在する表面上のチオール基とアクリレート基の反応を通じて行われる。
   5. スペーサーをペトリ皿にテーピングして、ベースカバースリップのスペーサーを固定します。
   6. ピペットは、非反応性、パーフルオロアルキル化ガラススライド上の前駆体溶液の所望の容積を有する。
   7. パーフルオロアルキル化ガラススライドをベースカバースリップの上に置きます(図1C)。水素ゲル形成が完了するまでRTで25分待ちます。
   8. ゲル化後、パーフルオロアルキル化ガラススライドを静かに取り除きます。ハイドロゲルはベースカバースリップに取り付けられたままになります。
      注:18 mm x 8 mm のカバーリップで 12.7 μm の厚さの膜を得るために、前駆体溶液の 7 μL を使用します(図1A,B)。より大きい量の前駆体溶液を使用すると、ベースカバースリップの下にヒドロゲルが生じる可能性があります。これにより、ベースカバースリップがペトリ皿にくっつき、取り外しの試みで壊れることがあります。また、カバースリップの下のヒドロゲル残渣は顕微鏡検査では問題があります。非反応性パーフルオロアルキル化ガラススライドの穏やかな除去は、速い除去がヒドロゲルを損傷する可能性があるとして必要とされる。
   9. 指定した培養培地に60mm x 15mmのペトリ皿に基板を入れます。ここで、37°Cで B.サチリス 用100μg/mLスペチノマイシンを補ったATGN培地、または37°Cで の大腸菌 に対する100μg/mLアンピシリンを24時間培養に使用した。

図1:チオラ板ガラスカバーリップ上のヒドロゲル形成(A)厚さ12.7μmのスペーサーは、反応性チオール基を含むベースカバースリップの反対側に配置される。(B)ヒドロゲル前駆体溶液は、非反応性のフッ素ガラススライド上に配管される。(C)非反応性ガラススライドは、12.7 μm厚いヒドロゲルの形成のためにスペーサー上に置かれます。(D)非反応性ガラススライドを緩やかに取り外し、塩基カバースリップに付着したヒドロゲルを残す。(E)調製されたヒドロゲルは、培養用培地中でインキュベートすることができる。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

7. マイクロウェルアレイ上のヒドロゲル形成

1. マイクロウェルアレイに播種する細菌
   注:0.1 OD₆₀₀ セル懸濁液の700μLをマイクロウェルアレイ基板に播種し、Timmらが記述したプロトコルを用いてバックグラウンドから細胞を除去するためにパリレンリフトオフ法を適用した。²².
2. 12.5 μLのpH 8リン酸緩衝生理食塩水ATGNでPEG-o-NB-diacrylateの5.6 μLを加え、4アームPEGチオール溶液の6.9 μLと混合して、ヒドロゲル前駆体溶液を調製します。
3. ピペット12.5μLの前駆体溶液を非反応性のパーフルオロアルキル化ガラススライド上に配置し、細胞を接種したマイクロウェルアレイ基板の2つの反対側に2つの38μmのスチールスペーサー( 材料表を参照)を配置します。
4. 前駆体液滴でパーフルオロアルキル化ガラススライドを反転し、マイクロウェル基板の中央に液滴を置きます。次いで、水素ゲル形成のためにRTで25分間インキュベートする。
5. マイクロウェル基板からガラススライドをそっと取り外します。ヒドロゲル膜は、マイクロウェル基板に付着したままにする必要があります。ステップ 6.1.9 に進みます。

8. 細胞抽出のための材料調製

1. PDMS ホルダーの準備
   1. 10個の18 x 18 mmのカバーリップのスタックをテープでつなぎ、このカバーリップのスタックをペトリ皿の底に接着します。
   2. PDMSホルダを製造するには、プラスチックカップで10:1体積比のPDMS前駆体と硬化剤を混合し、真空デシケーターで混合物を脱気し、その混合物をペトリ皿に注ぎます。
   3. 80°Cで90分間PDMSを硬化させる。 次に、テーピングされたブロックの周りを切ってPDMSホルダーを取り外し、PDMSホルダーをガラススライドに置き、顕微鏡検査の取り扱いが容易になります。
2. マイクロシリンジおよびチューブの準備
   1. 20cmのPTFEチューブ(I.D.で0.05)をカットし、チューブの一方の端を100 μLマイクロリットルのシリンジに取り付けます。
      注:抽出のために、ピペットチップを介して放出された細胞を描画すると、ヒドロゲル表面が損傷し、汚染につながる可能性がありますので、ピペットを使用しないでください。

9. パターン化された照明ツールによるヒドロゲル劣化

注: このセクションで説明する以下の手順は、手順 9.6.4-9.6.6 および 9.6.7-9.6.10 で説明されている光の露出パターンを除いて、バルクハイドロゲルとマイクロウェルアレイの両方で同じです。

