方法論記事

繊毛拍動頻度の定量化のための初代ヒト鼻上皮細胞モデルの収集、拡大、および分化

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DOI：

10.3791/63090

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2021年11月10日

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1School of Women's and Children's Health, Faculty of Medicine and Health, University of New South Wales, 2Molecular and Integrative Cystic Fibrosis Research Centre (miCF RC), Faculty of Medicine and Health, University of New South Wales, 3Department of Respiratory Medicine, Sydney Children's Hospital, 4Department of Pathology, School of Medical Sciences, University of New South Wales Australia, 5Katharina Gaus Light Microscopy Facility, Mark Wainwright Analytical Centre, University of New South Wales

この記事について

サマリー

このプロトコルでは、鼻上皮細胞の収集、拡張、器官型気道上皮細胞モデルへの分化、および生細胞イメージングとカスタムビルドスクリプトによる繊毛拍動頻度の定量化について説明します。

要約

繊毛機能(拍動頻度、パターン)の測定は、原発性毛様体ジスキネジアなどの呼吸器疾患の診断ツールとして確立されています。しかしながら、これらの技術のより広い適用は、温度、湿度、およびpHなどの環境要因の変化に対する繊毛機能の極端な感受性によって制限される。 嚢胞性線維症(CF)患者の気道では、粘液の蓄積が繊毛の拍動を妨げます。繊毛機能は、CF膜貫通コンダクタンスレギュレーター(CFTR)チャネル活性の指標として、一次気道細胞モデルで調査されています。しかし、繊毛拍動頻度のかなりの患者間変動は、同じ CFTR 変異を有する患者であっても、CFTR調節薬に応答して見出されている。さらに、機能不全のCFTR調節された塩化物分泌が毛様体機能に与える影響はよくわかっていません。現在、 in vitro 気道モデルのサンプル調製、画像取得、および繊毛拍動周波数(CBF)の分析を実証する包括的なプロトコルはありません。標準化された培養条件と環境制御された条件下で実行される画像取得により、個人間およびCFTR調節薬に応答したCBFの一貫した再現性のある定量が可能になります。このプロトコルは、3つの異なる気道上皮細胞モデルシステムにおけるCBFの定量について説明しています:1)ネイティブ上皮シート、2)透過性サポートインサート上に画像化された気液界面モデル、および3)細胞外マトリックス埋め込み3次元オルガノイド。後者の2つは、繊毛の拍動と粘液の産生を伴う in vivo 肺生理学を再現します。毛様体は、環境制御されたチャンバー内で高速ビデオカメラを使用してキャプチャされます。カスタムビルドのスクリプトは、CBFの分析に使用されます。CBF測定値の臨床への翻訳は、患者ごとにCFTR調節薬に対する反応を予測するための重要な臨床ツールであることが想定されています。

概要

繊毛拍動頻度(CBF)とパターンの測定は、原発性毛様体ジスキネジア(PCD)1などの呼吸器疾患の診断ツールとして確立されています。嚢胞性線維症(CF)では、CF膜貫通コンダクタンスレギュレーター(CFTR)塩化物チャネルの機能不全により、気道表面液の脱水と粘液繊毛クリアランスの障害を引き起こします2。繊毛機能は、CFTRチャネル活性の指標として一次気道細胞モデルで in vitro で調査されています3。しかし、CFTR調節薬に応答するCBFには、同じ CFTR 変異を有する患者であっても、かなりの患者間変動が存在する3。さらに、機能不全のCFTR調節された塩化物分泌が毛様体機能に与える影響はよくわかっていません。現在、 in vitro 気道モデルのサンプル調製、画像取得、およびCBFの分析を実証する包括的なプロトコルはありません。

