方法論記事

小児びまん性正中線神経膠腫の生3D細胞免疫細胞化学アッセイ

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DOI：

10.3791/63091

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2021年11月11日

 ,  ,  , 
1Department of Onco-hematology, Gene and Cell Therapy, Bambino Gesù Children's Hospital, IRCCS, 2Oncology Service, Children's Health Queensland Hospital and Health Service, 3Child Health Research Centre, The University of Queensland

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

この研究は、小児びまん性正中線グリオーマ細胞株に適用される生3D細胞免疫細胞化学のプロトコルを提示し、3D細胞の浸潤や遊走などの動的プロセス中の原形質膜上のタンパク質の発現をリアルタイムで研究するのに役立ちます。

要約

細胞の移動と浸潤は、びまん性正中線神経膠腫(DMG)H3K27M変異腫瘍の特定の特徴です。これらの特徴は、3次元(3D)細胞ベースの浸潤および遊走アッセイを使用してすでにモデル化されています。本研究では、これらの3Dアッセイを生細胞免疫細胞化学用に最適化しました。抗体標識試薬を使用して、DMG H3K27M初代患者由来細胞株の遊走細胞および浸潤細胞の原形質膜上の接着分子CD44の発現をリアルタイムで検出しました。CD44は、癌幹細胞の表現型および腫瘍細胞の移動および浸潤に関連しており、中枢神経系(CNS)細胞外マトリックスとの直接的な相互作用に関与しています。DMG H3K27M細胞株由来のニューロスフェア(NS)を、抗体標識試薬(ALR)と併せて抗CD44抗体の存在下で、基底膜マトリックス(BMM)に埋め込むか、またはBMMの薄いコーティング層上に配置した。生細胞解析装置で生3D細胞免疫細胞化学画像解析を行い、CD44発現全体、特に遊走細胞と浸潤細胞を定量的に測定しました。この方法はまた、遊走および浸潤する細胞の原形質膜上のCD44の間欠的発現をリアルタイムで視覚化することを可能にする。さらに、このアッセイは、DMG H3K27M細胞の間葉系からアメーバへの移行におけるCD44の潜在的な役割に関する新しい洞察も提供しました。

概要

腫瘍細胞が周囲の組織を回避して拡散する能力は、癌の特徴です1。特に、腫瘍細胞の運動性は、乳房2や結腸直腸癌3などの転移性腫瘍型であろうと、びまん性神経膠腫4,5などの局所浸潤型であろうと、悪性腫瘍の特徴です。

イメージングは、腫瘍細胞の表現型の多くの側面の調査において中心的な役割を果たします。しかし、形態や細胞間相互作用の変化が起こり6,7、時間の経過とともにより簡単に調べることができる移動や浸潤などの動的な細胞プロセスを研究する場合は、生細胞イメージングが確実に好まれます。生細胞イメージングのために、位相差から共焦点蛍光顕微鏡まで、異なる光学顕微鏡システムを使用することができ、温度およびCO2制御用のチャンバーを備えた倒立顕微鏡、またはチャンバーを内蔵したハイコンテント画像解析システム、または全期間にわたって細胞を乱すことなくインキュベーター内に座ることができる画像システムにおいて、短期間または長期間にわたって画像取得を行うことができる実験の。使用するシステムの選択は、多くの場合、必要な分離能、全体的な取得時間と時間間隔の長さ、使用する容器の種類とアッセイのスループット(シングルチャンバーまたはマルチウェルプレート)、使用する細胞(貴細胞および/または希少細胞)の感度、蛍光色素が存在する場合の細胞の光毒性など、多くの要因によって決まります。

ライブモードでの蛍光イメージングに関しては、これは、安定した発現のために、または誘導可能なシステム8として蛍光タンパク質の発現のために細胞を形質導入することによって、一過性の細胞トランスフェクションによって、または生細胞標識7、生細胞追跡および細胞内オルガネラ9の標識のために現在利用可能な細胞色素を使用することによって達成することができる。

生細胞免疫細胞化学に有用なアプローチが最近開発されており、選択した表面マーカーを認識する抗体を標識試薬に結合させ、培地に添加すると、特異的マーカーを発現する細胞を生細胞イメージングによってリアルタイムで容易にイメージングできます。このようなシステムを用いたマーカー発現の可視化および定量化は、細胞が2次元(2D)培養条件下で増殖する場合に容易に達成することができる10。