1. 顕微鏡をオンにします( 材料表を参照)。次に、パターン照明ツールをオンにします(「 材料表」を参照)。
2. 365 nm LED の光源アナログおよびデジタル制御モジュールをオンにします。次に、LED光源制御モジュールの電源を入れます。
3. 顕微鏡ソフトウェアとパターン照明ツール用のソフトウェアを開きます。ハードウェア構成ウィンドウが開いたら、「 ロード」 ボタンを選択します。
   注: 3 台のデバイスがここに読み込まれます。(サードパーティカメラ、コントロールモジュール、パターン照明ツール)
4. [スタート]ボタンを押します。ライトパターニングソフトウェアウィンドウが開きます。ウィンドウの左側のサイドバーにある最初のオプション「デバイスコントロール」ボタンを選択します。
5. パターン照明ツールを調整します。
   注:キャリブレーションは、光の露出に使用されるのと同じ顕微鏡の目的とフィルタで行う必要があります。
   1. 顕微鏡の目的を10倍の倍率に設定します。
      注:この倍率により、顕微鏡レンズとサンプル表面の間の動作距離が十分に可能になります。また、画像ウィンドウを通してリアルタイムで検索プロセスを監視し、記録することができます。
   2. 顕微鏡レンズとフィルターを光暴露に使用する設定に設定し、キャリブレーションミラーを顕微鏡の下に置きます。
   3. [デバイスコントロール]ウィンドウで 、[LEDコントロール ]タブを押します。LED #1 をオンにして、光の強度を希望の数値に設定します。標準的な抽出実験では、これは60%に設定される。
   4. デバイスコントロールウィンドウで、パターン付きイルミネーションツール製品名のタブを押します。次に、[ グリッドを表示 ] ボタンを押します。
      メモ:キャリブレーションミラーにグリッドパターンが投影されます。
   5. 顕微鏡の焦点とカメラ露出を調整してグリッドの高画質を得て、必要に応じてカメラのウィンドウフレームに平行にグリッド線を整列させるためにカメラを回転させます。
   6. パターン照明ツールの製品名のタブの下にある 「キャリブレーションウィザード 」ボタンを選択し、このウィンドウでソフトウェアの指示に従います。
      メモ:サードパーティ製のカメラ設定ウィンドウが開きます。
   7. キャリブレーションタイプ選択ウィンドウが開きます。[ 自動調整] を 選択し、[ 次へ] を押します。
   8. [調整前調整]ウィンドウが開いたら、ソフトウェアの指示に従い、[ 次へ ]ボタンを押します。
   9. [マッピング情報]ウィンドウが開いたら、必要なフォルダにこのキャリブレーションを保存します。これは、日付、顕微鏡名、対物レンズ、フィルターを入れることによって行われます。
   10. キャリブレーション後、パターン照明ツールの製品名のタブの下にある [作業領域の定義 ]ボタンを押して、必要に応じてパターン照明ツールの作業領域を定義します。
6. パターンの準備のためのシーケンス設計セクション。
   1. ソフトウェアウィンドウの左側の「 シーケンスデザイン 」ボタンを押します。次に、 プロファイルシーケンスエディタ ボタンを押します。
   2. 「プロファイル・シーケンス・エディタ」ウィンドウが開いたら、「 プロファイルリスト」の下の「新規プロファイル」オプションを選択します。
      注: これで、パターンエディタウィンドウが開きます。
   3. さまざまなパターンの形状とサイズを選択して、光の露出に必要なパターンを準備するか、必要に応じて手動でパターンを描画します。
   4. バルクハイドロゲルの円と破れたクロスパターンについては、手順9.6.5~ 9.6.6
   5. 円パターンの場合、コロニー全体を覆う目的の細菌コロニーの上に直径30μmの円を定義します。図形塗りつぶしの色を白く選択します。
   6. 破れた十字パターンの場合は、3 μm x 8 μm の寸法のパターン描画ウィンドウから長方形の形状を選択します。ターゲットコロニーの端にこの次元を持つ4つの長方形を配置し、パターンの半分はコロニーとのオーバーレイを持ちます。
   7. マイクロウェルアレイの円とリングパターンについては、手順9.6.8~9.6.10に従います。
   8. 円パターンの場合は、ウェル周囲の周囲に直径10μmの円を描きます。図形塗りつぶしの色を白く選択します。
   9. リングパターンの場合は、直径20μmの円を描き、井戸の上に置き、白い形状塗りつぶし色を選択します。
   10. 直径10μmの別の円パターンを塗りつぶし形状の色を黒く描き、ウェルの周囲に配置します。
7. パターンを編集し、目的の抽出方法に基づいてシェイプを修正します。パターン照明ツールの作業領域内に目的のパターンが存在することを確認します。
8. サンプルをPDMSホルダに入れ、サンプルの上に定義された培地をピペットして、サンプルの脱水を防ぎ、放出された細胞にキャリア溶液を提供します。
9. 次に、これをキャリブレーションミラーに交換します。
10. 顕微鏡の焦点を合わせて、ヒドロゲル内のコロニーの鮮明な画像を得ます。目的のコロニーを識別するためにコロニーを検査します。
11. ここでは、カメラビューがサンプル内のコロニーを示しながら光パターンを設計し、細胞抽出のための異なるパターンをテストします。
12. 定義されたパターンを保存します。定義したパターンを保存した後で、セッション制御セクションを選択します。
13. このセクションでは、パターン照明ツールの製品名のタブの下に、保存されたシーケンスを追加します。
14. シーケンスを追加した後、表示するパターンをシミュレートし、露出の目的の位置に合わせて調整するオプションを選択します。
    注: ここでサンプルの位置を調整して、パターンがターゲット領域に正確に投影されるようにすることができます。
15. 次に、LED制御タブで光強度を60%に調整し、露光時間を40 sに調整し、露光プロセスを開始します。
16. リアルタイムおよび明視野モードでヒドロゲルの劣化を監視し、セルの放出を確実にします。
    注: クロスコンタミネーションをもたらすヒドロゲルの不要な領域の劣化を引き起こす可能性がありますので、光暴露中にサンプルへの動きを防ぎます。