鼻粘膜ブラッシングから分離された鼻上皮シートは、PCD診断の毛様体機能の測定に直接使用されます4。しかし、得られる鼻上皮シートのサイズや品質を制御することはできませんが、CBFは、単一細胞または細胞シート、および破壊された、または破壊されていない上皮シート繊毛縁で測定されるかどうかによって異なります5。そのため、鼻粘膜ブラッシングの収集中の細胞の損傷によって引き起こされる二次性ジスキネジアは、CBFに影響を与える可能性があります。鼻上皮細胞の初代細胞培養と、気液界面(ALI)または三次元基底膜マトリックスでの繊毛気道上皮オルガノイドへの分化は、二次ジスキネジアのない繊毛を生じさせます4,6,7,8。ALIで分化した気道上皮細胞(以下、ALIモデルと呼ぶ)は、毛様体拍動パターンとex vivo鼻粘膜ブラッシングの頻度を再現し、患者固有の欠陥を保持しながら毛様体微細構造、拍動パターン、および拍動頻度の分析を可能にする重要な二次診断補助と見なされています9。.しかし、これらの偽層状の粘液繊毛分化細胞モデルを作成するために使用される方法論には矛盾が存在します。異なる培養拡大または分化プロトコルは、明確な上皮表現型(繊毛または分泌)を誘導し10、CBF11に有意差をもたらす可能性があります。CBFは、鼻上皮ブラッシング4、6、12、13、14、15、16、気道上皮オルガノイド14、17、18およびALIモデル3、4、6、13、19、20において定量化されており、21.しかし、これらのプロトコルの中には大きなばらつきがあり、多くの場合、多くのパラメータが制御されていません。例えば、いくつかの研究では、ALIモデルの細胞が透過性支持体インサート3,19,20,21上に留まっている間にCBFがその場で画像化されるが、さらに他の研究は透過性支持体インサートから細胞を掻き取り、それらを培地4,6,13に懸濁して画像化する。

さらに、毛様体機能を測定する技術のより広い適用は、環境要因の変化に対する毛様体機能の極端な感受性によって制限されています。温度22、湿度23,24、pH25,26などの環境要因は毛様体機能に影響を与えるため、CBFを正確に定量化するには調整する必要があります。さまざまな実験室で使用されるさまざまな生理学的パラメーターと、それらがCBFにどのように影響するかは、以前にレビューされています27。

CBF測定に対する様々なイメージング技術およびアプローチが文献に報告されている。PCD診断では、ビデオ顕微鏡を使用して毛様体機能を測定します28,29。最近、示差動的顕微鏡に基づくビデオ分析アルゴリズムを使用して、気道上皮細胞ALIモデルにおけるCBFと繊毛の両方の協調を定量化しました3,30。この方法は、気道上皮細胞における毛様体拍動の特性評価を、領域をセグメント化または選択することなく、迅速かつ完全に自動化された方法で可能にする。CBFのイメージングおよび定量のための様々な方法は、文献中のCBFで報告されている違いに追加される可能性があります(補足ファイル1)。

既存のメソッドを合理化するための培養から定量、培養条件の標準化、および厳密な環境制御条件下で実行される画像取得までのプロトコルにより、個人内および個人間でのCBFの一貫した再現性のある定量が可能になります。

このプロトコルは、鼻起源の3つの異なる気道上皮細胞モデルシステムにおける上皮細胞の収集、増殖および分化培養条件、およびCBFの定量の完全な説明を提供します:1)ネイティブ上皮シート、2)透過性サポートインサートで画像化されたALIモデル、および3)細胞外マトリックス(ECM)埋め込み3次元オルガノイド(図1).鼻の下鼻甲介ブラッシングから得られた鼻上皮細胞は、気管支ブラッシングの収集に関連する侵襲的手順を克服しながら気管支上皮細胞31の有効な代理であるため、気道上皮の代表として使用される。条件付きリプログラミング細胞(CRC)法は、ALIモデルおよび3次元オルガノイドの作成のために初代気道上皮細胞を拡張するために使用されます。幹細胞様状態への気道上皮細胞の条件付きリプログラミングは、増殖停止線維芽細胞フィーダー細胞系およびRho関連キナーゼ(ROCK)阻害剤32との共培養によって誘導される。重要なことに、CRC法は、組織特異的な分化能を保持しながら、気道上皮細胞の集団倍増を増加させる33,34。すべての気道上皮細胞モデルにおいて、毛様体は、標準化された画像取得設定を備えた高速ビデオカメラを使用して、温度制御されたチャンバーでキャプチャされます。CBFの定量化には、カスタムビルドのスクリプトが使用されます。

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図1:ワークフローの概略図。 参加者の鼻の下鼻甲介をブラッシングした後、気道上皮細胞は2つの方法のいずれかで利用されます。気道上皮シートを単離し、繊毛拍動頻度を直ちに画像化するか、または気道上皮細胞を条件付きリプログラミング細胞法で拡張します。CRC拡張気道上皮細胞は、気液界面または気道上皮オルガノイド培養で気道上皮細胞を確立するために分化されます。毛様体拍動周波数のイメージングは、加熱および湿度環境チャンバーと高速フレームレート(>100Hz)の科学用カメラを備えた生細胞イメージング顕微鏡を使用して取得されます。データ分析は、カスタムビルドのスクリプトを使用して実行されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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プロトコル

