方法論記事

生分解性インプラント材料をインビトロで研究するための直接的および間接的な培養方法

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DOI：

10.3791/63065

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2022年4月15日

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1Materials Science and Engineering Program, University of California, Riverside, 2Department of Bioengineering, University of California, Riverside, 3Stem Cell Center, University of California, Riverside

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

生分解性インプラント材料の in vitro 細胞適合性を評価するための直接培養、直接暴露培養、および暴露培養の3つの方法を紹介します。これらのインビ トロ法は 、異なる インビボ 細胞-インプラント相互作用を模倣し、様々な生分解性材料の研究に適用することができる。

要約

過去数十年にわたり、生分解性材料は、整形外科、歯科、および頭蓋顎顔面インプラントなどの生物医学的用途のために広く探求されてきた。生物医学的用途のために生分解性材料をスクリーニングするためには、これらの材料を in vitro 細胞応答、細胞適合性、および細胞毒性の観点から評価する必要がある。国際標準化機構(ISO)規格は、生体材料の評価に広く利用されています。しかし、ほとんどのISO規格はもともと非分解性材料の細胞毒性を評価するために設立されたため、生分解性材料のスクリーニングには限られた価値しか提供されていません。

本稿では、生分解性ポリマー、セラミックス、金属、およびそれらの複合体を含む生分解性インプラント材料の in vitro 細胞適合性を異なる細胞種で評価するための、直接培養法、直接暴露培養法、および暴露培養法の3つの異なる培養方法を紹介し、議論する。研究は、培養方法が生分解性材料に対する細胞応答に影響を与えることを示しており、その動的分解は界面および局所環境において時空間的な違いを誘発する。具体的には、直接培養法は、インプラントに直接播種された細胞の応答を明らかにする。直接暴露培養法は、インプラントと接触する確立された宿主細胞の応答を解明する。暴露培養法は、インプラントに直接接触していないが、インプラントの劣化による局所環境の変化の影響を受けている確立された宿主細胞を評価する。

この記事では、生分解性インプラント材料のインビトロ細胞適合性および骨髄由来間葉系幹細胞(BMSC)との相互作用を研究するためのこれら3つの培養方法の例を提供する。また、収穫、継代、培養、種子、固定、染色、細胞の特性評価、培養後の培地および材料の分析方法についても説明します。この記事で説明するインビトロ方法は、インビボ環境のさまざまなシナリオを模倣し、さまざまな生物医学的用途に対するさまざまな生体材料のインビトロ細胞適合性試験の適用性と関連性を広げます。

概要

何十年もの間、生分解性材料は、整形外科1,2、歯科3,4、頭蓋顎顔面5などの生物医学的用途で広く研究され、使用されてきました。永久的なインプラントや材料とは異なり、生分解性金属、セラミックス、ポリマー、およびそれらの複合材料は、生理学的環境における異なる化学反応を介して時間の経過とともに体内で徐々に分解する。例えば、マグネシウム(Mg)合金1,6,7や亜鉛(Zn)合金8,9などの生分解性金属は、骨固定装置用の有望な材料である。それらの生分解性は、骨治癒後にインプラントを除去するための二次手術の必要性を排除する可能性がある。リン酸カルシウムセメント(CPC)などの生分解性セラミックスは、経皮的脊柱後弯形成術における骨粗鬆症性椎体圧迫骨折の治療にエキサイティングな可能性を示しています10。CPCは、骨折した椎体に機械的サポートを提供し、骨折が治癒した後に徐々に劣化する。

いくつかの多糖類やポリエステルなどの生分解性ポリマーも、生物医学的用途のために広く探求されている。例えば、生分解性多糖類としてのキトサンハイドロゲルは、感染予防や皮膚組織の再生にその能力を発揮しています11。ポリ-L-乳酸(PLLA)、ポリ(グリコール酸)(PGA)、およびポリ(乳酸-コ-グリコール酸)(PLGA)は、組織工学用途のための2Dまたは3D多孔質足場を製造するための広く研究されているポリエステルである12,13,14。さらに、複合材料は、金属、セラミック、ポリマーの2つ以上の相を統合して、幅広い生物医学的用途に高度な機能を提供します15,16,17。例えば、PLGAおよびリン酸カルシウム複合体は、頭蓋骨欠損の修復などの用途のための生分解性足場を作製するために使用することができる18。これらの生分解性足場とインプラントは、細胞や組織の成長を支え、促進し、時間の経過とともに体内で徐々に分解する可能性があります。