この研究では、小児びまん性正中線神経膠腫(DMG)患者由来の細胞の生3D細胞免疫細胞化学の侵入と遊走のためのプロトコルを最適化しました11,12。DMGは、小児に影響を及ぼす非常に侵攻性の高い脳腫瘍であり、大多数はヒストンH3変異体におけるドライバー変異K27Mに関連する。DMGは、脳幹および中枢神経系(CNS)の正中線領域に発生し、非常に浸潤性の性質を特徴としています。この浸潤能力は、少なくとも部分的には、腫瘍内不均一性およびDMG細胞の癌幹様特徴によって媒介されることが示されている7。

アッセイを例示するために、抗体標識試薬(ALR)をCD44に対する抗体と組み合わせて使用しました。CD44は、幹細胞および他の細胞型に発現する膜貫通糖タンパク質および接着分子であり、癌幹細胞表現型ならびに腫瘍細胞の移動および浸潤に関連する13。プロトコルには、サンプル調製、明視野および蛍光モードでの画像取得、および3D侵入および遊走中のDMG細胞膜上の全体的なCD44発現をリアルタイムで定量的に測定できる生細胞分析装置での解析が含まれます。アッセイはまた、遊走および浸潤中の個々の細胞上のCD44の断続的な蛍光シグナルを視覚化する可能性を可能にしました。興味深いことに、抗CD44抗体の効果も観察され、これは潜在的にブロッキング抗体として作用し、細胞の移動と浸潤を減少させるだけでなく、集合間葉様からより単一細胞アメーバ様表現型への浸潤パターンの切り替えを誘導するようでした。

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プロトコル

このプロトコルは、機関の人間研究倫理委員会のガイドラインに従います。

注:この研究は、Incucyte S3および/またはSX5生細胞分析機器(生細胞分析機器として参照)を使用して実施されました。

1. 再現性のあるサイズの腫瘍スフェロイドの作製

注:Vinci et al. 2015 7,12によって記述されたプロトコル(セクション1)は、いくつかの変更を加えて、以下に報告されているように使用されました。

  1. DMG H3K27M変異ニューロスフェア(NS)を採取し、室温(RT)で170 x g で10分間(分)遠心分離します。
  2. NSを500 μLのアキュターゼ溶液とともに37°Cで3分間インキュベートして分解します。
  3. アキュターゼ溶液を腫瘍幹細胞(TSM)培地7 で中和し、細胞懸濁液を355 x g でRTで5分間遠心分離します。
  4. 細胞ペレットを1 mLのTSM培地に再懸濁し、細胞計数チャンバーを使用して細胞を計数します。
  5. 細胞懸濁液を希釈して2.5-5 x 103細胞/mLとし、100 μL/ウェルを超低接着(ULA)96ウェル丸底プレートに播種します( 材料表を参照)。適切な細胞密度を使用して、細胞播種の4日後に直径~300 μmの個々のNSを取得します(非常に攻撃的な神経膠腫細胞の場合は250-500細胞/ウェル)。
  6. 細胞播種後4日目に倒立顕微鏡を用いてNS形成を目視で確認した。

2. ALR/抗体複合体の調製とインベージョンアッセイのセットアップ

注:抗体標識手順では、以下で報告するように、生細胞免疫細胞化学用の抗体標識色素プロトコル10 がいくつかの変更を加えて使用されます。浸潤アッセイについては、Vinci et al. 201512 によって前述したプロトコルに従う。