研究の承認は、シドニー小児病院ネットワーク倫理審査委員会(HREC/16/SCHN/120)から受けました。生物試料の収集前に、すべての参加者(または参加者の保護者)から書面による同意を得ました。

1. 気道上皮細胞モデル構築のための準備

  1. 80%ダルベッコ改変イーグル培地と20%ウシ胎児血清を組み合わせて、鼻細胞採取培地を準備します。1 μL/mLのペニシリン/ストレプトマイシンを補給します。4°Cで最大3ヶ月間保管してください。
  2. フラスコまたは透過性サポートインサートを、手順1.2.1〜1.2.4に従って、必要に応じてコラーゲン溶液でコーティングします。コラーゲンコーティングされた容器を長期間保管しないでください。
    1. I型コラーゲン溶液(3 mg/mLストック)をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で1:100に希釈し、最終濃度を0.03 mg/mLにします。よく混ぜる。
    2. 細胞培養フラスコ(セクション4)を160 μL/cm 2(T25フラスコあたり4 mL)および透過性サポートインサート(セクション5)で455 μL/cm2(すなわち、6.5 mmインサートあたり150 μL)でコーティングします。
    3. 37°Cで2〜24時間インキュベートします。
    4. 細胞を播種する前に、ピペットまたは真空アスピレーターでコラーゲン溶液を除去します。細胞を播種する前に容器を洗浄しないでください。
  3. 表1に列挙した成分32を組み合わせて条件付き再プログラミングセル(CRC)培地を調製する。フィルターは、ボトルトップ真空フィルターシステムを使用して滅菌します。4°Cで最大2ヶ月間保管してください。
  4. 使用当日に、 表1に示すようにヒト上皮成長因子、ROCK阻害剤および抗生物質を添加する。
コンポーネント容積
DMEM, 高グルコース156.7 ミリリットル
DMEM/F-12, HEPES313.3 ミリリットル
ヒドロコルチゾン55.6 μL
インスリン1.25ミリリットル
コレラ毒素21 μL
アデニン1.2ミリリットル
ハイFBS25ミリリットル
ペニシリン-ストレプトマイシン5ミリリットル
ヒト上皮成長因子1 μL/mL
ロック阻害剤1 μL/mL
菌類ゾーン2 μl/ml
トブラマイシン2 μL/mL
セフタジジム水和物4 μL/mL
ゲンタマイシン溶液1 μL/mL

表1:500 mLの条件付きリプログラミング細胞培地の成分

2.鼻の下鼻甲介ブラッシングの収集

注:プロトコルのこのセクションでは、鼻細胞収集培地、細胞診ブラシ、組織、および適切な個人用保護具を備えた収集チューブ(50 mL)が必要です。上気道感染症中のブラッシングは避けてください。出血の危険性はわずかですが、炎症がある場合は増加します。ブラッシングの目的が ex vivoCBF 測定用の気道上皮シートを得ることである場合、ブラッシングは上気道感染の最低6週間後に行われるべきです。理想的には、感染後10週間以上35。

