Method Article

多能性幹細胞由来の自己組織化ヒト心臓オルガノイドの生成

DOI:

10.3791/63097

⸱

September 15th, 2021

 ,  ,  ,  , 
1Institute for Quantitative Health Science and Engineering, Division of Developmental and Stem Cell Biology, Michigan State University, 2Department of Biomedical Engineering, College of Engineering, Michigan State University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここでは、自己組織化によってヒト多能性幹細胞を用いて、発達的に関連するヒト心臓オルガノイド(hH)を効率的に作成するためのプロトコルについて述べた。このプロトコルは、発達的手がかりの逐次活性化に依存し、非常に複雑で機能的に関連するヒト心臓組織を生成する。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

健康と病気におけるヒト心臓の発達を研究する能力は、 インビトロでのヒト心臓の複雑さをモデル化する能力によって非常に制限される。オルガノイドやオルガンオンチップなどの複雑な 生体内 表現型をモデル化できる、より効率的な臓器のようなプラットフォームを開発することは、人間の心臓の発達と病気を研究する能力を高めるでしょう。本論文では、ヒト多能性幹細胞を用いた自己組織化と、低分子阻害剤を用いた段階的発達経路活性化により、非常に複雑なヒト心臓オルガノイド(hH)を生成するプロトコルについて述べている。胚体(EBs)は、ラウンドボトム、超低付着ウェルを備えた96ウェルプレートで生成され、個別の構築物の懸濁培養を促進します。

EBsは、心臓中皮運命を誘導するための最初のWnt経路活性化、決定的な心臓系統を作成するためのWnt阻害の第2ステップ、および前EPICAR組織を誘導する第3のWnt活性化ステップを含む3段階のWntシグナル伝達変調戦略によってhHOsへの分化を受ける。これらのステップは、96ウェル形式で行われ、非常に効率的で再現性が高く、1回の実行ごとに大量のオルガノイドを生成します。分化の3日目から11日目までの免疫蛍光イメージングによる分析は、心房および心室心筋細胞の領域を有する心筋組織および内腔内の内膜組織を含む、15日目のhHOs内の第1および第2の心臓フィールド仕様および非常に複雑な組織を明らかにする。オルガノイドはまた、構造全体に複雑な血管ネットワークを示し、外膜組織の外部内層を示す。機能的な観点から、hHOsは強く打ち負かし、Fluo-4ライブイメージングによって決定される正常なカルシウム活性を示す。全体として、このプロトコルは、ヒト臓器様心臓組織 におけるインビトロ 研究のための強固なプラットフォームを構成する。

Introduction

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先天性心不全(CHD)は、ヒトにおける先天性欠損の最も一般的なタイプであり、全ての出生の約1%に影響を及ぼす1,2,3。ほとんどの場合、CHD の理由は不明のままです。開発中の人間の心臓に近いヒトの心臓モデルを実験室で作成する能力は、代理動物モデルではなく、ヒトにおけるCHDの根本的な原因を直接研究するための重要な前進を構成する。

実験室で成長した組織モデルの縮図は、細胞組成および生理機能に関心のある器官に似たオルガノイド、3D細胞構築物である。オルガノイドは幹細胞や前駆細胞に由来することが多く、脳4,5、腎臓6、7、腸8、9、肺10、11、肝臓12,13、膵臓などの多くの臓器のモデル化に成功しています

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Protocol

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1. hPSCの文化とメンテナンス

注:ヒト誘導PSC(hiPSC)またはヒト胚性幹細胞(hESC)は、分化またはさらなる凍結保存のためにEBを生成するために使用される前に、解凍後に少なくとも2回連続した通路のために培養する必要があります。hPSCは、基質膜外細胞マトリックス(BM-ECM)コーティングされた6ウェル培養プレート上のPSC培地( 材料表参照)で培養される。6ウェルプレートでhPSCにメディアチェンジを行う場合は、細胞の上に直接置かずにウェルの内側に直接培地を追加して、不要な細胞の剥離やストレスを防ぎます。ユーザーは、37 °Cで温めてはならないPSCメディアを温める前に警戒する必要があります。このプロトコルで使用されるすべてのPSCメディアは耐熱性であった。

  1. BM-ECMでウェルプレートをコーティングするには、BM-ECMのアリコート(メーカーの指示に従って-20°Cで保存)を氷上で解凍し、BM-ECMの0.5mgを冷たいダルベックの改変イーグル培地(DMEM)/F12培地(DMEM)/F12培地(4°Cで保存)と12mL混合します。DMEM/F12-BM-ECM混合物の2 mLを6ウェルプレートの各ウェルに分配し、37°Cで少なくとも2時間インキュベートします。
  2. 細胞を解凍するには、まず、37°Cビーズまたは水浴中のhPSC cryovialを1〜2分間解凍し、少量の氷のみが見えるまで....

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Results

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インビトロで自己組織化hHOを達成するために、我々は、Wnt経路モジュレーターを使用した心筋細胞21および心外細胞22の2D単層分化および成長因子BMP4およびアクチビンAを用いた3D前心臓オルガノイド16に関して以前に説明した分化プロトコルを修正し、組み合わせた図Wnt経路活性化因子CHIR99021の濃度と曝露期間は、ヒトPSCに由来する高度に再現性の高い複雑なhHHOsを得るように最適化された。

EBは、0日目に分化を開始する前に、24時間後に培地変化で48時間インキュベートした。0日目には、各ウェルの中心にある黒色球状の凝集体として、光顕微鏡下で見える必要があります(図1B)。分化プロトコルは、ちょうど24時間のWnt経路活性化および成長.......

