方法論記事

自家蛍光法を用いた in vitro での神経幹細胞の活性化状態の分類

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DOI：

10.3791/63110

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2024年4月12日

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1Department of Neuroscience, University of Wisconsin-Madison, 2Morgridge Institute for Research, 3Department of Biomedical Engineering, University of Wisconsin-Madison

この記事について

サマリー

このプロトコルは、i)共焦点顕微鏡、ii)強度イメージングを行うための蛍光活性化セルソーター、またはiii)蛍光寿命イメージングを行うための多光子顕微鏡を使用した自家蛍光イメージングにより、初代成体マウス神経幹細胞培養の細胞状態を同定し、濃縮する戦略を説明しています。

要約

神経幹細胞(NSC)は、成体ニューロン新生と呼ばれるプロセスを通じて、成体脳内で新生児ニューロンを分裂させ、産生します。成体の神経幹細胞は主に静止状態であり、細胞周期(G0)を出た後でも環境に反応したままの可逆的な細胞状態です。成体ニューロン新生の最初のステップでは、静止状態のNSC(qNSC)がシグナルを受けて活性化し、静止状態から抜け出して細胞周期に再入りします。したがって、NSCの静止と静止出口の調節因子を理解することは、成体の神経新生を標的とする将来の戦略にとって重要です。しかし、NSCの静止に関する理解は、静止NSC(qNSC)と活性化されたNSC(aNSC)の識別における技術的な制約によって制限されます。このプロトコルは、NSC自家蛍光をイメージングすることにより、 in vitro 培養で生成されたqNSCおよびaNSCを同定し、濃縮するための新しいアプローチを説明しています。まず、このプロトコルでは、共焦点顕微鏡を使用してqNSCおよびaNSCの自己蛍光マーカーを同定し、自家蛍光強度を使用してNSCの活性化状態を分類する方法について説明します。次に、このプロトコルでは、蛍光活性化セルソーター(FACS)を使用してNSCの活性化状態を分類し、自家蛍光強度を使用してqNSCまたはaNSCのサンプルを濃縮する方法について説明します。第三に、このプロトコルでは、多光子顕微鏡を使用して、単一細胞分解能で蛍光寿命イメージング(FLIM)を実行し、NSC活性化状態を分類し、自家蛍光強度と蛍光寿命の両方を使用して静止出口のダイナミクスを追跡する方法について説明します。したがって、このプロトコルは、NSCの静止および静止出口を研究するための生細胞、ラベルフリー、シングルセル分解能ツールキットを提供します。

概要

神経幹細胞は、多くの生物で生涯を通じて新生児のニューロンを作り出し、これは成体ニューロン新生と呼ばれるプロセスです1,2。新生児のニューロンを産生するには、まずqNSCが活性化し、細胞周期に入って集団を拡大し、神経前駆細胞を産生する必要があります3,4,5,6。NSCの静止については多くのことが知られていますが、NSCの静止のドライバーとレギュレーターを完全に特定する能力は、qNSCとその活性化への移行を分離および同定するために存在する技術的な制限によって制約されています。自家蛍光イメージングは、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(NAD(P)H)やフラビンアデニンジヌクレオチド(FAD)7,8などの自己蛍光代謝補因子の光学特性に影響を与える代謝リモデリングを分離することにより、ミクログリアやT細胞などの多くの異なる細胞タイプの細胞状態の変化を研究することに成功しています。NSCは、静止出口9,10,11,12,13,14を経るにつれて、代謝ネットワークを大幅に再構築します。したがって、これらの違いを利用するために、NSC自家蛍光は、最近、NSCが静止状態を出るときに発生する代謝リモデリングに起因する自家蛍光のシフトを検出することにより、NSC活性化状態を同定し、濃縮するために使用された15。イメージング自家蛍光は、いくつかの技術的な利点を提供します:i)細胞の挙動に影響を与える可能性のある外因性標識の添加を必要としない。ii)NSCの活性化状態に関する高解像度のシングルセルデータを提供できます。iii)セル7,16の破壊を必要としない。このプロトコルは、NSCの静止状態および活性化細胞の状態を研究するためにNSC自家蛍光を利用するための3つの戦略を概説しています15。