  1. 鼻細胞採取培地(セクション1)を準備し、チューブを氷の上に置きます。
  2. 参加者に手順を不快であると説明してください。ブラッシング中に鼻孔に完全な感覚が感じられることを説明します, 海/プールに飛び込んで水が鼻腔に突入するのと同じように.この手順が反射として涙の生成を誘発することを参加者に助言する。
  3. どのポジショニングが参加者に適しているかを評価します。仰臥位は、処置中に参加者の頭がブラシから離れるのを防ぐため、検査ソファが利用可能な場合は、参加者を仰臥位に置きます。または、参加者を壁の隣に座らせ、壁に頭を押し戻すことができます。
  4. 鼻腔を点検します。鼻中隔偏位、ポリープ、および鼻腔内のブラシの通過に影響を及ぼし、出血のリスクを高める可能性のあるその他の解剖学的異常に注意してください。
  5. 参加者に鼻をティッシュに吹き込むように依頼して、余分な粘液の鼻をきれいにします。
  6. 参加者に口から呼吸するように依頼します。利き手に細胞診ブラシを取ります。参加者のあごに5桁目を置き、手を固定しながら、細胞診ブラシを参加者の鼻腔に挿入します(図2)。ブラシを参加者の顔に~45°挿入して、鼻道を通過させます。
  7. 参加者の顔に垂直になるようにブラシを直立させます。ブラシを下鼻甲介の下の鼻の側壁に対して、下鼻甲介の中央部から後部になるまで、ゆっくりとしっかりと進めます。
    注意: 過剰挿入は避けてください。抵抗の突然の低下が感じられた場合は、鼻咽頭が入り、手続き主義者が再び抵抗を感じるまでブラシを引っ込める必要があります。
  8. ブラシを360°まで3回回転させます。挿入操作の逆でブラシをそっと取り外して、細胞がブラシから外れないようにします。
  9. 鼻細胞採取培地で準備した採取チューブにブラシを置きます。収集チューブを氷の上に置きます。
  10. 参加者が同意できる場合/多数の細胞が必要な場合は、2番目の鼻孔でブラッシングを繰り返します(例:.、細胞培養を開始するため)。
    注:ブラシに目に見える血球がない場合は、同じ鼻孔を再度ブラッシングできますが、同じ鼻孔で2回目のブラッシングを行うと出血のリスクがわずかに増加することに注意してください。

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図2:鼻上皮細胞の収集。 下鼻甲介の中央部から後部の細胞診ブラシの位置の図。この位置に到達するには、ブラシを鼻腔に挿入し、ブラシを顔に対して90°の角度に回転させ、下鼻甲介の下の鼻腔に沿ってブラシをガイドします。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

3.気道上皮シートの調製

注:プロトコルのこのセクションでは、収集チューブ(細胞診ブラシ+ 1 mLの鼻細胞収集培地)(セクション2)と96ウェル平底プレートが必要です。気道上皮シートを画像化する目的で鼻甲介ブラッシングを収集する場合は、抗生物質を含まない鼻細胞収集培地を1 mLのみ使用してください。そうしないと、上皮シートが分散しすぎてイメージングできなくなります。

  1. 細胞診ブラシを含む収集チューブをそっと回転させて、気道上皮シートをブラシから外します。
  2. P1000ピペットですべての培地と細胞を採取します。5〜6滴を96ウェル平底プレートのウェルに分注します。約7ウェル繰り返します。
  3. ステップ7.1.4に従ってプレートを顕微鏡に移し、セクション7の残りの部分に従って繊毛拍動周波数を画像化します。
  4. 画像は上皮シート(図1)と単一の非付着細胞ではないが、上皮シートと単一の非付着細胞との間で繊毛機能が異なることが実証されていることから5。

4.気道上皮細胞の拡張と維持

  1. 気道上皮条件付きリプログラミング細胞増殖培養
    注:コラーゲン溶液コーティング容器(セクション1)、照射マウス胚フィーダー細胞(NIH-3T3)、条件付きリプログラミング細胞(CRC)培地(セクション1)、鼻細胞収集培地中の細胞診ブラシ(セクション2)。
    1. プレートは、気道上皮細胞との共培養の少なくとも2時間前および72時間以内に、調製されたコラーゲン溶液コーティングされた培養容器に8,000細胞/cm2 の播種密度でフィーダー細胞を照射した(フィーダー細胞の培養および照射については36 を参照)。
    2. 採取チューブ(細胞診ブラシ+鼻細胞採取培地)内のブラシをかけた細胞を氷上の渦に移します。低速では、ボルテックスチューブを10秒オン、10秒オフ(間に氷の上に保つ)して、ブラシから細胞を取り除きます。激しいボルテックスは細胞の生存率を低下させる可能性があります。ブラシを調べて、粘液がまだ付着しているかどうかを確認します。その場合は、ボルテックスを繰り返します。
    3. 氷上のチューブをバイオセーフティキャビネットに戻します。血清学的ピペットを使用して、細胞診ブラシを残して、培地を収集チューブから新しいチューブ(チューブB)に移します。遠心分離管Bを300 × g で4°Cで7分間。
    4. チューブBを遠心分離機から取り出し、上清を廃棄する。粘液が見える場合は、ペレットをさらに5 mLの鼻細胞収集培地で洗浄し、再度遠心分離します。
    5. 1 mLのCRC培地を加えて、細胞ペレットをチューブBに再懸濁します。 5 mLの血清学的ピペットを使用して、50 mLチューブ(チューブC)の上に置かれた細胞ふるいに細胞を円を描くように通します。
    6. 複数回繰り返して、単一の細胞懸濁液を形成します。ふるいの底から残留培地を集め、培地に組み込みます。セルふるいを捨てます。
    7. 5 mLの血清学的ピペットを使用して、チューブCから1 mLの培地を取り出し、それをマイクロ遠心チューブに移します。
    8. この細胞懸濁液を10 μL取り、10 μLのトリパンブルーを事前に分注したマイクロ遠心チューブに追加します。よく混合し、すぐに自動セルカウンターを使用して細胞数と生存率を記録します。
    9. 照射されたフィーダー細胞を予め播種したT25フラスコに気道上皮細胞を播種する。
  2. 気道上皮細胞の維持と解離
    注意: CRC培地は、細胞に加える前に、温度制御された実験室の水浴またはビーズ浴装置に入れて37°Cに温める必要があります。
    1. 細胞培養顕微鏡(4×対物レンズ)で細胞に付着、汚染、形態、および合流がないか定期的にチェックします。
    2. CRCメディアは2日おきに交換してください。再プログラムされた細胞が観察され(図1)、汚染が存在しない場合は、抗生物質を減らすか回収します。
    3. 細胞が90%コンフルエントに達したら、ダブルトリプシン法32 を使用して細胞を解離し、ステップ4.1.8に記載されているように細胞カウントを実行します(細胞の解離および凍結については 補足ファイル2 を参照されたい)。