補足表1に示すように、異なる生分解性材料は、様々な分解機構、生成物、および速度を有し得る。例えば、マグネシウム合金、例えば、Mg-2重量%Zn-0.5重量%Ca(ZC21)1、Mg-4重量%Zn-1重量%Sr(ZSr41)19、およびMg-9重量%Al-1重量%亜鉛(AZ91)20は、水と反応して分解し、それらの分解生成物は、主にMg2+イオン、OH-イオン、H2ガス、および鉱物堆積物を含む。生分解性金属の分解速度は、その異なる組成、形状、および分解環境によって異なります。例えば、Cipriano et al.19は、ZSr41ワイヤー(Ø1.1 × 15mm)が85%の質量を失い、同じ形状の純粋なMgワイヤーがラットの脛骨に47日間移植された後、40%の質量を失ったと報告した。ハイドロキシアパタイト(HA)やリン酸β三カルシウム(β-TCP)などの生分解性セラミック材料は、溶液駆動の細胞外液体溶解を介して分解するか、小さな粒子に分解し、細胞外液体溶解および細胞媒介再吸収プロセスの両方を介して分解することができる。これらのリン酸カルシウム系セラミックスの分解生成物には、Ca2+イオン、(PO4)3-イオン、OH-イオン、およびミネラル堆積物が含まれ得る21。リン酸カルシウムセラミックスの分解速度は、その結晶構造によって大きく影響される。例えば、Van Blitterswijk et al.22は、40体積%のマイクロポアを有するHAは質量を失わず、40体積%のマイクロポアを有するβ-TCPはウサギの脛骨に3ヶ月間移植された後、30±4%の質量を失ったと報告した。PLGA14,23などのポリマーは、水の存在下でのエステル結合の加水分解により分解する場合があり、分解生成物には、主に乳酸およびグリコール酸が含まれる。PLGA 50/50 では 1 か月、PLGA 95/5 では完全な劣化に達するまでに数か月かかる場合があります24。

細胞応答および細胞適合性試験は、生物医学的用途のためにこれらの生分解性インプラント材料を評価およびスクリーニングするために重要である。しかし、ISO 10993-5:2009「医療機器の生物学的評価-第5部インビトロ細胞毒性試験」などの国際標準化機構(ISO)の現在の規格は、当初、Ti合金やCr-Co合金などの非分解性生体材料の細胞毒性をin vitro25で評価するために設計されました。具体的には、ISO 10993-5:2009は、抽出物のインビトロ細胞毒性試験、直接接触試験、および間接接触試験のみをカバーしています。抽出物試験において、抽出物は、標準時間および温度条件のいずれかで血清および生理食塩水と共に培養培地などの抽出流体にサンプルを浸漬することによって調製される。次いで、回収した抽出物または希釈液を細胞培養物に添加して、細胞毒性を研究する。直接接触試験の場合、試料と細胞との直接接触は、確立された(接着された)細胞層上に試験試料を配置することによって達成される。間接接触試験では、血清および融解寒天を含む培養培地をピペットで固定し、樹立細胞を覆う。次いで、試料を、フィルターの有無にかかわらず、固化した寒天層上に置く。

ISO規格は、 インビトロで生分解性材料を評価するために適用された場合、いくつかの制限を示しています。非分解性材料とは異なり、生分解性材料の分解挙動は動的であり、異なる時間または様々な環境条件(例えば、温度、湿度、培地組成、および細胞型)で変化し得る。抽出物試験は、材料の分解産物の細胞毒性を評価するのみであり、サンプル分解の動的プロセスを反映していない。ISO規格の直接接触試験と間接接触試験は、確立された細胞とサンプル間の相互作用を特徴付けるだけです。さらに、間接接触試験では、材料および細胞は、 in vivo 環境を反映しず、生分解性材料の動的分解を捕捉しない異なる微小環境にある。

この記事の目的は、現在のISO規格に記載されている方法の上記の制限に対処するために、さまざまな生分解性インプラント材料の細胞適合性試験方法を紹介し、議論することです。本稿で紹介する手法は、インプラント材料の動的分解挙動と 、生体内における細胞-材料相互作用のさまざまな状況を考慮する。具体的には、この記事では、医療用インプラント用途の生分解性ポリマー、セラミック、金属、およびそれらの複合材料を含む様々な生分解性材料の直接培養、直接暴露培養、および暴露培養の3つの細胞適合性試験方法を提供する。

直接培養法では、培地に懸濁した細胞をサンプルに直接播種し、新たに播種した細胞とインプラントとの相互作用を評価します。直接暴露培養では、サンプルを樹立された細胞層に直接配置して、インプラントと体内の樹立宿主細胞との相互作用を模倣します。暴露培養では、サンプルをそれぞれのウェルインサートに入れ、次いで樹立細胞と共に培養ウェルに導入し、インプラントと直接接触しない場合のインプラント分解によって誘発される局所環境の変化に対する樹立細胞の応答を特徴付ける。直接培養法および直接暴露培養法では、同じ培養ウェル内の移植材料と接触する細胞を直接的または間接的に評価する。曝露培養は、同じ培養ウェル内で所定の距離内でインプラント材料と間接的に接触する細胞を特徴付ける。