最近、海馬の顆粒下ゾーンから6週齢の雄マウスから単離されたNSCを培養し、in vitro 10,13,17,18,19,20,21で可逆的に静止状態にしたところ、400〜600nmで励起し、500〜700nmで発光する点状自家蛍光(PAF)のレベルが上昇していることがわかりました。このシグナルは、活性化されたサイクリングNSC15と比較して、qNSCに特異的でした。追加の抗体マーカーやレポーターを使用せずにこれら2つの集団を視覚的に分離する能力は、qNSCの性質や静止出口に関する多くの実験課題に役立ちます。したがって、まず、このプロトコルでは、共焦点顕微鏡を使用してqNSCのPAFをイメージングする戦略について説明し、これを使用してNSCの活性化状態を同定することができます。次に、このプロトコルでは、蛍光活性化セルソーティング(FACS)を使用してPAFを検出する戦略について説明し、さらに、このシグナルに基づいてqNSCまたはaNSCを濃縮するためのソーティング方法について説明します。これらの戦略は、細胞の状態に基づいて NSC をクラスター化および分離するために使用できる 1 つの尺度を提供します。

NSCを異なる状態だけでなく、静止出口から完全活性化に移行する際にも分離する高分解能の方法を開発するために、多光子顕微鏡を使用して蛍光寿命イメージング(FLIM)を行い、NAD(P)H(Channel 1)自家蛍光と緑色自家蛍光(Channel 2)の寿命とその強度を画像化しました。このアプローチは、細胞内の分子の光学特性がそれらの物理的特性に依存しているという事実を利用しています16,22。例えば、NAD(P)(NADとNADPは光学的に区別できないため、NAD(P)は両方の種を指すために使用される)は、酸化状態では自家蛍光性ではなく、還元状態では自家蛍光性である(NAD(P)H)23。さらに、自己蛍光分子のさらなる物理的特性、例えば、それらの酵素への結合状態は、蛍光寿命イメージング7,22,24を行うことによって推定することができる。例えば、NAD(P)Hは、酵素22に結合していないとき、蛍光寿命が短くなる。NAD(P)Hのような自己蛍光分子は、何百もの代謝反応に関与しており、細胞の状態や行動によって進行が異なるため、これらのシフトは、自家蛍光寿命を検出する多光子顕微鏡を用いて検出し、定量することができる23。自家蛍光の存在量または強度とともに、これらの測定値は、NSCを一方の細胞状態または他の細胞状態に分離し、状態間の動的遷移を通じて多次元の情報を提供します。第三に、このプロトコルでは、多光子顕微鏡を使用して、チャネル1(NAD(P)H)およびチャネル2(PAF)信号のFLIMおよび強度測定を実行、分析、および解釈する方法について説明します。要約すると、このプロトコルは、NSC状態に関する高分解能のシングルセルデータを提供する、NSC静止を研究するための生細胞のラベルフリーツールキットを示しています。

プロトコル

このプロトコルのすべての手順は、ウィスコンシン大学マディソン校の動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されています。

