このプロトコルでは、鼻上皮細胞の収集、拡張、器官型気道上皮細胞モデルへの分化、および生細胞イメージングとカスタムビルドスクリプトによる繊毛拍動頻度の定量化について説明します。
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この記事について
サマリー
要約
繊毛機能(拍動頻度、パターン)の測定は、原発性毛様体ジスキネジアなどの呼吸器疾患の診断ツールとして確立されています。しかしながら、これらの技術のより広い適用は、温度、湿度、およびpHなどの環境要因の変化に対する繊毛機能の極端な感受性によって制限される。 嚢胞性線維症(CF)患者の気道では、粘液の蓄積が繊毛の拍動を妨げます。繊毛機能は、CF膜貫通コンダクタンスレギュレーター(CFTR)チャネル活性の指標として、一次気道細胞モデルで調査されています。しかし、繊毛拍動頻度のかなりの患者間変動は、同じ CFTR 変異を有する患者であっても、CFTR調節薬に応答して見出されている。さらに、機能不全のCFTR調節された塩化物分泌が毛様体機能に与える影響はよくわかっていません。現在、 in vitro 気道モデルのサンプル調製、画像取得、および繊毛拍動周波数(CBF)の分析を実証する包括的なプロトコルはありません。標準化された培養条件と環境制御された条件下で実行される画像取得により、個人間およびCFTR調節薬に応答したCBFの一貫した再現性のある定量が可能になります。このプロトコルは、3つの異なる気道上皮細胞モデルシステムにおけるCBFの定量について説明しています:1)ネイティブ上皮シート、2)透過性サポートインサート上に画像化された気液界面モデル、および3)細胞外マトリックス埋め込み3次元オルガノイド。後者の2つは、繊毛の拍動と粘液の産生を伴う in vivo 肺生理学を再現します。毛様体は、環境制御されたチャンバー内で高速ビデオカメラを使用してキャプチャされます。カスタムビルドのスクリプトは、CBFの分析に使用されます。CBF測定値の臨床への翻訳は、患者ごとにCFTR調節薬に対する反応を予測するための重要な臨床ツールであることが想定されています。
概要
繊毛拍動頻度(CBF)とパターンの測定は、原発性毛様体ジスキネジア(PCD)1などの呼吸器疾患の診断ツールとして確立されています。嚢胞性線維症(CF)では、CF膜貫通コンダクタンスレギュレーター(CFTR)塩化物チャネルの機能不全により、気道表面液の脱水と粘液繊毛クリアランスの障害を引き起こします2。繊毛機能は、CFTRチャネル活性の指標として一次気道細胞モデルで in vitro で調査されています3。しかし、CFTR調節薬に応答するCBFには、同じ CFTR 変異を有する患者であっても、かなりの患者間変動が存在する3。さらに、機能不全のCFTR調節された塩化物分泌が毛様体機能に与える影響はよくわかっていません。現在、 in vitro 気道モデルのサンプル調製、画像取得、およびCBFの分析を実証する包括的なプロトコルはありません。
鼻粘膜ブラッシングから分離された鼻上皮シートは、PCD診断の毛様体機能の測定に直接使用されます4。しかし、得られる鼻上皮シートのサイズや品質を制御することはできませんが、CBFは、単一細胞または細胞シート、および破壊された、または破壊されていない上皮シート....
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プロトコル
研究の承認は、シドニー小児病院ネットワーク倫理審査委員会(HREC/16/SCHN/120)から受けました。生物試料の収集前に、すべての参加者(または参加者の保護者)から書面による同意を得ました。
1. 気道上皮細胞モデル構築のための準備
- 80%ダルベッコ改変イーグル培地と20%ウシ胎児血清を組み合わせて、鼻細胞採取培地を準備します。1 μL/mLのペニシリン/ストレプトマイシンを補給します。4°Cで最大3ヶ月間保管してください。
- フラスコまたは透過性サポートインサートを、手順1.2.1〜1.2.4に従って、必要に応じてコラーゲン溶液でコーティングします。コラーゲンコーティングされた容器を長期間保管しないでください。
- I型コラーゲン溶液(3 mg/mLストック)をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で1:100に希釈し、最終濃度を0.03 mg/mLにします。よく混ぜる。
- 細胞培養フラスコ(セクション4)を160 μL/cm 2(T25フラスコあたり4 mL)および透過性サポートインサート(セクション5)で455 μL/cm2(すなわち、6.5 mmインサートあたり150 μL)でコーティングします。
- 37°Cで2〜24時間インキュベートします。
- 細胞を播種する前に、ピペットまたは真空ア....
