細胞キラリティーを測定するためのマイクロパターニングアッセイ

サマリー

我々は、マイクロパターニング技術を用いて、 インビトロで多細胞キラリティーを決定するためのプロトコルを提示する。このアッセイは、様々なタイプの細胞の左右バイアスの自動定量を可能にし、スクリーニング目的に使用することができる。

要約

キラリティーは固有の細胞特性であり、細胞の左右軸に沿った偏光の観点から非対称性を描写する。このユニークな特性は、発生と疾患の両方において重要な役割を担っているため、細胞のキラリティーを特徴付けるための標準化された定量化方法が研究と潜在的な用途を前進させるでしょう。このプロトコルでは、細胞のマイクロパターンアレイを利用する多細胞キラリティー特性評価アッセイについて説明します。セルラーマイクロパターンは、チタン/金コーティングされたスライドガラス上にマイクロコンタクト印刷を介して製造されます。幾何学的に定義された(例えば、リング状の)タンパク質コーティングされた島に播種した後、細胞は方向的に移動し、時計回りまたは反時計回りの方向に向かって偏ったアライメントを形成し、カスタム記述のMATLABプログラムによって自動的に分析および定量することができる。ここでは、マイクロパターン基板の作製、細胞播種、画像収集、データ解析について詳細に説明し、NIH/3T3細胞を用いて得られた代表的な結果を示す。このプロトコルは、以前に複数の公表された研究で検証されており、 インビトロで細胞キラリティを研究するための効率的で信頼性の高いツールです。

概要

細胞の左右(LR)非対称性は、細胞利きまたはキラリティーとしても知られており、LR軸における細胞極性を記述し、基本的で保存された生物物理学的特性であると認識されている^1、2、³、^4、5。細胞キラリティーは、インビボおよびインビトロの両方で複数のスケールで観察されている。以前の発見は、円形の島⁶に播種された単一細胞におけるアクチン細胞骨格のキラル旋回、閉じ込められた境界⁷、⁸、⁹、¹⁰、¹¹内の細胞の偏った遊走および整列^、およびニワトリヒートチューブ¹²の非対称ループを明らかにした。

多細胞レベルでは、細胞キラリティーは、指向性遊走または整列、細胞回転、細胞骨格ダイナミクス、および細胞小器官位置決め⁷、⁸、⁹、^10、11、^12、13から決定することができる。我々は、接着細胞⁷、^8、9、10のキラルバイアスを効率的に特徴付けるために^、マイクロパターニングベースの¹⁴アッセイを確立した。リング状のマイクロパターンが細胞集塊を幾何学的に閉じ込めると、細胞は集合的に方向移動と偏った整列を示す。リングの位相コントラスト画像で細胞の位置合わせを自動的に検出して測定するために、MATLABプログラムが開発されました。局所的なセルアライメントの方向は、円周方向からの偏差に応じて、偏った角度で定量化されます。統計解析の結果、セルのリングパターンは反時計回り(CCW)バイアスまたは時計回り(CW)バイアスのいずれかとして指定されます。

このアッセイは、複数の細胞表現型のキラリティーを特徴付けるために使用され(表1)、細胞のLR非対称性は表現型特異的であることが見出されている⁷、^11、15。さらに、アクチンのダイナミクスおよび形態学の破壊は、キラルバイアス^7,8の逆転をもたらし得、酸化ストレスは、同様に細胞キラリティを変化させる可能性がある⁹。手順の単純さとアプローチ⁷、⁸、^9、10の堅牢性のために、この2Dキラリティーアッセイは^、インビトロで多細胞キラリティを決定および研究するための効率的で信頼性の高いツールを提供します。

このプロトコルの目的は、細胞キラリティを特徴付けるためのこの方法の使用を実証することである。このプロトコルは、マイクロコンタクト印刷技術を介してパターン化されたセルラーアレイを作製し、MATLABプログラムを使用して自動化された方法でキラリティ分析を行う方法を記述しています。