1. 共焦点顕微鏡を使用してqNSCおよびaNSCのPAFを画像化し、NSC細胞の状態を同定する

  1. 初代NSC培養物から in vitro でqNSCおよびaNSCを作製します。
    1. 増殖培地中の成体マウス脳から精製した培養神経幹細胞(表1)18,20,21.したがって、デフォルトでは、in vitro NSC培養物はaNSCです。
    2. qNSCを生成するには、以下のプロトコルを使用してaNSCをコーティングされたガラス器具にプレートし、次にqNSC培地で処理して3日間にわたって静止を誘導します。
    3. まず、皿の底を覆うのに十分なポリ-L-オルニチン(プラスチックの場合は10 mg/mL、ガラスの場合は水50 mg/mL)溶液(1 cm2 イメージングキュベットウェルの場合は~150 μLを使用)をddH2Oで37 °Cで1時間コーティングすることにより、NSCを接着するための油浸対物レンズに適した屈折率のガラス器具を調製します。
    4. PLO溶液を取り出し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で3回洗浄します。
    5. 皿の底を覆うのに十分なラミニン溶液(5 mg/mL)をPBSでコーティングし(1 cm2 イメージングキュベットウェルの場合は~150 μLを使用)、最低3時間、37°Cで、または一晩インキュベートします。
    6. ラミニン溶液を取り出し、皿の底を覆うのに十分な培地を加えます(1 cm2 イメージングキュベットウェルの場合、~150 μLを使用します)。
    7. aNSC(単層またはニューロスフェアとして開始可能)を120 x g で室温(RT、~25°C)で4分間遠心分離することにより、トリプシン化用の細胞を調製します。
    8. 前のステップでペレット化したaNSCを100 μLのトリプシン混合物で37°Cで5分間トリプシン化し、次に200 μLのトリプシン阻害剤混合物でトリプシン化をクエンチします(表1)。
    9. NSCを2分間放置した後、ピペッティングを10回上下させて機械的に回転させます。
    10. 5 mLのaNSC培地を添加し、細胞を120 x g で4分間遠心します。
    11. NSCを1 mLのaNSC培地に再懸濁し、aNSC培地で細胞を10%〜20%のコンフルエンスでプレート化します。例えば、~5,000個の細胞を1 cm2 イメージングキュベットウェルの1ウェルに150 μL培地でプレート化します。
    12. aNSCがディッシュの表面に付着するまで24時間待った後、aNSC培地を取り出し、ディッシュの底を覆うのに十分なqNSC培地と交換します(1 cm2イメージングキュベットウェルの場合、~150 μL;表1-前に説明したように、10,13,17,18)静止が誘導される井戸で。
    13. aNSCとqNSCの媒体は、少なくとも2日ごとに交換してください。qNSC培地で3日後、NSCは静止状態になり、イメージング実験に使用できます。
  2. 共焦点顕微鏡を使用して、 in vitroでライブqNSCおよびaNSCをイメージングします。
    注:各顕微鏡には独自のソフトウェアがあります。したがって、これらの手順に従って、特定の顕微鏡を構成するための類似のアクションを実行します。このプロトコルは、NIS-Elements での作業手順を提供します。
    1. 共焦点顕微鏡を自家蛍光イメージング用に構成します。
      1. [405 Laser] をクリックし、[405 Laser] メニュー内の [Emission Window] に入力します。TDをクリックして透過光画像を収集し、HV値を設定してサンプルを視覚化します。
      2. レーザー出力を3.5%に、ゲインを75に設定します。[ズーム] を 2 に設定します。共焦点スキャンパラメータを設定し、ピクセルドウェルを0.5に設定し、解像度を2048 x 2048ピクセルに設定します。
    2. ~60倍の油浸対物レンズの下で細胞に焦点を合わせ、明視野を使用して焦点を合わせます。
    3. [アイポート]をクリックして共焦点スキャンモードに切り替え、光路がスキャンヘッドに向いていること、および光路にフィルターキューブがないことを確認します。
    4. PAFはqNSCに富んでおり、広く興奮性および放出性があります( 図1を参照)。 図1 をガイドとして使用して、システムの機能に基づいて最適な光学構成を選択します。最も強力でクリーンな信号を得るには、~400-500 nmのレーザーで励起し、~580-620 nmを収集し、~60倍の油浸対物レンズを使用します。
      注:自家蛍光イメージングでは、一般的なイメージング実験に必要なレーザー出力よりも高いレーザー出力を励起する必要があります。PAFと一緒に他の自己蛍光分子や他の標識をイメージングする場合は、自家蛍光チャネルへのブリードスルーを避けるために光学構成を慎重に設計してください。
    5. qNSCおよびaNSCの自家蛍光の画像を取得します。[ スキャン] をクリックし、画像にフォーカスを合わせて、[ キャプチャ] をクリックします。最良の画像を得るには、細胞の細胞質(細胞全体に拡散して広がる淡調な自家蛍光に基づく)に焦点をあてた単一平面画像を収集し、各細胞の代表的な断面を取得します。
    6. 異なる画像を直接比較する場合は、同じ光学構成(例:同じレーザー出力)と画像サンプルを同じ日に使用します。
    7. レーザーと検出器の正確な出力は、各特定のシステムによって異なります。まず、低レーザー出力を使用し、次に信号が飽和せずに検出可能になるまでゆっくりと出力を上げます。
  3. in vitroで生のqNSCおよびaNSCのPAFを解析します。
    1. qNSCまたはaNSCで自家蛍光画像を取得した後、ImageJ25でファイルを開いて画像を定量化します。
    2. qNSC/aNSC自家蛍光の画像に対して、 プロセス>フィルターフィルター>ガウスぼかし (シグマ:2)オプションを使用して、不均一なピクセルを滑らかにします。
    3. 「Image > Adjust > Threshold」を使用して、PAFを表すピクセルを選択し(背景ピクセルを除去)、「Apply」をクリックします。直接比較されるすべての画像に同じしきい値パラメータを使用します。
    4. Process > Binary > Watershed を使用して、空間的に近接した PIF を分離します。
    5. コンピューターのマウスを使用して、明視野画像を見るか、細胞の細胞質全体に均一に存在する拡散自家蛍光を調べることによって決定されたように、細胞の周囲に関心領域(ROI)を描画します。
      注:一般的には、細い末梢プロセスを除外し、核を含めることは問題ありません。なぜなら、これらの場所には自家蛍光が通常存在せず、したがって分析を中断することはありません。
    6. Analyze(解析)>Analyze(粒子を解析)を使用します(サイズ:0.1-infinity μm;真円度:0-1)で、summarizeがチェックされています。
      注:ImageJは、関心領域内の粒子に関するデータを含む出力ウィンドウを生成し、各セルのPAFの数を集計できます。他の蛍光分子は、イメージングPAFと組み合わせることができます。ただし、PAFは比較的暗いシグナルであるため、他の蛍光色素がPAFチャネルにブリードしないことを検証することが重要です。通常、600+ nmを吸収し、650+ nmを放出する蛍光色素は、LipidSpot 610などのイメージングPAFと組み合わせることができます。