この記事では、さまざまな生分解性材料の細胞適合性試験と、モデル細胞、つまり骨髄由来間葉系幹細胞(BMSC)との相互作用について詳しく説明します。プロトコルには、細胞の採取、培養、播種、固定、染色、イメージング、および後培養材料および培地の分析が含まれ、これらはさまざまな生分解性インプラント材料および幅広い細胞タイプに適用されます。これらの方法は、 インビトロでの細胞応答および細胞適合性の点で、異なる生物医学的用途のための生分解性材料をスクリーニングするのに有用である。

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プロトコル

このプロトコルは、カリフォルニア大学リバーサイド校(UCR)の施設動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって、細胞および組織の採取のために承認されました。生後12週の雌のスプレイグ・ドーリー(SD)ラットがビデオの例として示されている。若い雌および雄ラットが好ましい。

細胞培養製剤

注: この記事で説明する 3 つの培養方法は、一般に、接着するさまざまな細胞タイプに適用できます。ここでは、ラット離乳子から採取したBMSCsを細胞培養調製の一例として紹介する。特定の医療用途に対するそれらの関連性に応じて、動物またはヒトドナーから採取された初代細胞および細胞/組織バンクからの細胞株を含む、異なる細胞タイプが利用され得る。

  1. ラット離乳中のBMSCの収穫
    注: 図 1 の模式図は、ラットの離乳期から BMSC を採取する手順を示しています。
    1. スプレイグドーリー(SD)ラットをCO2 吸入で安楽死させる。
    2. 皮膚および筋肉および結合組織を除去して、安楽死させたラットから大腿骨を解剖する。大腿骨を細胞培養培地を含む15mL円錐管(ポリプロピレン)に入れる。細胞抽出を行う時点まで円錐形のチューブを氷の上に置く。
      注:脛骨はBMSCの収穫にも使用できます。細胞培養培地は、10%ウシ胎児血清(FBS)と1%ペニシリン/ストレプトマイシン(P/S)を添加したダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)です。
    3. 骨を生物学的安全キャビネット内のペトリ皿に移す。手術用刃を用いて骨の端部を切断し、251/2G針付きシリンジを用いて骨髄腔を細胞培養培地で洗浄することにより、骨髄を50mL円錐管(ポリプロピレン)に流す。
      メモ: 18 G 針の入ったシリンジを骨髄の入った培地に挿入します。ゆっくりと穏やかに、目に見える細胞/組織の凝集物が存在しないまで、骨髄の大きな塊を分解するために培地を取り上げて分配する。
    4. 70 μmのフィルターを用いて細胞懸濁液をろ過し、続いて126 × g (1,000 rpm)で5分間遠心分離を行い、細胞ペレットを得た。
    5. 上清培地を吸引し、10mLの新鮮な培地で補充する。穏やかにピペットを上下させ、10mL血清学的ピペットを用いて細胞を再懸濁する。
    6. 懸濁液をT-75フラスコの内側の底に直接ピペットし、培地を加えて体積を25mLまで高めます。標準的な滅菌細胞培養環境(すなわち、37°C、5%CO2 および95%空気による加湿雰囲気)中のインキュベーター中で細胞を培養する。
    7. 3〜7日後、古い培地を吸引し、新鮮な培地で補充することによって、非接着細胞を洗い流す。細胞が継代、凍結、または実験での使用の準備が整うまで、細胞を培養し、新鮮な培地で供給し続けます。
  2. 細胞メンテナンス
    1. 細胞培養培地を定期的に交換して細胞の老廃物を除去し、細胞が90%〜100%コンフルエントになるまでほぼ1日おきに栄養素を補充する。90%コンフルエントで、継代、凍結、または実験において細胞を使用する。
    2. 継代細胞
      注: 継代培養とも呼ばれる継代は、細胞がある培養物から別の培養物に移されるときに適用される用語です。新たに回収された細胞は、継代段階0(P0)にある。本稿に記載されているトリプシン-エチレンジアミン四酢酸溶液(トリプシン-EDTA)および培地の量は、T-75フラスコ用である。