  1. 分析するウェルの数(例えば、60ウェル)を考慮し、各試薬に必要な量を計算します。また、陰性対照用のウェル(ALRを含むが抗体を含まないサンプル)も含む。
  2. ALRに滅菌水100 μLを加えて試薬を再水和します(最終濃度 = 0.5 mg/mL)。溶液を混合するためにピペット。
    注:試薬は光に敏感です。したがって、暗闇に保管してください。残った試薬を分注し、-80°Cで保存します(凍結および解凍を避けてください)。
  3. 丸底マルチウェルプレートまたはアンバーチューブでTSM培地(または選択した細胞株に適した細胞増殖培地)でALRと抗体を混合し、光から保護します。
  4. 最終アッセイ濃度の 3 倍で 25 μL/ウェルを分注するのに十分な量の培地を準備します。RTで15分間インキュベートします。
    注:抗体とALRのモル比は1:3で、試験抗体の最終(1倍)濃度は<1.5 μg/mLであることが推奨されます。このプロトコルでの実験では、抗ヒトCD44マウス抗体(開始濃度86 μg/mL)を最終濃度0.1 μg/mL(3x濃度= 0.3 μg/mL)で使用します。以下の順序で試薬を添加する:i)抗体;ii) ALR;iii) TSM 媒体。ピペッティングで混合します。
  5. バックグラウンドサプレッサー試薬(BSR)をTSM培地(または選択した細胞株に適した細胞増殖培地)で1.5 mM(3x)に希釈し、アッセイ終了時に最終濃度0.5 mMを取得します。
  6. 浸潤アッセイは、細胞が最初に播種されたULA 96ウェル丸底プレートで直接行います。開始前に倒立顕微鏡でNSを目視で確認してください。
  7. 75 μL/ウェルの培地をゆっくりとゆっくりと除去し、NSが置かれているウェルの底に触れないようにします。NSの存在を目視で確認します。
  8. 各ウェルに25 μLのBSRを静かに加えます。
  9. 25 μLのALR/抗体複合体を各ウェルに穏やかに添加します。ALR/抗体複合体が培地と混合するまで2〜3分待ちます。
  10. 倒立顕微鏡を使用して目視で確認し、各NSがウェルの底の中央に配置されていることを確認します。泡の形成を避けてください。気泡がある場合は、針を使用して取り除きます。
  11. プレートを氷の上に置き、プレートの底が冷えるまで5分間待ちます。
  12. 予冷したp200チップを使用して、75 μL/ウェルの基礎膜マトリックス(BMM)を分注し、ピペットチップをウェルの内壁に置き、ウェルの底に触れないようにします。泡の形成を避け、既存のものを滅菌針で取り除きます。
    注意: BMMは前夜から4°Cで解凍したことを確認してください。
  13. プレートを氷の上に5分間放置して、BMMを培地と混合させます。倒立顕微鏡を使用して、NSの存在とそれらがウェルの中央に配置されていることを視覚的に確認します。そうでない場合は、プレートを4°Cで180 x g で5分間遠心分離します。
  14. プレートをインキュベーター内に置かれた生細胞分析機器(材料表)に移し、37°C、5%CO2、湿度95%にします。

3. ALR/抗体複合体の調製と遊走アッセイのセットアップ

注:抗体標識手順には、生細胞免疫細胞化学用の標識色素プロトコル10 が使用されます。

  1. 分析するウェルの数を検討し、各試薬に必要な量を計算します。ネガティブコントロールに必要なウェルも含めます。開始前に倒立顕微鏡でNSを目視で確認してください。
  2. 平底96ウェルプレートを使用してください。Vinci et al., 201314 によって記載されるコーティング手順を実行する。この研究では、BMMを薄いコーティングとして使用します。
  3. コーティングの準備ができたら、p200チップで余分なBMMコーティングを取り除き、チップをウェルの端に配置し、底に触れないようにします。複数のウェルを扱う場合は、マルチチャンネルピペットを使用してください。
  4. p200チップを切断し、選択した各ウェルから50 μLの細胞培地+ NSを取り出し、コーティングされた平底ウェルに移します。各ウェルにおけるNSの存在及び位置を目視で確認する。
    注: 各 NS は、ウェルの中央に配置する必要があります。移送中はウェルの端にある先端に寄りかかることは避けますが、底に触れずに培地をウェルの中央に落とします。移動性の高い細胞の場合は、標準の3回の反復よりも多くの反復数を検討します。これは、NSがウェルの端に近すぎると、遊走細胞がウェルのより小さな領域を覆う可能性があるためです。
  5. 上記のようにALRをリハイドレートします(手順2.2〜2.3)。
    注:試薬は光に敏感です。適切な取り扱い手順については、上記を参照してください。
  6. 丸底マルチウェルプレートまたは琥珀色のチューブ内の適切な完全細胞増殖培地中で抗体とALRを混合し、光から保護します。最終アッセイ濃度の 3x で 50 μL/ウェルを分注するのに十分な量を調製します。RTで15分間インキュベートします。
    注意: 上記の順序で試薬を追加します(手順2.4)。
  7. 手順 2.5 で報告したのと同じ手順に従います。
  8. 各ウェルに50 μLのBSRを静かに加えます。
  9. 50 μLのALR/抗体を各ウェルに穏やかに添加します。2〜3分待って試薬を混合し、倒立顕微鏡を使用して目視で確認し、複製NSのほとんどがウェルの中央に配置されていることを確認します。
  10. 気泡の形成を避け、針を使用して既存の気泡を取り除きます。インキュベーター内に置かれた生細胞分析装置でプレートを37°C、5%CO2、95%湿度で静かに移します。