2. FACSを用いた自家蛍光に基づく培養神経幹細胞のNSC活性化状態の濃縮

  1. セクション 1 の説明に従って、qNSC と aNSC を生成します。
  2. 生の qNSC と aNSC の混合物を自家蛍光に基づいて選別します。
    注:例として、このプロトコルでは、qNSCとaNSCを1:1の比率で混合して生成されたサンプル中のaNSCまたはqNSCを濃縮する方法について説明します。
    1. トリプシン処理および細胞選別に先立ち、10 μM 5-ethynyl-2'-deoxyuridine(EdU;細胞周期のS期など、DNAを合成する細胞に組み込むチミジン類似体)を細胞培養培地に1時間添加して、S期を進行する細胞を標識します。
    2. ステップ 1.1.8 で説明したように qNSC および aNSC をトリプシン化し、0.5 mL の FACS バッファー(表 1)に再懸濁してから、氷上に置きます。
      注:qNSCはディッシュに強く付着します。比較的高いコンフルエンスでは、qNSCはディッシュから機械的に解離することができます。ただし、qNSCが比較的低いコンフルエンスにある場合、またはピペッティングによって機械的にディッシュから除去するのが難しい場合は、トリプシンを使用してディッシュからqNSCを除去します。
      1. qNSCから培地を取り出し、皿の底を覆うのに十分な0.25%トリプシンを加え(1 cm2 イメージングキュベットウェルの場合、~150 μLを使用)、37 °Cで3分間インキュベートします。
      2. インキュベーション後、添加したトリプシンの量に等しい各細胞タイプに対応する培地を添加することにより、トリプシン反応をクエンチします。細胞を回収および遠心分離する前に、細胞を皿から機械的に解離します。
    3. ~130 μm のノズルを使用して、フローサイトメーターまたは FACS で qNSC と aNSC を解析し、装置の能力に基づく光学条件で PAF を検出します ( 図 1 を参照)。たとえば、405 nmレーザーを使用してサンプルを励起し、検出には580-620 nmフィルターを使用します。
    4. データ ファイルに少なくとも 10,000 個のシングレット qNSC と aNSC を収集し、これらを使用してゲートを設計し、qNSC または aNSC のエンリッチメントを収集します。例えば、aNSC:qNSC(1:1)混合サンプルの自家蛍光強度に基づいて、NSCの上位25%または下位25%を収集するようにゲートを設定します。
    5. 上記のように、より明るいまたはより暗い自家蛍光でシングレットを選別するようにゲートを設定した後、細胞をaNSC培地(10,000細胞/cm2、ステップ1.1.3を参照)で満たされたPLOラミニンコーティングウェルに選別します。
    6. FACSに続いて、NSCをインキュベーター内で3時間放置します。皿の底を覆うのに十分な4%パラホルムアルデヒドで細胞を固定します(1 cm2 イメージングキュベットウェルの場合、~150 μLを使用)RTで15分間。
      注:細胞内のEdUを可視化するには、EdUを検出するための市販のキットを入手し、メーカーが推奨するプロトコルに従うのが最も簡単です。
    7. まず、0.25% トリトンを PBS 中で RT で 15 分間処理することにより、細胞を透過化します。
    8. 次に、細胞をEdU染色溶液でRTで30分間処理します。
      注:EdU染色溶液の正確な組成は、試薬の供給源によって異なりますが、大まかには、反応バッファー、反応バッファー添加剤、硫酸銅、およびアルキンまたはアジド修飾分子で構成されています。推奨キットについては、 材料の表 を参照してください。
    9. EdUを可視化するための染色後、サンプルをPBSで10分間3回洗浄します。

3. 多光子顕微鏡を用いてChannel 1およびChannel 2の自家蛍光を検出し、 in vitro でNSCに対してFLIMを行い、NSCの細胞状態集団と遷移を同定する

注:各顕微鏡には独自のソフトウェアがあります。したがって、これらの手順に従って、特定の顕微鏡を構成するための類似のアクションを実行します。このプロトコルでは、Prairie Viewでの作業手順について説明します。