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Discussion

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ヒト幹細胞由来心筋細胞および心臓由来の他の細胞の最近の進歩は、ヒト心臓の発達22,24,25および疾患26,27,28をモデル化し、治療をスクリーニングするためのツールとして使用されています29,30および有毒物質31,32.ここでは、EJB を生成して高度に複雑な hHOs に分け込める、実装が容易で、非常に再現性の高いプロトコルを報告します。このプロトコルは、hPSCやhESCs23を.......

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Disclosures

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著者は宣言する利害の対立を持っていません。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究は、国立衛生研究所の国立心臓、肺、血液研究所の賞番号K01HL135464とR01HL151505の下で、および賞番号19IPLOI34660342の下で米国心臓協会によってサポートされました。MSU薬理毒性学科のMSUアドバンスト顕微鏡コアとウィリアム・ジャクソン博士は、コンフォーカル顕微鏡、IQ顕微鏡コア、シーケンシングサービスのためのMSUゲノミクスコアへのアクセスに感謝したいと思います。また、アギーレラボのメンバーの皆様の貴重なコメントやアドバイスに感謝申し上げたいと思います。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
抗体
Alexa Fluor 488 Donkey anti-mouseInvitrogenA-212021:200
Alexa Fluor 488 Donkey anti-rabbitInvitrogenA-212061:200
Alexa Fluor 594 Donkey anti-mouseInvitrogenA-212031:200
Alexa Fluor 594 Donkey anti-rabbitInvitrogenA-212071:200
Alexa Fluor 647 ロバ アンチヤギInvitrogenA328491:200
HAND1Abcamab196622ウサギ; 1:200
HAND2Abcam ab200040ウサギ; 1:200
NFAT2Abcamab25916ウサギ; 1:100
PECAM1DSHBP2B1ウサギ; 1:50
TNNT2Abcamab8295マウス;1:200
THY1Abcamab133350ウサギ; 1:200
TJP1InvitrogenPA5-19090ヤギ; 1:250
VIMAbcamab11256ヤギ; 1:250
WT1Abcamab89901ウサギ; 1:200
培地および試薬
AccutaseInnovative Cell TechnologiesNC9464543細胞解離試薬
Activin AR&D Systems338AC010
B-27 Supplement (マイナスインスリン)GibcoA1895601インスリンフリー細胞培養サプリメント
B-27 SupplementGibco17504-044細胞培養サプリメント
BMP-4GibcoPHC9534
Bovine Serum AlbuminBioworld50253966
CHIR-99021Selleck442310
D-(-)-フルクトースミリポアSigma F0127
DAPIThermo Scientific622481:1000
ジメチル スルホキシドミリポア SigmaD2650
DMEM/F12Gibco10566016
Essential 8 Flex Medium KitGibcoA28585011% を含む多能性幹細胞 (PSC) 培地ペニシリン-ストレプトマイシン
Fluo4-AMInvitrogenF14201
グリセロールミリポア SigmaG5516
グリシンミリポア Sigma410225
マトリゲル GFRコーニングCB40230基底膜細胞外マトリックス (BM-ECM)
ノーマル ロバ血清ミリポア ΣS30-100mL
パラホルムアルデヒドMP バイオメディカルIC15014601PBS バッファーに溶解した粉末 – 4%
ペニシリン-ストレプトマイシンGibco15140122
リン酸緩衝液Gibco10010049
リン酸緩衝液 (10x)Gibco70011044
Polybead MicrospheresPolysciences, Inc.7315590 µm
ReLeSRStem Cell TechnologiesNC0729236hPSC用解離試薬
RPMI 1640Gibco11875093
ThiazovivinMillipore SigmaSML1045
Triton X-100Millipore SigmaT8787
Trypan Blue SolutionGibco1525006
VECTASHIELD Vibrance Antifadeマウント 培地ベクター研究所H170010
WNT-C59SelleckNC0710557
その他の
1.5 mL 微量遠心チューブフィッシャー サイエンティフィック02682002
15 mL ファルコン チューブフィッシャー サイエンティフィック1495970C
2 mL 極低温バイアルコーニング13-700-500
50mL 試薬リザーバーフィッシャーブランド13681502
6ウェル平底 細胞培養プレートコーニング0720083
8 ウェルチャンバーカバー #1.5 高性能カバーガラスセルビスC8-1.5H-N
96ウェル クリア超低アタッチメント マイクロプレート共演07201680
ImageJNIH画像処理ソフトウェア
KimwipesKimberly-Clark Professional06-666laboratory wipes
Micro Cover GlassVWR48393-24124 x 50 mm No. 1.5
Microscope SlidesFisherbrand1255015
Moxi Cell CounterOrflo Technologies MXZ001
Moxi Z セルカウントカセット –タイプMオルフロー テクノロジーMXC001
マルチチャンネルピペットフィッシャーブランドFBE120030030-300 & マイクロ;L
オリンパス cellVivoオリンパスカクリウムイメージング、Imagej
Sorvall Legend X1による分析 遠心分離機サーモフィッシャーサイエンティフィック75004261
サーマルミキサーサーモフィッシャーサイエンティフィック13-687-717
トップコート ネイルヴァリッシュSeche Viteどのスーパーマーケットからでも購入可能

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hoffman, J. I. E., Kaplan, S. The incidence of congenital heart disease. Journal of the American College of Cardiology. 39 (12), 1890-1900 (2002).
  2. Wu, W., He, J., Shao, X. Incidence and mortality trend of congenital heart disease....

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