      1. 光学顕微鏡で細胞をチェックし、細胞が90%コンフルエントであることを確認します。
      2. 細胞フラスコから培地を吸引する。
      3. 血清学的ピペットを用いて10mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)をフラスコに分注する。フラスコを静かに揺らして細胞をPBSですすいでください。すべてのPBSを吸引します。
        注:このステップは、継代中に死んだ細胞や細胞廃棄物が転送されないようにするための余分なすすぎとして機能します。
      4. 3mLのトリプシン-EDTAを細胞フラスコに細胞の表面に直接分注する。フラスコを静かに揺らして、細胞のある表面全体がトリプシン-EDTAで覆われていることを確認します。
      5. トリプシン-EDTAを含む細胞フラスコをインキュベーター内に5分間入れて、細胞が剥離できるようにします。
      6. インキュベーター内で5分後、光学顕微鏡下で細胞をチェックし、細胞が剥離していることを確認する。一部の細胞が剥離していない場合は、細胞フラスコの側面を優しく叩いて、フラスコをもう一度確認します。
      7. 9mLの新鮮な培地を細胞フラスコに加え、トリプシン-EDTAを希釈する。これにより、トリプシン-EDTAが細胞を溶解する代わりに結合するためのよりアクセスしやすいタンパク質が提供されます。
      8. 培地およびトリプシン-EDTA中の細胞をピペットで取り出し、15mLの円錐形チューブに分注する。細胞を126 × g(1,000 rpm)で5分間遠心分離する。
      9. 細胞ペレットを乱すことなく、トリプシン-EDTAで培地を吸引する。
      10. 5~10 mLの新鮮な培地を遠沈管に加え、10 mLの血清学的ピペットを用いて細胞を培地中に穏やかに再懸濁する。
      11. 培地に懸濁した細胞を遠沈管からピペットで取り出し、体積を2~3個の新鮮培養フラスコに分割した。各フラスコの全培地量を25mLにするのに十分な培地を加える。
        注:継代培養中の分割比は、細胞型および特定の増殖特性によって異なる可能性がある。
      12. 光学顕微鏡で細胞を確認し、インキュベーターに戻します。
    3. 細胞の凍結
      1. 光学顕微鏡で細胞をチェックし、細胞が90%コンフルエントであることを確認します。
      2. 手順 1.2.2.2 から 1.2.2.9 を繰り返します。
      3. 100~1000 μLのマイクロピペットを備えた遠沈管に900 μLの新鮮な培地を加えます。同じマイクロピペットを用いて細胞を培地中にゆっくりと穏やかに再懸濁する。
      4. 900 μLの細胞懸濁液をクライオビアルに移す。100 μLのジメチルスルホキシド(DMSO)を加える。
      5. できるだけ早く、クライオビアルを温度低下を調節するように設計された円筒形のフォーム容器に入れます( 材料表を参照)。発泡容器を-80°Cの冷凍庫に入れる。
    4. 細胞の融解
      1. 凍結細胞を水浴中で解凍する。5 mL の新鮮な培地で満たされた滅菌 15 mL 円錐形チューブを取り、細胞を円錐形チューブに入れ、126 × g (1,000 rpm) で 5 分間遠心分離します。
      2. DMSOを含む培地を吸引する。
      3. 5〜10 mLの新鮮な培地を15 mLの細胞円錐管に加える。ゆっくりと静かにピペットを上下にピペットして細胞を再懸濁する。
      4. 培地に懸濁した細胞を15mL円錐管からピペットで取り出し、新しいT-75フラスコに分注した。細胞を分注するときは、掃引運動を使用して、細胞フラスコの底に細胞をできるだけ均等に分配する。
      5. 各T−75フラスコの総培地容量を25mLにするのに十分な新鮮な培地を加える。
      6. 光学顕微鏡で細胞を確認し、細胞フラスコをインキュベーターに戻します。