プロトコル

ポリジメチルシロキサン(PDMS)切手の作製¹⁶

1. CADソフトを使用して、内径250μm、外径450μmのマイクロスケールリングのアレイを描きます。このプロトコルで使用されるパターンは、リング間の距離が 850 μm の 10 x 10 アレイです。
2. 微細加工会社のマスク印刷サービスを使用して、パターンの透明マスクを所望の解像度で印刷 する(材料表を参照)。
   注:リングの付属寸法は、多くの細胞タイプで動作することが証明されています⁷。
3. 所望の特徴を含むマスクを用いて紫外線(UV)フォトリソグラフィーを行い、ネガ型フォトレジストモールド(SU-8など)⁸を作製する。
   1. ステップ1.1~1.2で作製した透明マスクによりフォトレジストでスピンコートしたシリコンウェーハを覆う。
   2. UVコンタクトアライナー上で、UV光によってマスクの透明領域下でフォトレジストを重合させる。
      注:さらなる洗浄と現像の後、所望の特徴を有するマスターモールドが製造される⁸。操作の詳細は、使用される特定の機器によって異なります。
4. 硬化剤と10:1の比率で混合することによってPDMSエラストマープレポリマーを調製し、次いでその混合物をペトリ皿の型上にキャストする。
5. 皿を真空チャンバーに30分間入れてPDMS中の気泡を除去し、60°Cのオーブンで少なくとも2時間焼く。
6. PDMSを完全に硬化させた後、パターン配列をスタンプにカットします。
   メモ:マイクロコンタクト印刷の後のステップでの取り扱いが容易であるため、厚いスタンプ(約1cm)が好ましい場合があります。

2. スライドガラスのコーティング

1. スライドガラスを清掃します。スライドを100%エタノール浴に浸し、5分間超音波処理してから水ですすいでください。
2. このステップを最初にアセトンで繰り返し、次にイソプロパノールで、続いて窒素気流中で乾燥させた。
3. 電子ビーム(Eビーム)蒸発装置を使用して、スライドガラスにチタンと金の層をコーティングします。
   注:チタン層の場合、所望の厚さは15Å(1Å = 10^〜10m )である。金層の場合、所望の厚さは150Åである。チタン層が金とスライドガラスの間の接着剤として機能するように、最初にチタンをコーティングし、次に金をコーティングする。
4. クリーニングしたスライドを蒸発チャンバーに入れ、シャッターの下に金とチタンのるつぼを挿入します。
5. チャンバーをポンプで下ろして、金属を溶かす前に^10-5 Pa未満の真空を作ります。電子ビームを金属に集束させ、蒸着速度が蒸着厚さの制御に適切になるようにパワーを調整します。
6. シャッターを開けて金属蒸着を開始します。希望の厚さに達したらシャッターを閉じます。
7. るつぼを2つの金属の連続蒸発の間で切り替えます。
8. 装置の必要に応じてるつぼが冷えるのを待ち、チャンバーを通気し、金でコーティングされたガラススライドを取り出します。
9. 機器のメンテナンスのためにチャンバーを再度ポンプダウンします。
   メモ:動作の詳細は、特定のEビーム蒸発器に依存する場合があります。チタンの析出速度を十分に制御し、低くすることが重要です。厚いチタン層は、特に細胞の蛍光イメージングのために、しばしば視認性を低下させる。コーティング後、チタン/金コーティングされたスライドガラスは、室温の乾燥真空チャンバーに少なくとも1ヶ月間保管することができます。