4. 画像取得のための生細胞解析装置の設定

  1. 生細胞分析装置(仕様については、 材料表を参照)を使用して、ステップ2.14の後にそれぞれセットアップされた浸潤アッセイと遊走アッセイの時点ゼロ(t0)から始まるスキャン間隔でプレートをスキャンします。および3.10。96時間まで。
    注意: 侵入および遊走アッセイの開始直後に生細胞分析機器を廃棄できることを確認してください。腫瘍の種類に応じて、細胞はアッセイセットアップから1時間以内にすでにNSから浸潤または移動し始める可能性があります。
  2. 生細胞解析装置ソフトウェアで、 取得スケジュールオプションを選択します。[ + ]タブをクリックし、[ スケジュールに従ってスキャン]オプションを選択します。
  3. ソフトウェアウィンドウの船舶 の作成または復元で、 新規オプションをクリックします。
  4. 生細胞解析装置で、浸潤および遊走の取得のための特定のアプリケーションを選択します。侵襲アッセイ用に、 スフェロイド スキャンタイプ、4倍対物レンズ、 フェーズ+明視野 、 およびグリーン 画像チャンネルを選択します。希釈 クローニング スキャンタイプ、4倍対物レンズ、移行アッセイ用の フェーズ と グリーン を選択します。
  5. プレートタイプを選択し、プレートマップ上でハイライト表示してスキャンするウェルを定義します。
  6. スキャン頻度を設定します(このプロトコルの実験では、スキャン頻度は侵入に15分、移行に30分でした)。
  7. [ スケジュールに追加] をクリックして、スキャンを開始します。

5. 画像解析のための生細胞解析装置の設定

  1. [ 新しい解析定義の作成]タブを選択します。
  2. タブで、侵入と移行のための スフェロイド Invasion または 基本アナライザー アプリケーションをそれぞれ選択します。
  3. イメージ チャネルで、侵入と移行に適したチャネル (侵入の場合: フェーズ + 明視野 - 緑、移行の場合: フェーズ - 緑) を選択します。
  4. 3〜4個のウェルからいくつかの代表的な画像を選択して、分析設定をプレビューおよび調整します。
  5. 浸潤アッセイでは、 解析定義 タブで、 明視野 チャネルと 緑 チャネルのアプリケーション設定を次の設定で調整し、回転楕円体全体細胞と侵入細胞の間の正確なセグメンテーションを生成します( 図5、青色のマスクを参照)。
    明視野セグメンテーション:回転楕円体全体の感度= 50;侵入細胞感度= 100;クリーンアップ = デフォルト。
    回転楕円体全体フィルター: すべてのパラメーターをデフォルトとして設定します。
    侵入セルフィルター:すべてのパラメーターをデフォルトとして設定します。
    緑のセグメンテーション: 半径 = 900。
  6. マイグレーションアッセイの場合は、 フェーズ チャネルとグリーンチャンネルのアプリケーション設定を調整して、次の設定でConfluenceセルと グリーン セルの間に正確なセグメンテーションを生成します( 図5、黄色とピンクのマスクを参照)。
    フェーズ:すべてのパラメータをデフォルトとして設定します。
    緑のセグメンテーション: 半径 = 300;しきい値 = 1000
    クリーンアップ: 穴埋め = 400;フィルター = デフォルト。
    ホールウェル:すべてのパラメータをデフォルトとして設定します。
  7. 複数のウェルをランダムにクリックして、NSの分析設定が正しいことを確認します。セグメンテーションは回転楕円体の輪郭を描く必要があります。そうでない場合は、それに応じて設定を調整してください。
  8. 分析するウェルと時点を選択します。
  9. 解析定義を保存し、[完了]をクリックします。