10. 細胞の検索

注:細胞の検索手順は、バルクヒドロゲルとマイクロウェルアレイの両方で同じです。

1. 365 nm光暴露および細胞放出後、マイクロリットルシリンジおよびマイクロ流体チューブを用いて細胞を収集する(図2)。
   メモ:セルの取得は、パターンの露出の直後に行う必要があります。これにより、放出された細胞が照射された領域から離れる前に、局所的な細胞回復が可能になります。
2. 顕微鏡を明視野からFITCまたはTRITCフィルターに変更し、肉眼でサンプルの露出領域を可視化できるようにします。
3. 露出した領域が見つかったら、照射された場所にチューブの端を置きます。次に、顕微鏡フィルターを明視野に戻し、リアルタイムで細胞の検索を監視します。
4. チューブの反対側に取り付けられたシリンジを使用して、放出された細胞を慎重に引き出します。溶液の200 μLを取り出し、DNA分析またはめっきのために1.5 mL遠心分離管に溶液を挿入します。

図2:ヒドロゲルから放出された細胞を採取するための抽出方法の概略図。 ここで、365nmのUV露光、ヒドロゲル分解、および細胞放出の直後に、顕微鏡を用いてTRITCフィルターからの光でヒドロゲルサンプルを照射し、細胞放出が生じた領域を覆う明るい緑色のスポットを生じる。これにより、サンプル コレクションの空間的な位置を特定するのには、ユーザーを支援します。この領域を視覚化した後、マイクロリットルシリンジに取り付けられた回収チューブがこの場所に配置され、サンプルが収集されます。10倍の倍率での明視野顕微鏡は、正確な細胞収集のためにチューブとヒドロゲル表面の端をリアルタイムで監視するために使用されます。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

11. ゲノムDNA精製とDNA品質測定

1. DNA精製キット( 材料表を参照)を使用して、細菌分離物からDNAを抽出します。
   1. 最後のステップ(ステップ7)までDNA精製キットハンドブック²³ に記載されているメーカーの仕様に従い、バッファAEとの溶出を必要とする。
   2. 溶出ステップでは、200 μLではなく100 μLのバッファAEを使用する違いがあるメーカーの仕様に従ってください。
   3. ステップ11.1.2で説明したように溶出を1回繰り返す。このステップは、全体的なDNA収量の増加につながります。
2. UV-Vis分光光度計を使用してDNAの品質を測定する( 材料表を参照)。
   1. 分光光度計をオンにします。デバイスの初期化後、ホームページで、画面で dsDNA オプションを選択します。
   2. 次に、台座のアームを持ち上げ、DI水と糸くずのないワイプで台座の位置をきれいにします。
   3. ピペット2 μLのブランク溶液、ここではAEバッファーを台座位置に置き、ペデスタアームをそっと下に持ってきて、画面上の ブランク を選択します。
   4. 次に、台座を持ち上げ、DI水でペダー位置を清掃し、前の測定から残った材料を除去します。
   5. サンプル(2 μL)を台座の位置にロードし、台座のアームを下に持ってきて、画面上の 測定 ボタンを選択します。
   6. すべてのサンプルについて、手順 11.2.4 および 11.2.5 をやり直します。
   7. 測定が完了したら、画面で「実験終了」を選択します。フラッシュドライブをデバイスに挿入し、画面の「データをエクスポート」を押します。

12. ヒドロゲルおよびマイクロウェル抽出物からの細胞生存率の決定

1. 96ウェルプレートを使用して、希釈因子10⁵ で細菌懸濁液を希釈します。
2. 希釈細菌懸濁液のピペット10 μLを、各細菌懸濁液のATGNプレートに3回スポットします。
3. プレートを傾けて寒天表面にセルを広げます。細菌懸濁液を含むATGNプレートを空気乾燥させます。
4. 37°Cでプレートを48時間インキュベートします。コロニー形成単位(CFUs)番号をカウントして記録します。各プレートに細菌懸濁液の3つのスプレッドをすべて数えます。
   メモ:プレートの汚染を避けるために、生物学的安全キャビネットでステップ12.1-12.4を実行します。