3. マイクロコンタクト印刷

1. 必要に応じて、チタン/金でコーティングされたスライドを細かく切ります。標準的なアプリケーションには、12 mm x 12 mmの正方形を推奨します(図1B)。
2. ガラスカッターを使用して表面を横切ってスライドさせて凹んだトラックを残し、スライドガラスを両側に保持し、凹みで曲げて小さな四分の一に分割します。金でコーティングされた表面に触れないでください。
   メモ: 誤って転倒した場合に、ガラスのどちらの側がコーティング面であるかを視覚的に判断するには、両側の光の反射を比較します。金で覆われた表面はより明るい反射を示すが、コーティングされていない側は(ガラスの反対側のチタン層から)より暗い反射を有する。別の方法は、スライドのエッジを観察することであり、コーティング側は垂直切断面から決定することができる。
3. ペトリ皿に100%エタノールを浸し、オービタルシェーカーで金の側面を上にしてスライドを少なくとも10分間清掃します。エタノールを吸引し、窒素気流で吹き付けて各スライドを乾燥させます。
4. PDMSスタンプを石鹸水と100%エタノールで拭きます。スタンプを窒素ガスで乾燥させます。
5. 5.74mgのC18粉末を10mLの100%エタノールに溶解して2mMオクタデカンチオール(C18)溶液を調製する。
   注:C18溶液を密封し、室温で保存する。C18でパターンを印刷すると、フィブロネクチンと細胞が優先的に付着する接着剤の自己組織化単分子膜が作成されます。
6. PDMSスタンプをC18溶液に浸し、パターン化された表面を下に向けて10秒間、窒素ガスで60秒間穏やかに乾燥させます。
   メモ: 乾燥するときは、ほとんどの液体が蒸発するまで最初にスタンプから流れを離し(約 1 m)、次にゆっくりと流れを近づけてスタンプを完全に乾かします。これは、スタンプ上で乾燥させる代わりにC18溶液が吹き飛ばされるのを防ぐためです。
7. スタンプを金のスライドの上に裏返して60秒間置いてから取り外します。
8. 適切なスタンプを確実にするには、ピンセットをスタンプに軽く叩き込んでパターンを適切に転写します。あまり強く押し下げないでください、そしてピンセットの重量は通常十分です。
   メモ:タッピング中にスタンプの目視検査を行うと、スタンプとスライドガラスが均一に接触していることを確認します。
9. 湿度室を用意する。
   1. 70%エタノール1mLを逆ペトリ皿の蓋にピペットし、表面を覆うようにパラフィルム片を敷く(顔を上に覆う)。
   2. ピンセットを使用して持ち上げ、パラフィルムを敷いて気泡がないようにし、必要に応じて余分なエタノールを除去します。
10. 2 mM HS-(_CH2)11-EG_3-OH(EG3)溶液を調製する:5 μLストック溶液を5 mLの₁₀₀%エタノールで希釈する。
    注:希釈されたEG3溶液は密封して4°Cで保存することができ、希釈されていないEG3ストックは-20°Cで保存する必要があります。 EG3処理は、C18のないガラス領域を細胞に接着しないようにするために使用されます。
11. 各4分の1ガラススライド用のEG3のマイクロピペット40μL液滴を湿度チャンバ内のパラフィルム上に、金スライドの間隔を説明するのに十分な液滴間に残した。
12. ピンセットを使用して、C18 プリントした金色のスライドを液滴の上に裏返して置き、スライドの下に泡が入らないようにします。スライドを持ち上がらずにスライドを静かに押して、蒸発を最小限に抑えます。
    メモ: スライドガラスの一方の端を液滴の近くに置き、スライドガラスのもう一方の端をゆっくりと下ろします。バブルが存在する場合は、バブルがなくなるまでゴールドスライドを持ち上げずに押します。
13. ペトリ皿をパラフィルムでしっかりと密封し、室温で少なくとも3時間放置する。
    注:広範なインキュベーションが必要な場合は、ペトリ皿をダブルシールし、最大24時間放置してください。
14. バイオセーフティキャビネットに、金のスライドをペトリ皿に上向きに置き、70%エタノールに3回浸してすすぎ、EG3を除去し、滅菌のためにエタノール中に10分間放置する。
15. エタノールを吸引し、滅菌PBSと交換する。
16. ステップ3.9で説明したように、エタノールの代わりにPBSで別の湿度チャンバーを準備します。
    注:表面張力の違いにより、最初に4〜5mLのPBSを追加してパラフィルムを敷き詰めて気泡を除去し、過剰を吸引する方が簡単です。
17. 50 μg/mL のフィブロネクチン溶液 (必要に応じて他のタンパク質) を滅菌 PBS およびマイクロピペット 50 μL のフィブロネクチン溶液で調製し、4 分の 1 ごとにパラフィルム上にスライドさせ、液滴間にスペースを残します。
    注:フィブロネクチンコーティングは、パターン化された表面への細胞接着を促進する。
18. ウェーハピンセットを使用してスライドを液滴の上に裏返して配置し、スライドの下に泡がないようにします。スライドを持ち上がらずにスライドを一緒に静かに押します。
    メモ:スライドの取り扱いには、スライドガラスピンセットまたはまっすぐな幅の先端を持つウェーハピンセットをお勧めします。
19. ペトリ皿をバイオセーフティキャビネットに30分間放置する。
20. 30分後、3回すすぎた後、PBSに金のスライドを上向きに置きます。
    注:フィブロネクチンパターンスライドは、PBS中で4°Cで約1ヶ月間保存することができます。

