我々は、マイクロパターニング技術を用いて、 インビトロで多細胞キラリティーを決定するためのプロトコルを提示する。このアッセイは、様々なタイプの細胞の左右バイアスの自動定量を可能にし、スクリーニング目的に使用することができる。
このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。
この記事について
サマリー
要約
キラリティーは固有の細胞特性であり、細胞の左右軸に沿った偏光の観点から非対称性を描写する。このユニークな特性は、発生と疾患の両方において重要な役割を担っているため、細胞のキラリティーを特徴付けるための標準化された定量化方法が研究と潜在的な用途を前進させるでしょう。このプロトコルでは、細胞のマイクロパターンアレイを利用する多細胞キラリティー特性評価アッセイについて説明します。セルラーマイクロパターンは、チタン/金コーティングされたスライドガラス上にマイクロコンタクト印刷を介して製造されます。幾何学的に定義された(例えば、リング状の)タンパク質コーティングされた島に播種した後、細胞は方向的に移動し、時計回りまたは反時計回りの方向に向かって偏ったアライメントを形成し、カスタム記述のMATLABプログラムによって自動的に分析および定量することができる。ここでは、マイクロパターン基板の作製、細胞播種、画像収集、データ解析について詳細に説明し、NIH/3T3細胞を用いて得られた代表的な結果を示す。このプロトコルは、以前に複数の公表された研究で検証されており、 インビトロで細胞キラリティを研究するための効率的で信頼性の高いツールです。
概要
細胞の左右(LR)非対称性は、細胞利きまたはキラリティーとしても知られており、LR軸における細胞極性を記述し、基本的で保存された生物物理学的特性であると認識されている1、2、3、4、5。細胞キラリティーは、インビボおよびインビトロの両方で複数のスケールで観察されている。以前の発見は、円形の島6に播種された単一細胞におけるアクチン細胞骨格のキラル旋回、閉じ込められた境界7、8、9、10、11内の細胞の偏った遊走および整列、およびニワトリヒートチューブ12の非対称ループを明らかにした。
多細胞レベルでは、細....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
プロトコル
ポリジメチルシロキサン(PDMS)切手の作製16
- CADソフトを使用して、内径250μm、外径450μmのマイクロスケールリングのアレイを描きます。このプロトコルで使用されるパターンは、リング間の距離が 850 μm の 10 x 10 アレイです。
- 微細加工会社のマスク印刷サービスを使用して、パターンの透明マスクを所望の解像度で印刷 する(材料表を参照)。
注:リングの付属寸法は、多くの細胞タイプで動作することが証明されています7。 - 所望の特徴を含むマスクを用いて紫外線(UV)フォトリソグラフィーを行い、ネガ型フォトレジストモールド(SU-8など)8を作製する。
- ステップ1.1~1.2で作製した透明マスクによりフォトレジストでスピンコートしたシリコンウェーハを覆う。
- UVコンタクトアライナー上で、UV光によってマスクの透明領域下でフォトレジストを重合させる。
注:さらなる洗浄と現像の後、所望の特徴を有するマスターモールドが製造される8。操作の詳細は、使用される特定の機器によって異なります。
- 硬化剤と10:1の比率で混合することによってPDMSエラストマー....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
結果
NIH/3T3細胞の播種から15分後、リングパターン上の細胞接着を位相差イメージングにより目視で確認した。その後の24時間の培養後、パターン上の細胞はコンフルエントになり、明らかに非対称なアライメントで細長くなり、時計回り方向に偏った(図2)。付着した細胞の指向性遊走は、タイムラプス画像によって記録され、細胞運動性および形態形成は、ビデオのさらなる分析によって定量化され得る。キラリティー解析を行うために、固定後に高解像度位相コントラスト画像を撮影し(図2A-C)、MATLABプログラムに供給します。プログラムは強度勾配を検出し、リング上の対応するセルアライメント方向を計算します。次に細胞キラリティは、環の円周方向から逸脱した細胞位置合わせの円形統計に基づいて決定される。したがって、細胞は時計回り(CW)、反時計回り(CCW)、または非キラル(NC)として指定することができます(図2D)。処理後.......