Results

細胞放出に対して制御されたヒドロゲル分解を引き起こすUV光の能力を調べるため、ヒドロゲルはまず細菌を含まないチオラ化カバースリップ上に封入された。各ヒドロゲルは、異なる強度および露光時間における光の3つの複製円パターンに曝露された。ゲル分解率は、各光強度でUV光曝露後に算出し、次いで蛍光イメージング^用蛍光-5-メーリミド色素とペンダントチオール基を結合して曝露時間を定量^した。これら2つのパラメータがヒドロゲル分解に与える影響の代表例を図3に示す。明らかなように、パターン照明ツールによって提供されるパターン化された光は、少数の細胞の放出のみを可能にする解像度でヒドロゲル分解の空間的時間的制御を提供する。

図3:ヒドロゲル分解の制御 UV光線量および得られるヒドロゲル分解速度は、パターン化された照明ツールを介して調整可能である。(インセット)パターン化されたヒドロゲル分解のために2つの異なる光強度を選択した。365 nmのUV光暴露後、ヒドロゲルを蛍光イメージング用フルオレセイン-5-マレミドで標識した。ファタヒら¹⁹ 著作権2020アメリカ化学会の許可を得て転載(適応)この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

細胞抽出では、異なる光パターンを用い、細胞放出を調べた(図4)。ここで、 アグロバクテリウム 菌細胞を、チオラ化ガラスカバーリップ上のバルクヒドロゲルに封入し、次いでマイクロスケールのコロニーに培養した。その後、ヒドロゲルを明視野顕微鏡で検査し、標的化されたマイクロコロニーを多様なUV光パターンにさらした。放出された細胞の形態に異なる露光パターンが影響を与えるのが観察された。これは、さまざまなアプリケーションに役立つ可能性があります。例えば、標的コロニーの周囲にリングパターンを露出すると、保護PEGヒドロゲルにカプセル化されたコロニー全体の放出が生じ、直接UV光暴露を伴わない(図4A)、細胞を保存し、下流の精製を容易にする可能性がある。これに対し、コロニーの一部または全部をUV光にさらすことによって、細胞は凝集細胞クラスター(図4B)として、または個々の細胞(図4C)として抽出することができる。

図4:抽出細胞の形態を制御する。(A)PEGマトリックスで保護された細胞コロニー全体を放出する環状パターンの使用。(B) 集合体におけるセル解放のための破断十字パターンの使用。(C) クロスパターンを使用して個々の細胞を放出する。Fattahiらの許可を得て転載(適合)、この図のより大きなバージョンを見るにはここをクリックしてください。

カプセル化プロトコルにおいて重要なのは、これらのパラメータの両方が観察のためにヒドロゲルに組み込まれる細胞の数に影響を与えることができるので、ヒドロゲルの細胞播種密度と厚さの両方である。実証するために 、A.tumefaciens 細胞サンプルを、薄いスペーサー(12.7 μm)または厚いスペーサー(40 μm)を使用して2つの厚さのヒドロゲルにカプセル化し、確立されたプロトコルに従って画像化した。より薄いヒドロゲルは、ヒドロゲル全体で90コロニー^/mm2 のマイクロコロニー密度をもたらし、そこでコロニーの重なりが最小限に見られた(図5A)。対照的に、12.7μmを超えるヒドロゲル厚は、重なり合うコロニーを垂直方向(図5B)に形成し、複数のコロニーを抽出することがある。コロニーの重なりは、光パターンの2次元的性質による抽出時に交差汚染を引き起こす可能性があります。例えば、トップコロニーを標的とすることができ、基礎となるコロニーもそれと一緒に抽出される(図5C)。そのため、12.7 μm のスペーサーを使用して、ヒドロゲル調製を推奨します。

図5:ヒドロゲルの厚さは抽出純度に影響を与える。(A)厚さ12.7μmのスペーサーをヒドロゲル形成に利用することで、10x焦点面内にコロニーが形成される。(B)厚さ12.7μmを超えるスペーサーを使用すると、コロニーの重ね合わせが10倍の拡大で観察される。(C)細胞放出中にコロニーのオーバーレイで交差汚染が起こり得る:(i)環状パターンが標的細胞コロニーを放出するために使用され、(ii)標的細胞コロニーがヒドロゲルから剥離し、(iii)第2に、標的コロニーの下の光暴露の間に下層コロニーが観察される。このコロニーも除去され、クロスコンタミネーションが発生します。ファタヒら¹⁹著作権2020アメリカ化学会の許可を得て転載(適応)この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