2. サンプル調製と滅菌

  1. サンプル調製
    1. この記事で説明する細胞培養実験には、6、12、24、48、または 96 ウェルプレートなどの組織培養処理プレートを使用します。組織培養プレートの種類と各ウェル内の培地の体積は、サンプル寸法などの異なる実験計画に基づいて選択します。
  2. 細胞培養の前に、すべての生分解性サンプルを滅菌または消毒します。
    注:消毒は in vitro 高熱、酸化剤、および/またはラジカルを含むいくつかの滅菌条件下でサンプルが化学的および/または表面変化を起こしやすい場合の研究。異なるサンプルタイプの滅菌または消毒方法は、ポリマー、金属、セラミックスなどの材料の異なる特性によって異なります。滅菌または消毒のプロセスには、熱、ガス、放射線、化学物質、高圧、またはこれらの組み合わせが含まれる場合があります。
    1. 生分解性金属
      1. 一般に、 in vitro 研究のために生分解性金属を消毒するために紫外線(UV)放射を使用する。
        注:例えば、Zhangらは、純粋なマグネシウム(Mg)およびZC21 Mg合金サンプルが、細胞研究に利用される前にUV照射下で4時間消毒されたと報告した1。 インビボ 研究の場合、サンプルは一般に滅菌する必要があります。マグネシウムやマグネシウム合金などの多くの生分解性金属では、これらのサンプルが水中で酸化または腐食する可能性があるため、蒸気を使用したオートクレーブは避けるべきです6。石英皿は、ほとんどのガラスやプラスチックよりも優れたUV透明性を提供するため、UV消毒に推奨されます。
      2. Mg合金サンプルを100〜200°Cの温度範囲のオーブンまたはオートクレーブ内の乾熱下で滅菌する。
        注:一部の金属合金は、空気中の高温で表面上で酸化される可能性があるため、場合によっては、高強度の放射線が代替として使用されることがあります。ただし、薄い金属箔を滅菌する際には、アルファ線やガンマ線などの高強度放射線は避けるべきです。それは材料内の原子置換を引き起こし、材料の微細構造を変化させる可能性がある。
      3. 熱や放射線に敏感な生分解性金属の代替方法としてエチレンオキシド(EtO)ガス滅菌を使用してください26。
    2. 生分解性セラミックス
      1. 一般に、 in vitro 研究の前にUV照射または70%エタノール溶液を用いて生分解性セラミックスを消毒する。
        注:例えば、Liuらは、リン酸カルシウムサンプルを70%エタノールに1時間浸漬し、両側でUV光に12時間曝露して消毒した後、 in vitro 細胞適合性試験で使用すると報告した27。
      2. オートクレーブを使用して、高温および水蒸気が堆肥および微細構造を損傷しない場合、生分解性セラミックスを滅菌する。
        メモ:一部のセラミックスはオートクレーブの影響を受ける可能性があります。例えば、イットリア安定化ジルコニアセラミックスを121°Cで15分間オートクレーブ処理すると、相変化や表面粗化が見られた。さらに、CPCは、サンプルが水と反応するため、蒸気によるオートクレーブ処理によって滅菌することはできません。
      3. 上記のイットリア安定化ジルコニアセラミックスおよびCPCサンプルには、コバルト-60放射線などの代替滅菌方法を使用してください28。
    3. 生分解性ポリマー
      1. 一般に、生分解性ポリマーを インビトロでの細胞研究に使用する前に、UV放射または70%エタノールを使用して消毒する。
        注:一部のポリマーは、UV照射下で化学変化を起こすことがあります。滅菌のために、コバルト−60放射線などのガンマ線処理が使用されてもよい。例えば、デンプン粉末は、 インビトロ 細胞研究に利用される前に、コバルト-60放射線下で滅菌された29。
      2. 高温・湿気に耐えうるオートクレーブポリマー材料。
        注:例えば、ポリプロピレンなどのポリマーは、オートクレーブ温度(すなわち、121〜134°C)に耐えることができるため、オートクレーブ処理することができる。ポリカプロラクトン(PCL)などの一部のポリマーは、融点が比較的低い(すなわち、約60°C)ため、オートクレーブ処理できません30。
      3. EtOガスを使用して、熱または放射線滅菌に敏感なポリマー材料を滅菌します。