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結果

浸潤と遊走のためのLive-3D-Cell免疫細胞化学プロトコルは、 図1の簡単で再現性のあるワークフローにまとめられています。DMG細胞をULA 96ウェル丸底プレートに播種することにより、再現可能なサイズのNSが得られ、表示されたステップで使用されます。NSが理想的なサイズである~300 μmに達すると(播種後約4日)、侵入12 および遊走14 アッセイが開始されます。個々のNSの培地にバックグラウンドサプレッサーとともにALR/抗体複合体を添加することで、細胞膜上の特異的マーカー発現をライブイメージングおよび経時的に追跡することができます。細胞の浸潤および遊走中の表面マーカー発現は、生細胞分析装置を使用して、t = 0から96時間までの間隔で簡単にモニターできます。このイメージングシステムは、完全に自動化された画像解析を可能にします。

初代患者由来の細胞株であるQCTB-R059を使用して、小児DMG腫瘍播種の浸潤および遊...

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ディスカッション

今回採用した小児DMGの浸潤および遊走に採用した生3D細胞免疫細胞化学は、乳がんや結腸がんの細胞株など、他の高侵襲性腫瘍細胞にも容易に適応できます。

以前に実施された生2D細胞免疫細胞化学アッセイ10とは異なり、3Dで作業する場合、いくつかの重要なステップに注意を払うことが示唆される。特に、ここで説明する浸潤アッセイでは、BMMを添加する前に、ALR/抗体ミックスを各ウェルにNSを入れた培地に直接添加し、BMM内またはゲル化後にBMMの上に添加しないことをお勧めします。これは、試薬と培地の良好な混合を可能にし、試薬の細胞表面へのより直接的なアクセスを確保するためです。さらに、より良い品質のイメージングを確保するために、プロトコルにはBSRの使用が含まれていますが、フェノールレッドフリー培地とBMMを使用することをお勧めします。

生細胞免疫細胞化学で考慮すべきもう一つのポイントは、生細胞上の細胞外膜タンパク質に結合する抗体は、その立体構造を変化させたり、隣接する細胞上のリガンド...

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開示事項

著者は、原稿で議論されている主題または資料に金銭的利害関係または金銭的矛盾を持つ組織または団体に関連する提携または財政的関与を持っていません。

謝辞

イメージングプロトコルの予備セットアップでIncuCyte S3ライブセルイメージングシステムにアクセスしてくださったSilvia Sodu博士とGiulia Federici博士(IRCCS-Regina Elena National Cancer Institute、ローマ、イタリア)に感謝します。さらに、技術的なアドバイスを提供してくれたBernadett Kolozsvariに感謝します。この研究は、Children with Cancer UK助成金(16-234)とイタリア保健省Ricerca Correnteの支援を受けた。Mヴィンチは、小児がん英国フェローです。Rフェレッティは、フォンダツィオーネヴェロネーゼフェローシップ(2018年および2019年)の受賞者です。著者らは、Fondazione Healの支援と、クイーンズランド小児腫瘍バンクへの資金提供を行った小児病院財団に感謝しています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
96ウェルTC処理マイクロプレートコーニング3595サイズ 96ウェル、ポリスチレンプレート、平底
アキュターゼユーロクロンニューロスフェア解離ECB3056D液
バーカーチャンバーMv メディカルFFL16034細胞計数チャンバー
CD-44 (156-3C11)細胞シグナル伝達技術3570マウス mAb IgG2a
コーニングマトリゲルマトリックスコーニング356237基底膜マトリックス(BMM)、フェノールレッドフリー、LDEVフリー
Fabfluor-488抗体標識色素Incucyte4743抗体標識試薬(ALR):生細胞免疫細胞化学用マウスIgG2a 488抗体
Incucyte S3および/またはSX5 生細胞分析装置ザルトリウス-IncuCyte S3および/またはSX5 Instrumentは、リアルタイムの細胞モニタリングとサーベイランス、細胞の健康と生存率、遊走と浸潤、さらに幅広い表現型細胞ベースのアッセイに使用されます。
倒立顕微鏡-任意の倒立顕微鏡
Opti-Green Background SuppressorReagent Incucyte6500-0045Backgroung Suppressor Reagent (BSR)
腫瘍幹細胞(TSM)培地--増殖細胞培地(詳細については本文中の参照を参照)
超低アタッチメント Multiple Well PlateCorning Costar7007size 96 well, Round bottomクリア

参考文献

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