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
ディスカッション
ここで説明するリング状のパターニングアッセイは、多細胞キラリティの定量的特性評価のための使いやすいツールを提供し、信頼性と再現性の高い結果を生み出すことができます。同一の定義済みマイクロ環境の迅速な生成と偏りのない分析により、大容量サンプルの自動ハイスループット処理が可能になります。このプロトコルでは、リングマイクロパターンの作成、セルパターニング、およびバイアスされたセルアライメントと方向運動の自動分析について説明します。この方法は、細胞の運動性およびキラル形態形成を研究するためのライブイメージング技術と互換性があり、毒性検出9 または薬物スクリーニング用途のために他の平面形態に潜在的に統合することができる。
他にも、共有するヒントがいくつかあります。まず、マイクロコンタクト印刷工程では、ガラスの金側にスタンプを作る必要があり(基板を細かく切断した後、区別が難しい場合があります)、二重印刷は避けるべきです。第2に、適切な付着のために他のタンパク質を必要とする細胞について、好ましいタンパク質をステップ3.17で使用することができる。第.......
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
開示事項
著者らは開示するものは何もありません。
謝辞
この研究は、国立衛生研究所(OD/NICHD DP2HD083961およびNHBLI R01HL148104)から資金提供を受けた。レオ・Q・ワンは、ピュー慈善信託の支援を受けている生物医学科学(PEW 00026185)のピュー奨学生です。Haokang Zhangは、American Heart Association Predoctoral Fellowship(20PRE35210243)の支援を受けています。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 200プルーフエタノール | Koptec | DSP-MD-43 | |
| BZX顕微鏡システム | キーエンス | BZX-600 | |
| ダルベッコの修正イーグル培地(DMEM)、高グルコース | ギブコ | 11965092 | |
| 電子ビーム蒸発器 | Temscal | BJD-1800 | 金チタンフィルムコーティング |
| ウシ胎児血清 | VWR | 89510-186 | |
| ウシ血漿からのフィブロネクチン | シグマ | F1141-5MG | |
| ガラス顕微鏡スライド | VWR | 10024-048 | |
| ガラスピンセット | エクセルタ | 390BSAPI | |
| 金蒸発ペレット | インターナショナル・アドバンスド・マテリアル | AU18 | |
| HS-(CH2)11-EG3-OH (EG3) | Prochimia | TH 001-m11.n3-0.2 | |
| MATLAB | Mathworks | MATLAB_R2020b | |
| NIH/3T3 細胞 | ATCC | CRL-1658 | |
| OAI コンタクト アライナー | OAI | 200 | UV フォトリソグラフィー |
| オクタデカンチオール (C18) | シグマ | O1858-25ML | |
| オービタル シェーカー | VWR | 89032-088 | |
| リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) | 研究製品 国際 | P32080-100T | |
| ポリジメチルシロキサン シルガード 184 | ダウ コーニング | DC4019862 | |
| シリコンウェーハ | 大学ウェーハ | ID#809 | |
| ピルビン酸ナトリウム | サーモフィッシャー 科学 | 11360-070 | |
| SU-8 3050 フォトレジスト | MicroChem | Y311075 0500L1GL | |
| チタン蒸発ペレット | 国際 Advanced素材 | TI14 | |
| 透明マスク(機能付き) | Outputicity.com | N/A | マスク印刷サービス |
| トリプシンEDTA(0.25%) | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 25200-072 |
参考文献
- Wan, L. Q., Chin, A. S., Worley, K. E., Ray, P. Cell chirality: emergence of asymmetry from cell culture. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 371, 20150413(2016).
- Rahman, T., Zhang, H., Fan, J., Wan, L. Q.
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
再版と許可
タグ