  1. セクション 1 の説明に従って、qNSC と aNSC を生成します。
  2. 蛍光寿命イメージング用の多光子顕微鏡をセットアップします。
    1. 対物レンズは倍率40倍以上(~1.15NA)のものを使用してください。
    2. 多光子顕微鏡は、チューナブル超高速レーザー、720 nmのロングパスダイクロイック、ガリウムヒ素リン(GaAsP)光電子増倍管(PMT)、時間相関のある単一光子計数電子機器、およびアナログパワーメーターまたは同等のコンポーネントとともに使用します。
    3. チャンネル1のイメージングには、チューナブルレーザーを750 nmに設定し、440/80 nmの蛍光フィルターキューブを使用します。イメージングチャネル2では、レーザーを890 nmに設定し、550/100 nmの発光フィルターキューブを使用します。
      注意: PMTをオンにする前に、部屋の照明を消してください。
  3. インストゥルメントレスポンス機能
    1. 測定された崩壊における機器の時間応答を説明するために、粉砕された尿素結晶をイメージングすることにより、機器の応答関数(IRF)をキャプチャします。
      注:IRFは崩壊と畳み込まれて、減衰フィット曲線を正確に計算します。取得には、レーザーを890nmに設定し、440/80nmの蛍光フィルターキューブを使用します。GaAsP PMTは800のゲインに設定され、ポッケルス(レーザー出力)は最初は非常に低く設定され、通常は1に設定されています。
    2. 結晶性尿素を含む視野を選択し、ポッケルをわずかに増やします(最大15まで)。
    3. 次に、細胞イメージングに使用されるのと同じパラメータ(定数分数弁別器(CFD)1 x 104 - 1 x 105、解像度256 x 256、滞留時間を4.8 μs、光学ズームを1.5倍に設定、積分時間を60秒に設定して、画像を取得します。
  4. in vitroでの生qNSCおよびaNSCに対するChannel 1およびChannel 2自家蛍光の蛍光寿命イメージングおよび強度イメージングの実施
    1. 画像化する視野を見つける:接眼レンズを使用して適切な視野を見つけ、顕微鏡上のサンプルへの光路を変更してイメージングを可能にします。
      注:最初にチャンネル1の画像が取得され、次に同じ視野のチャンネル2の画像が取得されます。
    2. チャンネル 1 画像収集のセットアップ: [Power/Gain ] タブをクリックして PMT のゲインを 800 に設定し、[ 2-P Laser ] タブをクリックしてレーザーに 750 nm を選択し、適切なフィルター キューブ (440/80 nm) が使用されていることを確認します。
    3. チャンネル 1 の画像を収集します。
      1. プレビューモードを開始するには、[パワー/ゲイン]タブに移動してポッケルを30に設定し、その画面の[スキャン]セクションに移動して[ライブスキャン]をクリックします。
      2. ポッケルスを大きくすると、低レーザー出力 (3.6 mW 未満) で良好な視野が得られます。視野が見つかったら、ポッケルスを調整して、ポッケル セルの後の電力をパワー メーターが ~3.6 mW と表示し、[カウント レート] タブの Constant fraction discriminator (CFD) が 1 x 104 - 1 x 105 になるようにします。
    4. 「スキャン」セクションに移動し、これらのパラメータが満たされたら「シングルスキャン」をクリックします。これにより、60 秒を超えるチャネル 1 イメージが取得されます。
    5. チャンネル2の画像を収集するには、 2-Pレーザー タブをクリックしてレーザーに 890 nm を選択し、フィルターキューブをチャンネル2の発光キューブ(550/100 nm)に交換します。
    6. 3.4.3の説明に従ってプレビューモードを開始し、パワーメーターが~7 mWを示し、CFDカウントが再び1 x 104 -1 x 105になるまでポッケルスを増やします。
    7. [スキャン]セクションに移動し、これらのパラメーターが満たされたら[シングルスキャン]をクリックします。これにより、60 秒を超えるチャネル 2 イメージが取得されます。
    8. さらに画像を取得する - チャネル 1 とチャネル 2 の画像を取得した後、新しい視野を見つけて、手順 3.4.2 から 3.4.4 を繰り返します。通常、実験の1つの条件には、4〜6個の視野を収集して~50〜100個の細胞を画像化するだけで十分です。
      注:mCherryは、チャンネル1およびチャンネル2チャンネルにブリードスルーすることなく、追加の蛍光標識として使用できます。
  5. 蛍光寿命画像を解析します。
    1. SPCImageで蛍光寿命画像の減衰行列をSPCImageで生成するには、手順3.5.2-3.1.14を実行します。
      注:詳細については、オンラインで無料で入手できる最新のハンドブックを参照してください26。
    2. SPCImageを開き、セクション3.3で収集したIRF FLIMイメージを開きます。
    3. ヒストグラムの縦の黒いバーを調整して、IRF 減衰曲線に制限されるようにします。上部のメニューバーから、[ IRF]>[クリップボードにコピー]をクリックします。
    4. セクション3.4で取得した、分析するデータセット内のFLIM画像ファイルを開きます。
    5. 上部のメニューバーから、[ IRF]>[クリップボードから貼り付け]をクリックします。
    6. ソフトウェアの右下で、 コンポーネント を 2 に設定します。
    7. ソフトウェアのトップメニューバーで、[オプション]>[モデル]をクリックします。次に、[フィット方法] で [MLE] を選択し、[空間ビン分割] を [Square] に、[しきい値] を [Peak] に選択し、[設定] で [Multiexponential Decay] を選択します。