5. 気道上皮細胞の播種・分化と分化型ALIモデルの維持

  1. 気道上皮細胞を透過性支持体インサートに播種
    1. コラーゲン溶液でコーティングされた透過性サポートインサート(セクション1)をCO2 インキュベーターからバイオセーフティキャビネットに移します。コラーゲン溶液を吸引して廃棄します。750 μLの膨張培地(抗生物質フリー)を透過性サポートインサートの基底コンパートメントに追加します。
    2. 解離した細胞または氷上で解凍した細胞をバイオセーフティキャビネットに移します。150 μLで200,000〜250,000個の細胞を播種するために必要な量の膨張培地を、各透過性サポートインサートの頂端コンパートメントに追加します。
    3. 泡を作らないように注意してください。よく混ぜて、細胞が均質で懸濁状態であることを確認します。150 μLの細胞懸濁液を各透過性支持体インサートの先端側に加えます。
    4. 均一な細胞懸濁液を維持するために、3つの透過性支持体インサートごとに播種した後に細胞を再懸濁する。
    5. コンフルエントな細胞単層が形成されるまで(通常は播種後4日目までに)2日ごとに、培地を廃棄し、室温(RT、15〜25°C)に温めた新しい増殖培地を追加します。
  2. 気液界面における気道上皮細胞の分化
    1. ALI培地(抗生物質フリー)をRT(15〜25°C)に温めます。
    2. 拡張培地を取り出し、頂端コンパートメントと基底コンパートメントの両方で分化培地(ALI)に変更します。
    3. 水中ALI培地で2日間培養した後、培地を吸引して廃棄する。
    4. 750 μLのALI培地を基底コンパートメントに追加して、気液界面を作成します。
      注:1週間の培養後、単層がコンフルエントではなく、穴がまだ観察される場合、細胞はもはや空隙領域に拡大する能力を持たない可能性があり、気道上皮細胞を廃棄することを検討してください。
  3. 分化ALIモデルの維持と粘液除去
    1. 完全に分化するまで、頂端および基底培地を2日ごとに交換します(気液界面確立後21〜25日目)。
    2. 週に一度、手順5.3.3〜5.3.4に従って、頂端側から粘液を洗います。
    3. PBSをRT(15〜25°C)に温めます。
    4. 200 μLのPBSを頂端コンパートメントに追加します。CO2 インキュベーターで10分間インキュベートします。吸引装置またはピペットを使用してPBSを取り外します。