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結果
CBFの定量におけるこのプロトコルの効率を実証するために、CFの3人の参加者と3人の健康な対照参加者に由来する気道上皮細胞ALIモデルで測定されたCBFの結果が提示されます。培養分化の14日目には、叩動繊毛が存在した(図6)。培養分化の14日目から21日目まで、CBFの統計的に有意な(P < 0.0345)増加が両方のコホート内で観察されました。培養分化の21日目に、健康な対照参加者の平均CBF(7.61 ± 0.11 Hz)は、CFの参加者(6.75 ± 0.17 Hz)よりも有意に高かった。粘液の蓄積と除去がCBFにどの程度影響するかを理解するために、粘液の除去後に同じ細胞モデルでCBFを画像化しました。健常者とCF患者の両方のALIモデルでは、粘液を除去した場合、CBFが統計的に有意に増加しました(P < 0.0001)。
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ディスカッション
鼻上皮シート中のCBFの定量を不明瞭にする可能性のある複数の要因があります。上皮シートは、毛様体機能がこの時間の間に最も安定しているため、サンプル収集から3〜9時間以内に画像化する必要があります37。赤血球や破片が少ないと、データ収集が妨げられるため、イメージングに最適です。イメージングのROIを選択する場合、これらの変数がCBF5に影響を与えることが実証されているため、サンプルの収集中にエッジが損傷または破壊されておらず、単一の未付着の上皮細胞ではない上皮シートを選択することが重要です。また、動きによってデータ収集が不明瞭になる可能性があるため、上皮シートが静止している必要があります。媒体中の上皮シートはしばしば異なる方向に配向する27。上皮エッジの乱れなどのサンプル品質のばらつきがCBF5に影響を与えることが以前に実証されているため、上皮シートの配向もCBFに影響を与える可能性があります。このプロトコルの1つの制限は、上皮シートの配向の影響が評.......
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開示事項
著者は、開示するものは何もないと宣言しています。
謝辞
研究参加者とその家族の貢献に感謝します。シドニー小児病院(SCH)ランドウィック呼吸器科からの患者の生体標本の整理と収集の支援に感謝します-ジョン・ウィジャー博士、イボンヌ・ベレッシス博士、リアン・プラッシュ、アマンダ・トンプソン、ロンダ・ベルに感謝します。私たちは、UNSWシドニーのマークウェインライト分析センター内のカタリーナガウス光学顕微鏡施設のイヴェタスラペトワとレニーワンの支援に感謝します。この作業は、オーストラリア国立保健医療研究評議会(NHMRC)(GNT1188987)、CF財団オーストラリア、シドニー小児病院財団の支援を受けています。著者らは、ルミネスアライアンス-子供の健康のためのイノベーションの貢献と支援に感謝したいと思います。Luminesce Alliance - Innovation for Children's Healthは、Sydney Children's Hospitals Network、Children's Medical Research Institute、Children's Cancer Instituteの非営利共同事業です。小児科研究を調整および統合するために、ニューサウスウェールズ州政府の支援を受けて設立されました。ルミネッセアライアンスは、シドニー大学とニューサウスウェールズ大学シドニー校とも提携しています。KMAは、オーストラリア政府の研究トレーニングプログラム奨学金によってサポートされています。LKFは、シドニーコーブ・ロータリークラブ/シドニー小児病院財団とUNSW大....