4. マイクロパターンのスライドに細胞を播種する

1. 細胞培養培地およびトリプシンを37°Cの水浴中で温める。
   注: 以下の継代培養の説明は、NIH/3T3 細胞に関するものです。培養条件は、細胞種によって異なり得る。
2. (オプション)パターン化されたスライドを12ウェルプレートの培養培地に浸し、細胞のトリプシン処理の前にインキュベーター内で37°Cまで温め、細胞付着を改善します。
3. 細胞をトリプシン処理し、FBS含有培地で中和し、100 x g で3分間遠心分離し、次いで新鮮な培地とよく混合することによって再懸濁する。
   メモ: セルが互いに完全に解離していることを確認します。
4. 細胞をカウントし、200,000細胞/mLに希釈し、1つの金スライドを含む各ウェルに0.5mLの細胞懸濁液を加える。
5. 均一な細胞播種のためにウェルプレートを数回静かに振盪し、細胞付着を可能にするためにインキュベーターに15分間保管する。
6. 15分後、顕微鏡下で細胞の付着を確認する。必要に応じて、追加の時間を許可します。
   注:付着した細胞は、目に見えるフィロポジウムまたは平坦化で表面に広がり、ウェルプレートを静かに叩いたり動かしたりしても表面から移動しません。
7. 各ウェルから未接着細胞を含む培地を吸引し、1mLの培養培地を加える。薬物治療のために、このステップで培養培地に追加の試薬を補充する。
8. 細胞をインキュベーター内で24時間培養し、コンフルエント性をチェックしてキラリティーが形成されたかどうかを判断する。
   注: ほとんどの細胞タイプでは 75% を超えるコンフルエンシーが推奨され、過剰コンフルエンシーはキラリティー特性評価に影響を与える可能性があります。

5. 画像収集

1. コンフルエント時にセルを固定します。
   1. ウェルプレートから培養培地を取り出し、PBSで1回すすいだ。
   2. 4%パラホルムアルデヒド溶液を加え、室温で15分間インキュベートし、次いでPBSで3回すすいだ。
      注:固定によって細胞形態が大きく変化する場合は、固定前のイメージングをお勧めします。
2. カメラ機能を備えた位相差顕微鏡を使用して、スライド上の各リングを高解像度で画像化します(分析には10倍のオブジェクトレンズで十分です)。

6. 細胞キラリティ特性評価(図2)

1. キラリティ特性評価用の MATLAB コード ファイルを補足ファイル (補足ファイル 1) からダウンロードします。
   メモ: このコードは、Windows システムと macOS システムの両方で MATLAB_R2015b 以降のバージョンで動作するようにテストされています。循環統計ツールボックスは、参照¹⁷ にあるファイルを実行するためにも必要です。
2. コードフォルダとサブフォルダ(循環統計ツールボックスが内部にある)をMATLABパスに追加し、 "ROI_selection.m"ファイルを開きます。4 行目で、ディレクトリを目的のデータフォルダに変更します (ウィンドウユーザーの場合は、4 行目と 5 行目で "/" を "\" に切り替えます)。
3. 14 行目の画像サイズを変更し、最初の 2 つの図形はリングの内側の円のサイズを表し、他の 2 つの図形は外側の円のサイズを表します。
   メモ: 分析するフォルダ内のすべての画像のサイズが同じであることを確認してください。
4. [ 実行 ] ボタンをクリックして MATLAB コード "ROI_selection.m" を実行し、位相差画像の関心領域 (ROI) を決定します。
5. リングに合うように選択範囲の正方形を手動でドラッグし、画像をダブルクリックして選択を確定します。
6. フォルダ内のすべての画像に対してこの手順を繰り返します(前の画像のROI選択を確認した後、次の画像が自動的にポップアップします)。各画像のROI情報を格納するために「.mat」ファイルが生成されます。
7. 「Analysis_batch.m」ファイルを開き、手順6.2と同じフォルダのディレクトリを変更します。(ウィンドウユーザーの場合、初めて使用する場合は、5、6、124、および 130 行目で "/" を "\" に切り替えます)
8. [ 実行 ]ボタンをクリックしてコード「Analysis_batch.m」を実行し、複数のセルラーリングパターンのキラリティを決定します。各リングの循環統計と、時計回り、非キラル、反時計回りのリングの数を含む "datatoexcel.txt" ファイルが生成されます。