UV光を有する細菌に対する潜在的な損傷を考えると、多様なUV光微小パターンが細胞生存率に及ぼす影響をさらに検討したモデル、グラム陽性菌(B.サチリス)およびモデル、グラム陰性細菌(大腸菌)。それぞれバルクヒドロゲル内にカプセル化され、標準的なプロトコルに従ってマイクロスケールのコロニーに培養され、ヒドロゲルとの相溶性を検証した。その後、同じサイズの標的マイクロコロニー(直径26±1μm)は、マイクロコロニー全体をUV光にさらす円パターンまたはヒドロゲルエッジのみを分解して細胞への光暴露を最小限に抑える円パターンの形で、一定の光量(168 mJ/mm²⁾にさらされた。次いで、細胞を回収し、各コロニーから回収したCFU/mLを定量化するためにメッキした。セル回復レベルに有意差は見つからなかった (図6A)。さらに抽出した細胞の純度を調べるには、 大腸菌 試料からDNAを抽出し、UV-Vis分光光度計を用いて分析した。両方のパターンについて、DNAの品質レベルは、1.8から2.0の間のA₂₆₀/ A₂₈₀ 範囲(図6B)に収まり、ゲノムシーケンシング²⁵に理想的な範囲にある。これは、記載された条件下での放出に使用されるUVパターンが、バルクヒドロゲルから回収された生存細胞の量または抽出後のゲノムDNAの質に対する最小限の効果を有することを示している。

図6:バルクヒドロゲルから放出される細菌の細胞生存率およびDNA品質に対する異なる光暴露パターンの影響(A)クロスパターンおよび円パターンを用いた抽出後の大腸菌およびB.サブティリスの細胞回復レベル。今回の実験では、同じ直径(26μm±1μm)の球状コロニーから抽出を行い、各コロニーから放出される細胞の数が同等であることを確認しました。次いで、抽出した溶液をめっきし、各パターンから取得したCFU/mLを計算した。統計解析では、大腸菌とB.サチリスの両方のクロスパターンと円パターンから得られたCFU/mLに有意な差は示さなかった(p値>0.05、n=6の両方の株)。(B)クロスパターンと円パターンを用いた単離された大腸菌細胞のDNA品質の分光測定ここで、統計解析は、使用されるパターン(P値>0.05、n=6)(C)の交差および円パターンに露出した等直径を有するコロニーのブライトフィールド画像に対するDNA品質に有意な差を示さなかった。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

マイクロウェルアレイは、バルクヒドロゲルと比較してより制御されたスクリーニング機能を提供する代替のラボオンチップスクリーニングインターフェースを提供します。例えば、マイクロウェルアレイは、接種中の細胞の数を制御することができる離散培養部位への細菌の播種を可能にする。深さや直径などのマイクロウェルの幾何学的特徴も、標準的な微細加工方法によって制御されます。これらの利点により、マイクロウェルは空間閉じ込め²⁶の下で細菌の増殖を研究するのに有用であり、そして最近では、マイクロスケール¹⁸で一緒に閉じ込められたときに異なる細菌種間の共生的および拮抗的相互作用の発見に有用であった。16Sアンプリコンシーケンシングなどのゲノム解析のためのウェルからの細胞抽出は、これらのアプリケーションにとって重要です。同じヒドロゲル材料を使用して、UV光は、円またはリングパターンのいずれかとして、関心のある細胞を含むウェル上に露出することができる。 後者は、細胞の直接照射を防ぐために、マイクロウェル周囲でのみヒドロゲル分解を保証します。これを実証するために、mCherryを発現する A.トゥメファシエンス 細胞をウェルに播種し、次いでヒドロゲルをマイクロウェルアレイに取り付けた。細胞を培養し、次いで円または環状のいずれかのパターンで照射した。その後、膜をフルオレセイン-5-マライムダイで染色した。2色蛍光画像は、ウェル内の膜と細胞の両方が両方の照射パターン¹⁷について除去されることを明らかにした。バルクヒドロゲル形式とは異なり、ここでの細胞抽出は、細胞クラスター¹⁸の形状でのみ観察されている。

図7:マイクロウェルアレイからの細胞分離に対する光パターンの影響を示す代表的な共焦点顕微鏡画像(A)播種および培養後の細菌(赤)を含む直径40μmのマイクロウェル。(B)円とリングパターンを用いた光の露出(青色)。(C)赤蛍光の減少は、細胞が照射されたウェルから抽出されることを示す。(D)照射後の膜及び細菌の2色蛍光像は、ヒドロゲル(緑色)及び細菌(赤色)の両方を標的ウェルから除去したことを示す。(E)Zスタック、2色蛍光画像の標的ウェル。(D) の赤い線は xz でイメージされた xz 平面を示し、 (E) の緑の線は (D) でイメージされた xy 平面を示します。画像中のサンプル(C-E)を、放出細胞の除去のために洗浄し、次いで固定し、画像化した。スケールバー= 40 μmファン・デル・ヴリーズらの許可を得て転載(適応^)17.著作権 2019 アメリカ化学ソセティズ.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