    8. ソフトウェアの左下で、励起直後の光子数のピークで代表的な細胞質ピクセルの光子数が少なくとも100になるまで Bin を増やします。
    9. ソフトウェアの左下で、 しきい値を設定します。チャネル 1 には、しきい値 "50" を使用します。チャネル 2 には、しきい値 "0" を使用します。
    10. ソフトウェアの上部メニューバー(このプロトコルはバージョン8.3の操作方法を説明しています)で、[ Calculate > Decay Matrix]をクリックします。
      注: 画像全体で Chi2 値が ~0.8-1.2 であることを確認してください。これにより、双指数減衰モデリングを検証することで、データが堅牢であることが確認されます。
    11. 上部のメニューバーで、[ ファイル]>[保存]をクリックします。
    12. ソフトウェアのトップメニューバーで、[ ファイル]>[エクスポート]をクリックし、以下をエクスポートします。
      色分けされた値、T1、T2、Chi2、ピクセル強度、A1[%]、A2[%]、色分けされた画像(凡例付き)
      注:これで、SPCImageはバッチ処理を行い、特定のチャネルのすべての画像を分析するように設定されました(チャネル1のFLIM画像をまとめて分析し、チャネル2のFLIM画像に対して手順3.5.2から繰り返します)。
    13. バッチ処理を実行するには、[ >バッチ処理の計算 ]をクリックし、処理するFLIM画像を選択します。
    14. 上部のメニューバーで、 File > Export > Batch Export をクリックし、エクスポートする減衰マトリックスを選択します(前の手順で生成)。
    15. CellProfilerを使用して、3.5.16-3.5.24の手順に従って細胞質マスクを作成します。
      注:これを行うには、核はチャネル1強度画像の周囲に手動で配置され、核は黒くはっきりと見えます。次に、CellProfiler パイプライン manual_segmentation.cpproj27 (補足ファイル 1) は、核マスクの指示に従って、全細胞および細胞質マスクを自動的に生成します。また、核をmCherryで標識し、Channel 1およびChannel 2の自家蛍光と一緒にイメージングすることで、核の同定を自動化することができます。しかし、従来の多くの核色素は、自家蛍光チャネルにスペクトル的にブリードするため、この手法には適合しません。
    16. R Studio で、 R_ASCtoTIFF.rmd27 (補足ファイル 2) を使用して X_photons.asc ファイルを変換します (X は、チャネル 1 イメージ セットから取得したイメージの名前を TIF ファイルに変換します)。
    17. Cell Profiler を開き、 manual_segmentation.cpproj を開きます。
    18. パイプラインの上部にある イメージ ステップで、ステップ 3.5.16 で作成したチャネル 1 フォトン TIF をロードします。
    19. 「SaveImages」というタイトルのパイプラインの一番下の 3 つのステップで、CellProfiler が生成するマスクの保存パスを設定します。
    20. CellProfilerの左下にある Start Test Mode をクリックします。
    21. CellProfilerの左下にある Run をクリックします。CellProfiler が IdentifyObjectsManually ステップに到達すると、処理中の現在の Channel 1 画像を表示するウィンドウが表示されます。
    22. キーボードの F キーをクリックし、マウスの左クリックボタンを押しながら、1つの細胞の核のトレースを手動で描画します。原子核をトレースした後、マウスの左クリックボタンを離します。画像内のすべてのセルに対してこの手順を繰り返します。
    23. ポップアップウィンドウの右下にある強度画像のある [完了 ]をクリックします。これで、ソフトウェアはパイプラインを完了し、細胞質、核、および全細胞マスクをエクスポートします。
    24. 左下の[ Next Image Set ]をクリックし、すべてのチャンネル1TIF画像に対して手順3.5.21〜3.5.23を繰り返します。
    25. R スクリプト (Integrate decay matrix and cellplasmic masks.rmd) を使用して、ステップ 3.5.2-3.5.14 で生成された崩壊マトリックスとステップ 3.5.15-3.5.24 で生成された細胞質マスクを統合し、ステップ 3.5.26-3.5.30 に従って各細胞の細胞質の平均蛍光寿命イメージング変数を取得します。
    26. スプレッドシート(Microsoft Excelなど)を使用して、 test_key27 [Supplementary File 3]というタイトルの3列の.csvドキュメントを作成します。
    27. 列に「フォルダ」、「NADH」、および「FAD」というタイトルを付けます。表に「フォルダの場所」をリストし、次に「NADH」と「FAD」にそれぞれイメージタイトルの接頭辞を入力して、各チャネル 1 イメージを各チャネル 2 イメージにリンクします (データ例 - 表 2 を参照)。
  6. R Studioで、 Integrate decay matrices and cellplasmic masks.rmd27(Supplementary File 4)を開きます。
    1. スクリプトで注釈が付けられているとおりに、作業ディレクトリの設定、チャネル 1 ファイルの場所、FAD ファイルの場所、マスク ファイルの場所、出力ファイルの場所と名前を設定します。
    2. スクリプト全体を実行します。スクリプトが正常に完了すると、メタデータと平均 FLIM 変数を含む出力ファイルが生成されます。
    3. 自家蛍光FLIM data.rmd27(補足ファイル5)またはその他の解析ソフトウェアを使用して解析してください。