結果

NIH/3T3細胞の播種から15分後、リングパターン上の細胞接着を位相差イメージングにより目視で確認した。その後の24時間の培養後、パターン上の細胞はコンフルエントになり、明らかに非対称なアライメントで細長くなり、時計回り方向に偏った(図2)。付着した細胞の指向性遊走は、タイムラプス画像によって記録され、細胞運動性および形態形成は、ビデオのさらなる分析によって定量化され得る。キラリティー解析を行うために、固定後に高解像度位相コントラスト画像を撮影し(図2A-C)、MATLABプログラムに供給します。プログラムは強度勾配を検出し、リング上の対応するセルアライメント方向を計算します。次に細胞キラリティは、環の円周方向から逸脱した細胞位置合わせの円形統計に基づいて決定される。したがって、細胞は時計回り(CW)、反時計回り(CCW)、または非キラル(NC)として指定することができます(図2D)。処理後...

ディスカッション

ここで説明するリング状のパターニングアッセイは、多細胞キラリティの定量的特性評価のための使いやすいツールを提供し、信頼性と再現性の高い結果を生み出すことができます。同一の定義済みマイクロ環境の迅速な生成と偏りのない分析により、大容量サンプルの自動ハイスループット処理が可能になります。このプロトコルでは、リングマイクロパターンの作成、セルパターニング、およびバイアスされたセルアライメントと方向運動の自動分析について説明します。この方法は、細胞の運動性およびキラル形態形成を研究するためのライブイメージング技術と互換性があり、毒性検出⁹ または薬物スクリーニング用途のために他の平面形態に潜在的に統合することができる。

他にも、共有するヒントがいくつかあります。まず、マイクロコンタクト印刷工程では、ガラスの金側にスタンプを作る必要があり(基板を細かく切断した後、区別が難しい場合があります)、二重印刷は避けるべきです。第2に、適切な付着のために他のタンパク質を必要とする細胞について、好ましいタンパク質をステップ3.17で使用することができる。第...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
200プルーフエタノール	Koptec	DSP-MD-43
BZX顕微鏡システム	キーエンス	BZX-600
ダルベッコの修正イーグル培地(DMEM)、高グルコース	ギブコ	11965092
電子ビーム蒸発器	Temscal	BJD-1800	金チタンフィルムコーティング
ウシ胎児血清	VWR	89510-186
ウシ血漿からのフィブロネクチン	シグマ	F1141-5MG
ガラス顕微鏡スライド	VWR	10024-048
ガラスピンセット	エクセルタ	390BSAPI
金蒸発ペレット	インターナショナル・アドバンスド・マテリアル	AU18
HS-(CH2)11-EG3-OH (EG3)	Prochimia	TH 001-m11.n3-0.2
MATLAB	Mathworks	MATLAB_R2020b
NIH/3T3 細胞	ATCC	CRL-1658
OAI コンタクト アライナー	OAI	200	UV フォトリソグラフィー
オクタデカンチオール (C18)	シグマ	O1858-25ML
オービタル シェーカー	VWR	89032-088
リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)	研究製品 国際	P32080-100T
ポリジメチルシロキサン シルガード 184	ダウ コーニング	DC4019862
シリコンウェーハ	大学ウェーハ	ID#809
ピルビン酸ナトリウム	サーモフィッシャー 科学	11360-070
SU-8 3050 フォトレジスト	MicroChem	Y311075 0500L1GL
チタン蒸発ペレット	国際 Advanced素材	TI14
透明マスク(機能付き)	Outputicity.com	N/A	マスク印刷サービス
トリプシンEDTA(0.25%)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	25200-072