この形式で抽出後の菌細胞の生存率およびDNAの質を定量化するために、B.サチリスおよび大腸菌細胞を播種し、培養し、円および環パターンを用いてマイクロウェルアレイから放出した(図8A、B)。次いで、放出された細胞をATGN寒天プレートにメッキし、抽出した細胞のDNA品質を定量化した。各抽出中に一貫した数の細胞が存在することを確実にするために、同様の蛍光強度(約6000 A.U.)を有するマイクロウェルが放出を標的とした。円パターンを用いて抽出された生存細胞の数は、いずれの細菌のリングパターンを用いて抽出した生存細胞の数と有意に異ならなかった(図8C)。また、DNAの品質レベルは、いずれの細菌についても円と環状のパターン間で有意に異ならなかった(図8D)。したがって、バルクヒドロゲルの所見と同様に、ここで指定された強度と持続時間におけるUV光の適用は、マイクロウェルアレイから抽出された細胞の生存率およびDNA品質にわずかな影響を与えた。これらの知見は、下流分析のための最小限の損傷で、生存可能な細菌細胞をマイクロウェルから選択的に取り出すことができることを示している。

図8:マイクロウェルアレイから放出される細菌の細胞生存率とDNA品質に対する異なる光暴露パターンの影響 (A,B) 大腸菌 と B.サチリスの両方に対して、円パターンと環パターンが10μmマイクロウェルからの細胞抽出に使用された。この実験では、直径10μmの円パターンと、内径10μm、外径20μmのリングパターンを用いた。同じ直径のマイクロウェルを使用して、各マイクロウェルから放出される細胞の数が同じであることを確認しました。(C)抽出した溶液をめっきし、各露光パターンから取得したCFU/mLを計算した。統計解析では 、大腸菌 と B.サチリス の両方について円および環状パターンから得られたCFU/mLに有意差は示さなかった(p値>0.05、n=6の両方の株)。(D)分光光度測定は、円と環パターンを用いて 大腸菌 および B.サブチリス 細胞の両方のDNAの質を測定するために使用された。ここで、統計解析は、使用されるパターンに対するDNA品質に有意な差を示さなかった(p値>0.05、n=6両方の株)。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図1:マイクロウェルアレイの設計と製作(A)シリコンウエハ上のマイクロウェルアレイを作製するために、標準的な微細加工技術を適用した。(B)各基板は、直径10μmのウェル7 x 7アレイで構成され、深さ20μm、ピッチ30μmです。(C)各アレイは225マイクロウェルで構成されています。この図はBaruaら¹⁸から変更されています。著作権2021フロンティアメディア。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

Discussion

この原稿は、細菌のスクリーニングおよび単離のための光分解性ヒドロゲルの使用を示す。材料とアプローチは、ハイスループット培養、成長培地と成長条件の制御、クリーンで正確な細胞抽出を簡単かつ費用対効果の高い方法で可能にします。抽出は、パターン化された照明ツールと結合された蛍光顕微鏡のみを必要とし、複数の細胞標的を分離するために逐次的に行うことができます。各抽出は、実行するのに5〜10分かかり、最大30の標的コロニーが単一のヒドロゲルから除去されています。このアプローチの主な利点は、バルクヒドロゲルとマイクロウェルアレイの両方からのスクリーニングでここで示すように、さまざまなアッセイフォーマットへの適応性です。両方の形式の分離プロセスは、培養後の下流のジェノタイピングのためのユニークな成長挙動を示す細菌の分離に成功し、細胞遺伝子型を表現型に接続するための重要な機能である顕微鏡観察。現在までに、これらのインターフェースから抽出された細菌のゲノム特性評価には、16Sアンプリコンシーケンシングが含まれており、創発的な成長挙動¹⁸を生成する環境マイクロバイオームから細菌の多種集合を同定し、全ゲノムシーケンシングのために変異ライブラリー¹⁹内に存在する細胞に稀な増殖プロファイルを引き起こす遺伝子変異を同定することに成功した。

細胞スクリーニングおよび単離のためにバルクヒドロゲルを使用することは、最も簡単でシンプルなフォーマットです。バルク光分解性ヒドロゲルは、透明なガラスカバースリップの上に前駆体を混合した後に急速に(25分)形成し、標準的な直立または反転した蛍光顕微鏡で画像化された3次元細胞培養マトリックスに細胞をカプセル化する。したがって、この方法は、マイクロファブリケーションリソースや専門知識を持たない一般的な微生物学の研究室に翻訳する可能性を秘めています。この形式の欠点は、セルが 3 次元ヒドロゲル全体にランダムに向いている点です。したがって、細胞コロニーが互いに近づきすぎたり、コロニーの垂直オーバーレイがある場合、より高い倍率の目的でイメージングする場合、細胞が焦点面外に現れる可能性があり、抽出が困難になる可能性があります。記載されているように薄いヒドロゲル(<13 μm)を堆積させることは、この欠点を軽減するために重要です。このパターンは、UV光への暴露を最小限に抑え、めっきによって容易に回収できるヒドロゲルを含まない細胞をもたらすので、壊れたクロスライトパターン(図4B)における露光が好ましい。