3. 細胞培養方法

  1. 直接培養法
    注:図 2A の模式図は、直接培養法の工程を示す。本稿では、12穴組織培養処理プレートのウェル内に置かれたMg由来プレート上でBMSCsを培養し、その培養方法を例示する。
    1. ステップ 1.2.2.1 から 1.2.2.10 で説明されている手順に従って、細胞懸濁液を取得します。
    2. 90%コンフルエントフラスコを使用して、血球計数器を用いて細胞懸濁液中の細胞濃度を決定した。新鮮な培地を用いて細胞懸濁液を 、インビトロでの細胞研究に必要な所定の細胞濃度に希釈する。
      注:細胞の播種密度は実験計画によって決定される。例えば、2,000-40,000 cells/cm2 の細胞密度は、生分解性材料を用いたさまざまな細胞研究で使用されています。
    3. サンプル(Mgプレート)を12穴処理組織培養プレートの中央に配置する。逐次的に、培養プレートを2mLのPBSおよび2mLのDMEMでリンスし、滅菌条件下で浸透圧を較正した。希釈した細胞懸濁液3mLを目的のサンプル上の各ウェルに加える。
    4. 細胞をインキュベーター内で標準的な細胞培養条件下で24時間培養する。
      注:培養時間は、実験計画に応じて24時間より長くても短くてもよい。
  2. 直接暴露文化
    注:図 2B の模式図は、直接暴露培養のステップを示す。
    1. ステップ3.1.1および3.1.2で説明したように、異なる細胞タイプおよび意図された用途のための実験計画に基づいて、必要な濃度の細胞を有する細胞懸濁液を調製する。
    2. 培養プレートを2 mLのPBSおよび2 mLのDMEMで順次すすぎ、滅菌条件下で浸透圧を較正した。希釈した細胞懸濁液3 mLを各ウェルに加える。標準的な細胞培養条件下で加湿インキュベーター内で細胞を24時間、または細胞が50〜80%コンフルエントに達するまで培養する。
      注: 細胞合流レベルは、細胞タイプおよび実験計画によって異なる場合があります。
    3. 24時間後、ウェルプレート内の細胞をピペットを用いてPBSでリンスし、浮遊死細胞を除去した。
    4. 消毒または滅菌したサンプルを接着細胞に直接置きます。3 mL の新鮮な培地を各ウェルに加えます。
    5. 細胞を標準的な細胞培養条件下でさらに24時間培養する。
      注:培養時間は、実験計画に応じて24時間より長くても短くてもよい。
  3. エクスポージャー文化
    注: 図2C の模式図は、暴露培養法の工程を示す。
    1. 細胞調製のための最初のステップは、曝露培養と同じである。ステップ3.1.1および3.1.2で説明されるように、所望の細胞と共に細胞懸濁液を調製する。ステップ3.2.1および3.2.2と同様に、ウェルプレート内の細胞を所望の密度で播種し、標準的な細胞培養条件下でインキュベーター内で24時間培養する。
    2. 24時間後、付着細胞をPBSでリンスして浮遊死細胞を除去し、続いて3mLの新鮮な培地を各ウェルに添加した。
    3. その後、膜孔径が0.4μmのウェルインサートにサンプルを入れ、サンプルを含むウェルインサートを細胞のある各ウェルに入れます。
    4. 細胞を標準的な細胞培養条件下でさらに24時間培養する。
      注:培養時間は、実験計画に応じて24時間より長くても短くてもよい。

4. 細胞の培養後特性評価

注:直接培養および直接暴露培養の場合、ウェルプレートおよびサンプルの両方に付着した細胞を固定、染色、画像化、および分析します。暴露培養のために、ウェルプレートに接着した細胞を分析する。

  1. 細胞固定
    1. 各ウェルから後培養培地を対応する15mL円錐管に集め、さらなる分析を行う。さらなる分析のために培養後のすべてのサンプルを収集します。
    2. サンプルおよびウェルプレートの両方に付着した細胞をPBSを用いて3回すすぎます。
    3. 1mLの4%パラホルムアルデヒド(PFA、10%中性緩衝ホルマリン)を各ウェルプレートに加える。蓋をウェルプレートに戻し、PFAを20分間反応させます。
    4. 20分後、PFAを吸引し、廃棄物ボトルに分配する。PBSを用いてウェルプレートを3回すすぎ、PFAを除去し、廃液を廃液瓶に移した。
  2. 細胞染色
    1. 製造元の指示に従って染色剤の作業ストックを準備します。
      注:例えば、Alexa Fluor 488ファロイジンはF-アクチンを染色するために使用され、4'、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)は細胞核を染色するために使用される。サンプルが染色溶液中で急速に分解する場合、染色時間は短縮され得る。
    2. 希釈したAlexa Fluor 488ファロイジン染色剤200〜400 μLを各ウェルに加え、ウェルプレート上の細胞およびサンプルを覆う。光暴露を防ぐためにウェルプレートをアルミホイルで包み、Alexa Fluor 488ファロイジンが室温で20分間反応するのを許します。
    3. Alexa Fluor 488 ファロイジン染色剤を集め、対応する廃棄物ボトルに分配します。PBSを使用してウェルプレートを3回すすぎ、余分なAlexa Fluor 488ファロイジンを除去し、使用済みPBSを対応する廃液ボトルに分注する。
    4. 希釈したDAPIを各ウェルに200~400 μL加えて、ウェル内およびサンプル上の細胞を覆います。ウェルプレートをアルミ箔で包み、DAPIを室温で5分間反応させます。
    5. DAPIを収集し、対応する廃棄物ボトルに分配します。PBSを使用してウェルプレートを3回すすぎ、DAPIを除去し、使用済みPBSを対応する廃液ボトルに分注する。
  3. 細胞イメージング
    1. 染色後、蛍光顕微鏡を用いて細胞を画像化する。可能な限り、蛍光画像に加えて細胞の位相差画像を撮影してください。生分解性サンプル上の細胞をできるだけ早く、または染色直後に画像化して、サンプルの連続的な分解によって引き起こされる可能性のある変化を回避または低減する。固定後2-8°Cの緩衝液中でウェルプレートに細胞を保存し、蛍光シグナルの損失を避けるために染色後できるだけ早く細胞を画像化した。
    2. 直接培養および直接暴露培養の場合、 図3Aに示すように、(1)サンプル上の細胞(サンプルと直接接触している)および(2)サンプルを囲むウェルプレート上の接着細胞(サンプルとの間接接触)の2種類の細胞を画像化して評価する。
    3. 曝露培養の場合、 図3Bに示すように、細胞の蛍光画像を撮影する際に画像ガイドを使用して、サンプルの動的分解勾配に応答して細胞応答が異なるかどうかを判断します。内輪内(中心から3.5mm)と外輪内(中心から7mm)にある細胞を別々に画像化して解析します。
      メモ: 画像ガイドは、細胞とサンプルの間の距離を定義するために使用されます。
    4. 培養プレート内の各サンプルおよびウェルについて、細胞が予め定義された距離でサンプルと直接接触または間接的に接触している各関心領域から少なくとも5つの画像をランダムに撮影する。
  4. 画像解析
    1. ステップ4.3で得られた全ての細胞画像について、画像解析用のImageJ等のソフトウェアを用いて細胞拡散面積及びアスペクト比を測定して細胞形態を定量化する。
    2. 各画像領域のセル数を数えます。直接・間接接触条件下での細胞接着密度を単位面積当たりの細胞数として算出する。