6. 三次元気道上皮オルガノイド

  1. 気道上皮オルガノイド培養のための準備
    1. 24ウェルプレートをCO2 インキュベーターに入れ、一晩37°Cに温めます。
    2. 製造元の指示に従って、ECM(材料表)の10mLバイアルを氷上で解凍します。凍結融解サイクルの数を最小限に抑えるために、500 μLのアリコート(1回限りの使用)を準備します。
      注:最良の培養結果を得るには、タンパク質濃度>10.5 mg/mLのECMを使用することをお勧めします。濃度が低いと、ECMドームの崩壊が加速し、頂端に面した外側のオルガノイドの発生が増加します。
    3. 気道オルガノイドキット(材料表)を使用して、製造元の指示に従って気道オルガノイド播種培地(AOSM)および分化培地(AODM)を準備します。
    4. 表2に従って気道オルガノイド基底培地を調製する。
コンポーネント容積
アドバンストDMEM/F-12500ミリリットル
ヘペス5ミリリットル
アラニルグルタミン5ミリリットル
ペニシリン-ストレプトマイシン5ミリリットル

表2:気道オルガノイド基底培地の成分

  1. セクション4.2で解離した生きた気道上皮細胞の数を使用して、10,000細胞の播種密度で播種できるウェルの数を計算します( 表3を参照)。





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結果

CBFの定量におけるこのプロトコルの効率を実証するために、CFの3人の参加者と3人の健康な対照参加者に由来する気道上皮細胞ALIモデルで測定されたCBFの結果が提示されます。培養分化の14日目には、叩動繊毛が存在した(図6)。培養分化の14日目から21日目まで、CBFの統計的に有意な(P < 0.0345)増加が両方のコホート内で観察されました。培養分化の21日目に、健康な対照参加者の平均CBF(7.61 ± 0.11 Hz)は、CFの参加者(6.75 ± 0.17 Hz)よりも有意に高かった。粘液の蓄積と除去がCBFにどの程度影響するかを理解するために、粘液の除去後に同じ細胞モデルでCBFを画像化しました。健常者とCF患者の両方のALIモデルでは、粘液を除去した場合、CBFが統計的に有意に増加しました(P < 0.0001)。

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ディスカッション

鼻上皮シート中のCBFの定量を不明瞭にする可能性のある複数の要因があります。上皮シートは、毛様体機能がこの時間の間に最も安定しているため、サンプル収集から3〜9時間以内に画像化する必要があります37。赤血球や破片が少ないと、データ収集が妨げられるため、イメージングに最適です。イメージングのROIを選択する場合、これらの変数がCBF5に影響を与えることが実証されているため、サンプルの収集中にエッジが損傷または破壊されておらず、単一の未付着の上皮細胞ではない上皮シートを選択することが重要です。また、動きによってデータ収集が不明瞭になる可能性があるため、上皮シートが静止している必要があります。媒体中の上皮シートはしばしば異なる方向に配向する27。上皮エッジの乱れなどのサンプル品質のばらつきがCBF5に影響を与えることが以前に実証されているため、上皮シートの配向もCBFに影響を与える可能性があります。このプロトコルの1つの制限は、上皮シートの配向の影響が評...