対照的に、マイクロウェルアレイフォーマットは、細菌細胞が小さな培養または共培養部位^17、18、26として機能する離散的なマイクロウェルに分割されるため^、よりよく制御されたインタフェース^を提供する。マイクロウェル寸法、ピッチ、密度は、標準的なフォトリソグラフィ技術を用いて精密に製作されています。バルクヒドロゲルと比較して、細菌は、細胞がヒドロゲル全体にランダムに分散されていない、事前定義された場所にのみ存在するので、特異性の高い程度とクロスコンタミネーションの可能性が低いマイクロウェルアレイから抽出することができます。播種溶液中の細菌細胞の濃度と比率は、以前のレポート²⁶で特徴付けられてきた播種プロセスを通じてマイクロウェル接種の量および組成を制御するために変化させることができ、スクリーンの実験設計においてユーザに柔軟性を与える。マイクロウェルアレイ形式によるスクリーニングの主な欠点は、マイクロファブリケーションに必要な時間と専門知識の追加です。マイクロウェルの製造は、材料費とクリーンルーム費用を含むアレイあたり〜10ドルの費用がかかると見積もられました。さらに、マイクロウェルアレイはシリコン製であり、基板が透明でないためイメージングが困難になる可能性があります。さらに、シリコン表面からの光散乱量が多いと、マイクロウェル内の撮像が制限され、パターン化された照明ツールからのUV光によるヒドロゲル露光時のパターン分解能を低下させることができます(図8A、B)。同様のマイクロウェルは、これらのタイプの制限に対処するために透明な石英基板上で製造されています^。しかし、この製作はかなり難しい。ウェルの周囲を照らすリングパターンへの暴露は、UV露光を最小限に抑えながらウェルから自由な細胞を放出することがここで好ましい。

いずれの形式でも生じる最も一般的な問題は、ヒドロゲルの膨潤による培養中の基質からヒドロゲルの剥離である。これがバルクヒドロゲルの問題である場合、ベースガラスカバースリップの表面を横切る化学(MTPS)アタッチメント層におけるチオール基の存在、密度、均一性は、適切な表面特性評価技術(XPS、ATR-FTIR、AFMなど)を使用して検証する必要があります。非効率的な表面官能化による表面チオール基の低密度は、基材とヒドロゲルとの間の弱い相互作用を引き起こす可能性があります。低レベルの表面のチオラクションが発生した場合は、MTPS溶液の安定性をチェックする必要があります。MTPS処理の前にきれいな表面を確保するために、ガラススライドの最初のクリーニングに注意を払う必要があり、MTPS表面反応中に無水トルエンの使用を確実にするように注意する必要があります(プロトコルセクション4)。マイクロウェルアレイの場合、表面はチオラートされず、ヒドロゲルは代わりにヒドロゲルでウェルの部分的な充填を介して付着し、ヒドロゲルをシリコン基板¹⁷に固定する。ハイドロゲル剥離がこのシステムで問題である場合、より多くのマイクロウェルまたは他のマイクロスケールの特徴を配列にエッチングして、より強いアタッチメントを促進するためにさらに基板にハイドロゲルを固定することができます。

いずれの形式における技術の制限は、細菌の存在下におけるヒドロゲルの安定性が限られている。A.ツメファシエンスのようないくつかの細菌は、実験時間を制限する5-7日^17、19の間にヒドロゲルを分解することができることが指摘されている。細菌分解のメカニズムの現在の調査が進行中です。他のシステム¹⁷に記載されているように、ジアクリレートモノマーから存在するエステル基は、細菌媒介性加水分解および/または酵素分解の対象となると仮定される。より安定したヒドロゲル化学を開発することは、細菌がヒドロゲルに残ることができる時間を延長し、より遅い増殖速度を有する微生物にスクリーンを拡張する。2 つ目の制限は、両方のフォーマットで、細胞の回収と抽出がオープン環境で発生し、比較的高い抽出量 (30 ~ 100 μL) が発生し、外部汚染の影響を受けやすいという点です。したがって、抽出液の体積を最小限に抑えながら、標的コロニーから十分な細胞が存在することを確認するために注意が必要です。めっきおよび回収またはDNA材料の抽出のために十分な細胞を得るためには、バルクヒドロゲルでは、細胞が少なくとも10μmのコロニー直径に達するのに十分な長さで培養されなければならないことが観察された。細胞抽出に必要な体積を下げるために、マイクロリットルシリンジおよびチューブ(図2)を用いてピペットよりも効率的であるが観察された。チューブにより、分離液をより正確に離型ポイントから引き出せるようになっており、溶液量を減らし、汚染の可能性を低くしました。