結果

NSC細胞の状態を分離するための共焦点自家蛍光イメージング(図1)
共焦点顕微鏡法を使用してNSCの活性化状態を解明するために、qNSCおよびaNSCは、前述のように、活性化培地または静止培地のいずれかを使用してin vitroで作製しました10,13,17,18。NSC中のPAFを検出するために、生きたqNSCとaNSCを共焦点顕微鏡(例:405 nm、Em:580-620 nm)で同じ露光を使用して画像化しました。qNSCは、aNSCと比較してPAFの数が多かった(図1A、B)。この知見は、自家蛍光特性をマーカーとして使用して、qNSCおよびaNSCの細胞状態を同定する方法を示しています。

自家蛍光を用いたNSC細胞状態のFACS濃縮(図2)
FACSを使用して細胞周期状態を濃縮するために、qNSCおよびaNSCを、このプロトコルに記載されているようにin vitro 10,13,17,18,19で生成し、トリプシン化およびフローサイトメーターでの分析の前に1時間EdUで予め標識して、S期を進行する細胞を標識しました。次に、qNSCとaNSCをフローサイトメトリーにより別々に、または1 qNSC:1 aNSCの比率で混合して分析しました(図2


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ディスカッション

このプロトコルは、NSCの自己蛍光シグナルのイメージングを通じてin vitroでNSC細胞状態を分類することを可能にする、生細胞、ラベルフリー、非破壊、単一細胞分解能技術を説明しています。このアプローチは、NAD(P)Hなどの代謝補因子の光学特性に影響を与えるNSCの静止出口中に発生する代謝シフトを検出し、NSCの静止を研究するための既存の技術よりも多くの利点を提供します。例えば、EdUのような細胞周期マーカーによる標識など、qNSCやaNSCを研究するための多くの従来の手法では、サンプルの固定が必要です。現在存在する方法で生きた神経幹細胞を研究する方法は、通常は蛍光タンパク質をコードする導入遺伝子を作製することにより、外因性標識の導入を必要とするため、さらに制限されます。これらのツールは、それらを生成するために必要なリソースと多くの技術的な警告の両方で制限されています。例えば、中間フィラメントタンパク質nestinおよびGlial Fibrillary Acidic Protein(GFAP)は、qNSCおよびaNSCのマーカーとして一般的に使用されています12,13,18,28,29。しかし、ネスチンとGFAPは、qNSCとaNSCの間で差次的に発現することが知られている12,13,18,28,29。さらに、自家蛍光イメージングは、高解像度のシングルセルデータを提供し、細胞集団のバルク解析で最終的に得られる実験で失われたり、解釈が複雑になったりしたシングルセルの不均一性を解明することができます。