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| アデニン | Sigma-Aldrich | A2786 | 10 mg/mL |
| Advanced DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634-010 | |
| Alanyl-glutamine | Sigma-Aldrich | G8541 | 200 mM |
| Andor Zyla 4.2 sCMOS | Oxford Instruments | 高速フレームレート (>100 Hz) 科学カメラ | |
| ボトルトップ真空フィルターシステム | Sigma-Aldrich | ||
| セフタジジム水和物 | Sigma-Aldrich | A6987 | 50 mg/mL |
| 細胞培養顕微鏡 | オリンパス | CKX53 | |
| CFI S Plan Fluor ELWD 20XC | ニコンインスツルメンツ | MRH08230 | 長作動距離対物レンズ。NA0.45 WD 8.2-6.9 |
| コレラ毒素 | Sigma-Aldrich | C8052-1MG | 200 µg/mL |
| コーニング ゲルストレーナー 40 UM | Sigma-Aldrich | CLS431750 | 細孔径 40 μm |
| Corning マトリゲル基底膜マトリックス(フェノールレッドフリー) | Corning | 356231 | 細胞外マトリックス(ECM) |
| Corningボトルトップ真空フィルターシステム | Sigma-Aldrich | CLS431098 | |
| Corning CoolCell LX細胞凍結容器 | Sigma-Aldrich | CLS432002 | |
| Corning Transwell ポリエステル膜細胞培養インサート | Sigma-Aldrich | CLS3470 | 透過性サポートインサート。6.5 mmトランズウェル、0.4 μMポアポリエステルメンブレンインサート。 |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| Countess II 自動セルカウンター | ThermoFisher Scientific | AMQAX1000 | 自動セルカウンター |
| 細胞診ブラシ | McFarlane Medical | 33009 | |
| DMEM/F12-Ham | Thermo Fisher Scientific | 11330032 | |
| DMEM/F12-Ham | Thermo Fisher科学 | 11330032 | |
| DMEM-高グルコース | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 11965-092 | |
| ダルベッコ&プライム; | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Eclipse Ti2-E | ニコン | 生細胞イメージング顕微鏡。 | |
| ウシ胎児血清、認定、熱不活化、米国 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 10082147 | |
| 菌ゾン(アムホテリシンB) | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 15290018 | 250 µg/mL |
| ゲンタマイシン溶液 | Sigma-Aldrich | G1397 | 50 mg/mL |
| グラフパッド プリズム | グラフパッド | 科学分析ソフトウェア | |
| Greiner Cryo.s バイアル | Sigma-Aldrich | V3135 | 極低温バイアル |
| HEPES 溶液 | Sigma-Aldrich | H0887 | 1 M |
| HI-FBS | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 10082-147 | |
| ヒドロコルチゾン | Sigma-Aldrich | H0888 | 3.6 mg/mL |
| インキュベーター NL Ti2 BLACK 2000 | PeCon | 顕微鏡環境チャンバー。温風インキュベーションと局所的なCO2およびO2ガス化が可能 | |
| インスリン | Sigma-Aldrich | I2643 | 2 mg/mL |
| ラボアーマー 74220 706 ウォーターレスビーズバス 6L | ジョン・モリス・グループ | 74220 706 | ビーズ |
| ラボアーマー | サーモフィッシャーサイエンティフィック | A1254302 | サーマルビーズ |
| MATLAB | MathWorks | コンピューティングソフトウェア | |
| Microsoft Excel | Microscoft | スプレッドシート ソフトウェア | |
| NIH/3T3 | American Type Culture Collection | CRL-1658 | 照射済み NIH-3T3 マウス胚フィーダー細胞 |
| NIS-Elements AR | コンインスツルメンツ | 画像取得ソフトウェア | |
| ペニシリン-ストレプトマイシン | Sigma-Aldrich | P4333 | 10,000単位 ペニシリンと10 mg streptomycin/mL |
| ダルベッコ′ | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| PneumaCult Airway Organoid Kit | StemCell Technologies | 5060 | Airway Organoid Kit |
| PneumaCult-ALI Medium | StemCell Technologies | 5001 | |
| PneumaCult-Ex Plus Medium | StemCell Technologies | 5040 | |
| PureCol-S | Advanced BioMatrix | 5015 | Type Iコラーゲン溶液 |
| 試薬パック サブカルチャー試薬 | ロンザ | CC-5034 | |
| rhEGF (上皮成長因子、ヒト) | Sigma-Aldrich | E9644 | 25 µg/mL |
| Y-27632 2HCl (ROCK阻害剤) | Selleckchem | S1049 | 10 mM |
| トブラマイシン | Sigma-Aldrich | T4014 | 100 mg/mL |
| トリパンブルー溶液 | Sigma-Aldrich | T8154 | 0.4% |
| UNO Stage Top Incubator | Okolab | 顕微鏡インキュベーター。温度、湿度、CO2のコンディショニングが可能 |
参考文献
- Barbato, A., et al. Primary ciliary dyskinesia: a consensus statement on diagnostic and treatment approaches in children. European Respiratory Journal. 34 (6), 1264-1276 (2009).
- Cutting, G. R. Cystic....
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