5. 培地およびサンプルの培養後分析

  1. 後培養液のpHを測定する。
    注: 一部のサンプルは、分解中に培地の pH 値を変化させます。例えば、マグネシウム合金などの生分解性金属は、通常、その分解のために培地のpH値を上昇させる31。対照的に、PLGAなどの生分解性ポリマーは、分解すると培地のpH値が低下することがよくあります32。後培養培地のpH値を測定することは、 インビトロでこれらのサンプルの分解を示すことができる。
    1. 細胞固定前に、ステップ4.1.1のように後培養培地を採取する。
    2. 収集直後の各ウェルにおける後培養液のpH値を測定し、予め較正したpHメーターを用いた。
      注:媒体のpHは、CO2 レベルや温度などの環境条件のために時間の経過とともにドリフトする可能性があり、これは考慮する必要があります。
  2. 生分解性サンプルの分解挙動について培地組成物を分析する。培地の色変化を引き起こすいくつかのサンプルについて、分光光度計またはマイクロプレートリーダーを使用して培養後培地の光学濃度(O.D.)値を測定し、分解挙動を決定する。あるいは、紫外可視分光法(UV-VIS)およびフーリエ変換赤外分光法減衰全反射率(FTIR-ATR)を使用して、後培養培地中の分解生成物を分析します。
    注:培養後培地中の分解産物を測定することは、サンプルの分解挙動を理解する上で有益です。最も一般的なアプローチの1つは、誘導結合プラズマ発光分析装置(ICP−OES)を用いて培養後培地中の目的のイオンを測定することである。ICP-OESは、金属およびセラミックスの後培養培地の組成を測定するために使用することができるが、ポリマーには適さない可能性がある。ポリマーは通常、炭素、水素、酸素からなり、これらの元素の正確な定量はICP-OESでは困難です。
    1. pH測定のためのステップ5.1.2に続いて、イオン濃度の最適な測定のために望ましい希釈係数を使用して培地を収集して希釈する。
    2. ICP-OESを用いて後培養培地中の目的のイオンの濃度を測定する。
  3. サンプルの後培養分析
    注: インビトロ 細胞研究の後、生分解性サンプルは寸法、質量、表面形態、微細構造、および組成が変化する可能性があります。サンプルの培養後分析は、サンプルの分解メカニズムを理解するのに役立ちます。
    1. 細胞培養後、サンプルの写真を撮って、サンプルの寸法、色、形態、およびその他の目に見える特性の可能な変化を示します。
    2. 培養後サンプルを乾燥または脱水し、サンプルの質量、寸法、および体積を測定して、質量、寸法、および体積の変化を定量化します。
    3. 走査型電子顕微鏡(SEM)を使用して、サンプルの微細構造と形態を特徴付けます。エネルギー分散型X線分光法(EDX)およびX線回折(XRD)を使用して、サンプル上の分解生成物の組成と相を特徴付けます。FTIR-ATRを使用して、サンプル表面の化学結合を検出します。

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結果

図4は、異なる培養方法を用いた直接的および間接的な接触条件下でのBMSCsの代表的な蛍光画像を示す。図4A、Bは、ZC21マグネシウム合金1との同じ24時間直接培養後の直接および間接接触条件下でのBMSCsを示す。ZC21合金は、97.5重量%のマグネシウム、2重量%の亜鉛、および0.5重量%のカルシウムからなる。ZC21合金サンプルと直接接触しないセルは、サンプルと直接接触するセルよりも広がりがよくなります。図4C、Dに示すように、直接および間接接触条件下での細胞はすべて、Fe3+イオンによって架橋されたヒアルロン酸(HyA)ヒドロゲルによる24時間直接暴露後に正常な形態を示す。しかし、間接接触条件下の細胞数は、直接接触条件下の細胞数よりも少ない33。別の研究では、24時間の...