ただし、自家蛍光イメージングにはいくつかの制限もあります。自己蛍光シグナルの多くは、細胞を固定すると失われます。したがって、自家蛍光イメージングは、主に生細胞の研究に限定されています。自家蛍光イメージングは、外因的に導入された蛍光色素が存在しないことにも依存しており、これは自家蛍光チャネルに出血する可能性があります。多くの蛍光色素は、特定の状況で自家蛍光イメージングと互換性がありますが、自家蛍光イメージングを多くの既存のツールと組み合わせることが常に可能であるとは限りません。また、生細胞イメージングは光毒性を誘発することもあります。このプロトコルを使用したイメージングの 1 回の反復では、NSC の生存率を低下させるのに十分な光毒性は誘発されません。しかし、1日に何度も、より頻繁な間隔で経時的に細胞を繰り返しイメージングすると、重大な光毒性が生じる可能性があるため、NSCの静止を研究するための有効な戦略ではありません。最後に、自家蛍光イメージングは、海馬または側脳室のいずれかから6週齢の雄マウスのNSCを研究するために使用できますが、この手法が他の供給源、年齢、または他の幹細胞タイプのNSCを研究するためにどの程度広く使用できるかは不明です。

ここで説明するプロトコルは、以前に確立されたプロトコル10、13、17、18、19を使用して、in vitroでqNSCおよびaNSCを正確に生産することも前提としています。このプロトコルの結果を再現することが困難な場合は、前述のように、qNSCおよびaNSCのさまざまなマーカーの有無を調べることにより、qNSCおよびaNSCが適切に生成されていることを確認してください10,13,17,18,19。まとめると、自家蛍光イメージングは、qNSCおよびaNSCを同定し、NSCの静止出口を研究するための新しい技術的アプローチを提供します。

開示事項

著者は、競合する利益を宣言しません。

謝辞

UWマディソンフローサイトメトリーコア(P30 CA014520および1S10RR025483-01)、Moore研究室およびUWマディソンコミュニティのメンバーのご意見に感謝いたします。NIH T32 T32GM008688(C.S.M.へ)、Diana Jacobs Kalman Fellowship from AFAR(C.S.M.へ)、Wisconsin Graduate Fellowship(C.S.M.へ)、DP2 NIH New Innovator Award(1DP2OD025783、D.L.M.へ)、Vallee Scholar Award(D.L.M.へ)、NIH 1R56NS130450(D.L.M.およびM.C.S.へ)、 R01 CA185747(M.C.S.へ)、R01 CA205101(M.C.S.へ)、R01 CA211082(M.C.S.へ)、および全米科学財団助成金番号CBET-1642287(MCSへ)。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
40倍 水対物レンズニコンMRD77410パート3の多光子顕微鏡で使用される対物レンズ
8ウェルキュベットIbidi80826-90aNSCs/qNSCsのイメージング用
アナログパワーメーターThorlabsPM100Aパート3の多光子顕微鏡で使用
抗生物質-抗真菌剤 (100X) (PSF)サーモフィッシャー15240062NSC培地用抗生物質
B-27Invitrogen17504044NSC培地用栄養補助食品
BMP4Fisher Scientific5020BP010静止誘導因子
ウシ血清アルブミンΣA4919-25GBMP4
カメレオン超短パルスレーザーCoherentN/Aレーザー パート3 共焦点顕微鏡
で多光子顕微鏡に使用パート 1
DMEM/F-12 (GlutaMAX なし)Invitrogen11320033NSC 用ベース培地
DNAseSigmaD5025-15KUトリプシン阻害剤
EdU アッセイキットInvitrogenC10337細胞培養用増殖アッセイ
EGFPeproTechAF-100-15-500UGNSC 培地用成長因子
FGFPeproTech100-18BNSC培地用成長因子
蛍光活性化セルソーターBDFACSAriaPart 2に使用される蛍光活性化セルソーター
パリンSigmaH3149-50KUNSC培地用添加剤
L-15Invitrogen21083027トリプシン阻害剤溶液調製用
ラミニンシグマL2020-1MGコーティング用
ガラス製品 ニコン TiE 倒立顕微鏡ニコンN/Aマイクロスコープフレーム パート3に使用
PLOSigmaP3655-100MGコーティング用ガラス製品
SPC-150 単一光子計数エレクトロニクスベッカーとヒックル N/Aパート3の多光子顕微鏡に使用
トリプシン(球体または単層として成長していたaNSCのペレットをトリプシン化するため)Gibco15090046ニューロスフェアまたは付着性 aNSC のトリプシン化
トリプシン (qNSC のトリプシン化用)Gibco25200072付着性 qNSC トリプ
シン阻害剤SigmaT6522-100MGトリプシン化を阻害するため
SigmaU5128-5G
VerseneThermo Fisherの収集に使用15040066トリプシンの調製用
に使用した Nikon C2 顕微鏡に追加 ヘ用 aNSC 尿素結晶の IRF

参考文献

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