今後の研究は、ヒドロゲルの機械的特性が細胞増殖に及ぼす影響を理解することを含み、これらのヒドロゲルの機械的特徴は、種々の分子量²⁸の適切なPEGベースのモノマー前駆体の選択によって十分に制御され、そして機械的相互作用が細菌挙動²⁹において重要な役割を果たす可能性が高い。ヒドロゲル材料は様々な異なるシステムやデバイスに容易に組み込むことができるので、さらなる開発は、マイクロ流体システムへのこの材料の統合にも焦点を当てています。これにより、オープンコレクション形式で現在必要とされている従来の30〜100 μLの容積と比較して、フェムトリットルからピコリットルまでの量に対する抽出溶液が減少します。ソリューションの容積が小さいと、汚染の可能性が大幅に減少し、単一細胞の分離と特性評価に向けてアプローチが進みます。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
(3-メルカプトプロピル)トリエトキシシラン	Sigma-Aldrich	175617-25G	> 95%
アルコノックス 洗剤粉末	アルコノックス	1104
硫酸アンモニウム	フィッシャーケミカル	A702-500	認定 ACS粒状
オートクレーブ SK300C	ヤマトサイエンティフィック	18016
枯草菌 1A1135	バチルス遺伝資源センター	1A1135
明視野正立顕微鏡	オリンパス株式会社	BX51
塩化カルシウム、無水	フィッシャーケミカル	C614-500	デシケーター用 ペレット、4-20 メッシュ
遠心分離機 5702	エッペンドルフ	5702
クエン酸一水和物	Sigma-Aldrich	C1909-500G	ACS 試薬、> 99.0%
D-グルコース (デキストロース)	VWRアムレスコライフサイエンス	0188-1KG
ドネシー血液&ティッシュキット	Qiagen	69504	DNA精製キット
DOWSIL 184シリコーンエラストマーベース	ダウシリコーン株式会社		保管温度:-30-60 >C
DOWSIL 184 シリコーン エラストマー硬化剤	ダウ シリコーン株式会社		保存温度: < 32 C
EPOCH2 マイクロプレート分光光度計	BioTek Instruments	EPOCH2
大腸菌 ATCC 25922	サーモフィッシャーサイエンティフィック	R19020
エタノール、無水	フィッシャーケミカル	459844
フィッシャーブランド顕微鏡カバーガラス	フィッシャーサイエンティフィック	12540A
フィッシャーファイネストプレミアム顕微鏡スライドプレーン	フィッシャーサイエンティフィック	12-544-4
過酸化水素溶液	シグマ-アルドリッチ	216763-500ML	H2Oイン
キュシェイカーミニ	ベンチマーク	E5-0014-01
イソプロパノール	シグマアルドリッチ	190764
硫酸マグネシウム、7水和物	マクロンファインケミカルズ	6066-04	アバンター・パフォーマンス・マテリアルズ(株)
メタノール	Sigma-Aldrich	179337-4L	ACS 試薬、> 99.8%
NanoDrop One 分光光度計	Thermo Scientific	ND-ONEC-W
窒素、圧縮	Matheson	UN1066
酸素プラズマクリーナー	Harrick Plasma	PDC-001-HP
Pentaerythritol tetra(mercaptoethyl) polyoxyethylene (4 arm-PEG)	NOF AmericaCorporation	PTE-100SH	Sunbright-PTE-100SH
Phosphate buffered saline (PBS), 10X	VWR Amresco Life Science	K813-500ML	15 >C–30度;C
ポリジメチルシロキサン (PDMS) Slygard 184	Dow Corning	4019862
Polygon400	Mightex	DSI-D-000
プレミアム顕微鏡スライド	Fisher Scientific	12-544-4	25 x 75 x 1 mm
重炭酸ナトリウム	Sigma-Aldrich	S5761-500G
塩化ナトリウム	Sigma Life Science	S5886-500G	細胞培養に適したバイオ試薬
水酸化ナトリウム	Sigma-Aldrich	S8045-500G	BioXtra、> 98%、ペレット (無水)
リン酸ナトリウム 一塩基性二水和物	Sigma-Aldrich	71505-250G	BioUltra、分子生物学用、> 99.0% (T)
ステンレス鋼厚さ計	精密ブランド 製品	77739
硫酸	Sigma-Aldrich	320501-2.5L
トルエン、無水、99.8%	Sigma-Aldrich	244511-1L	無水、> 99.8%
トリクロロ (1H、1H、2H、2H パーフルオロオクチル) シラン (TPS)、97%	Sigma-Aldrich	448931-10G
トリプシン大豆ブロス	Sigma-Aldrich	22092-500G	微生物学用
Super Nuova デジタル ホット プレート スターラー	Thermo Scientific	S131825
超音波式超音波装置	フィッシャー・サイエンティフィック	FS-110H