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開示事項

著者は、開示するものは何もないと宣言しています。

謝辞

研究参加者とその家族の貢献に感謝します。シドニー小児病院(SCH)ランドウィック呼吸器科からの患者の生体標本の整理と収集の支援に感謝します-ジョン・ウィジャー博士、イボンヌ・ベレッシス博士、リアン・プラッシュ、アマンダ・トンプソン、ロンダ・ベルに感謝します。私たちは、UNSWシドニーのマークウェインライト分析センター内のカタリーナガウス光学顕微鏡施設のイヴェタスラペトワとレニーワンの支援に感謝します。この作業は、オーストラリア国立保健医療研究評議会(NHMRC)(GNT1188987)、CF財団オーストラリア、シドニー小児病院財団の支援を受けています。著者らは、ルミネスアライアンス-子供の健康のためのイノベーションの貢献と支援に感謝したいと思います。Luminesce Alliance - Innovation for Children's Healthは、Sydney Children's Hospitals Network、Children's Medical Research Institute、Children's Cancer Instituteの非営利共同事業です。小児科研究を調整および統合するために、ニューサウスウェールズ州政府の支援を受けて設立されました。ルミネッセアライアンスは、シドニー大学とニューサウスウェールズ大学シドニー校とも提携しています。KMAは、オーストラリア政府の研究トレーニングプログラム奨学金によってサポートされています。LKFは、シドニーコーブ・ロータリークラブ/シドニー小児病院財団とUNSW大学大学院賞奨学金の支援を受けています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
アデニンSigma-AldrichA278610 mg/mL
Advanced DMEM/F-12Thermo Fisher Scientific12634-010
Alanyl-glutamineSigma-AldrichG8541200 mM
Andor Zyla 4.2 sCMOSOxford Instruments高速フレームレート (>100 Hz) 科学カメラ
ボトルトップ真空フィルターシステムSigma-Aldrich
セフタジジム水和物Sigma-AldrichA698750 mg/mL
細胞培養顕微鏡オリンパスCKX53
CFI S Plan Fluor ELWD 20XCニコンインスツルメンツMRH08230長作動距離対物レンズ。NA0.45 WD 8.2-6.9
コレラ毒素Sigma-AldrichC8052-1MG200 µg/mL
コーニング ゲルストレーナー 40 UMSigma-AldrichCLS431750細孔径 40 μm
Corning マトリゲル基底膜マトリックス(フェノールレッドフリー)Corning356231細胞外マトリックス(ECM)
Corningボトルトップ真空フィルターシステムSigma-AldrichCLS431098
Corning CoolCell LX細胞凍結容器Sigma-AldrichCLS432002
Corning Transwell ポリエステル膜細胞培養インサートSigma-AldrichCLS3470透過性サポートインサート。6.5 mmトランズウェル、0.4 μMポアポリエステルメンブレンインサート。
Countess Cell Counting Chamber SlidesThermo Fisher ScientificC10228
Countess II 自動セルカウンターThermoFisher ScientificAMQAX1000自動セルカウンター
細胞診ブラシMcFarlane Medical33009
DMEM/F12-HamThermo Fisher Scientific11330032
DMEM/F12-HamThermo Fisher科学11330032
DMEM-高グルコースサーモフィッシャーサイエンティフィック11965-092
ダルベッコ&プライム;Sigma-AldrichD8537
Eclipse Ti2-Eニコン生細胞イメージング顕微鏡。
ウシ胎児血清、認定、熱不活化、米国サーモフィッシャーサイエンティフィック10082147
菌ゾン(アムホテリシンB)サーモフィッシャーサイエンティフィック15290018250 µg/mL
ゲンタマイシン溶液Sigma-AldrichG139750 mg/mL
グラフパッド プリズムグラフパッド科学分析ソフトウェア
Greiner Cryo.s バイアルSigma-AldrichV3135極低温バイアル
HEPES 溶液Sigma-AldrichH08871 M
HI-FBSサーモフィッシャーサイエンティフィック10082-147
ヒドロコルチゾンSigma-AldrichH08883.6 mg/mL
インキュベーター NL Ti2 BLACK 2000PeCon顕微鏡環境チャンバー。温風インキュベーションと局所的なCO2およびO2ガス化が可能
インスリンSigma-AldrichI26432 mg/mL
ラボアーマー 74220 706 ウォーターレスビーズバス 6Lジョン・モリス・グループ74220 706ビーズ
ラボアーマーサーモフィッシャーサイエンティフィックA1254302サーマルビーズ
MATLABMathWorksコンピューティングソフトウェア
Microsoft ExcelMicroscoftスプレッドシート ソフトウェア
NIH/3T3American Type Culture CollectionCRL-1658照射済み NIH-3T3 マウス胚フィーダー細胞
NIS-Elements ARコンインスツルメンツ画像取得ソフトウェア
ペニシリン-ストレプトマイシンSigma-AldrichP433310,000単位 ペニシリンと10 mg streptomycin/mL
ダルベッコ′Sigma-AldrichD8537
PneumaCult Airway Organoid KitStemCell Technologies5060Airway Organoid Kit
PneumaCult-ALI MediumStemCell Technologies5001
PneumaCult-Ex Plus MediumStemCell Technologies5040
PureCol-SAdvanced BioMatrix5015Type Iコラーゲン溶液
試薬パック サブカルチャー試薬ロンザCC-5034
rhEGF (上皮成長因子、ヒト)Sigma-AldrichE964425 µg/mL
Y-27632 2HCl (ROCK阻害剤)SelleckchemS104910 mM
トブラマイシンSigma-AldrichT4014100 mg/mL
トリパンブルー溶液Sigma-AldrichT81540.4%
UNO Stage Top IncubatorOkolab顕微鏡インキュベーター。温度、湿度、CO2のコンディショニングが可能
CLS431098バス ビーズ ニ

参考文献

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