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ディスカッション

異なる細胞培養法を用いて、インビボでの適用の様々な態様について、目的とする生体材料のインビトロ細胞適合性を評価することができる。この記事では、生分解性インプラント材料が人体内で使用されるさまざまなin vivoシナリオを模倣するために、3つのインビトロ培養方法、すなわち、直接培養、直接暴露培養、および暴露培養を実証する。直接培養法は、主に、移植材料に直接付着し、周囲に新たに播種された細胞の挙動を評価するために使用される。直接暴露培養法は、インプラント材料が確立された細胞および組織と直接接触するin vivoシナリオを模倣する。曝露培養法は、インプラント材料からの分解生成物および局所微小環境の変化が、インプラント材料と直接接触していない確立された細胞および組織にどのように影響するかを示すために使用することができる。

直接培養では、直接および間接接触条件下で新たに播種された細胞が評価される。直接暴露培養において、樹立された細胞は、直接および間接接触条件の両方で評価することができる。曝露培養では、間...

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開示事項

著者には利益相反はありません。

謝辞

著者らは、米国国立科学財団(NSF CBET賞1512764およびNSF PIRE 1545852)、国立衛生研究所(NIH NIDCR 1R03DE028631)、カリフォルニア大学(UC)リージェンツ教員開発フェローシップ、および研究種子助成金委員会(Huinan Liu)、およびUC-Riverside Dissertation Research Grant(Jiajia Lin)からの財政的支援に感謝している。著者らは、UC-RiversideのAdvanced Microscopy and Microanalysis(CFAMM)がSEM/EDSを使用し、Perry Cheung博士がXRD装置を使用したことを高く評価している。著者らはまた、部分的な編集のためにThanh Vy NguyenとQueenie Xuを高く評価している。著者はまた、ビデオのナレーションを録音してくれたシンディ・リーに感謝したいと思います。この記事で表明された意見、所見、結論、または推奨事項は著者のものであり、必ずしも国立科学財団または国立衛生研究所の見解を反映するものではありません。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
10 mL 血清学的ピペットVWR490019-704
12 ウェル組織培養処理プレートサーモフィッシャーサイエンティフィック353043
15 mL コニカルチューブ (ポリプロピレン)VWR89039-666
18 G ニードルBD305196
25½G ニードルBD305122
4′,6-ジアミジノ-2- フェニルインドール二乳酸 (DAPI)InvitrogenD3571
50 mL コニカルチューブ (ポリプロピレン)VWR89039-658
70 μm ナイロンストレーナーフィッシャーサイエンティフィック50-105-0135
アレクサ 小麦粉 488-ファロイジンライフテクノロジーズ A12379
生物学的安全キャビネットLABCONCOクラスII、タイプA2
遠心分離エッペンドルフローター F-35-6-30、遠心分離機5430
クリアフューズドクォーツラウンドディッシュAdValue TechnologyFQ-4085
CO2インキュベーターSANYOMCO-19AIC
CoolCell 冷凍庫容器温度低下を調節するように設計された
CryovialThermo Fisher Scientific5000-1020
ジメチルスルホキシド(DMSO)Sigma-Aldrich472301
Dulbecco'修正されたイーグル」Sigma-AldrichD5648
EDX分析ソフトウェアOxford InstrumentsAztecSynergy
エネルギー分散型X線分光法(EDX)FEI50mm2 X-Max50 SDD
ウシ胎児血清(FBS)サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社
蛍光顕微鏡NikonEclipse Ti
FormaldehydeVWR100496-496
血球計算盤Hausser Scientific3520
ImageJ softwareNational Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation (LOCI, University of Wisconsin)
誘導結合プラズマ
発光分析 (ICP-OES)		PerkinElmerOptima 8000
光学顕微鏡VWRVistaVision
ペニシリン/ストレプトマイシン (P/S)サーモフィッシャーサイエンティフィック、15070063
pHメーターVWRモデル SB70P
リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)VWR97062-730
走査型電子顕微鏡(SEM)FEINova NanoSEM 450
用ブレードVWR76353-728
培養フラスコVWRT-75、MSPP-90076
ズウェルインサートコーニング3460
トリプシン-エチレンジアミン四酢酸溶液(トリプシン-EDTA)シグマ-アルドリッチT4049
X線回折装置(XRD)PANalyticalEmpyrean Series 2
機 SH30910外科組織トラン

参考文献

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