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方法論記事

大腸菌およびその他の細菌からの細胞外小胞のスケーラブルな単離および精製(英語)

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DOI:

10.3791/63155

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2021年10月13日

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1Department of Cardiovascular & Metabolic Sciences, Lerner Research Institute, Cleveland Clinic, 2University Hospitals Cleveland Medical Center, 3Case Western Reserve University, 4Center for Microbiome & Human Health, Cleveland Clinic, 5Electron Microscopy Core, Lerner Research Institute, Cleveland Clinic

この記事について

サマリー

細菌は、生理活性のある生体分子を運ぶナノメートルサイズの細胞外小胞(EV)を分泌します。EVの研究は、それらの生合成、微生物-微生物および宿主-微生物の相互作用および疾患における役割、ならびにそれらの潜在的な治療用途を理解することに焦点を当てています。EV研究の標準化を促進するために、さまざまな細菌からEVをスケーラブルに分離するためのワークフローが提示されます。

要約

多様な細菌種は、脂質、タンパク質、核酸、糖鎖、および親細胞に由来する他の分子からなる細胞外小胞(EV)を~20~300nm分泌します。EVは、種内および種間のコミュニケーションベクトルとして機能すると同時に、感染とコロニー形成の文脈における細菌と宿主生物の間の相互作用にも貢献します。健康と病気におけるEVに起因する多数の機能を考えると、 in vitro および in vivo 研究のためにEVを分離することへの関心が高まっています。物理的特性、すなわちサイズに基づいてEVを分離することで、多様な細菌培養物からの小胞の分離が容易になるという仮説が立てられました。

単離ワークフローは、細菌培養物からEVを単離するための遠心分離、ろ過、限外ろ過、およびサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)で構成されています。ポンプ駆動のタンジェンシャルフローろ過(TFF)ステップが組み込まれ、スケーラビリティが向上し、数リットルの開始細胞培養から材料を分離できるようになりました。大腸 菌 をモデル系として、EV関連ナノルシフェラーゼおよび非EV関連mCherryをレポータータンパク質として発現させた。ナノルシフェラーゼは、そのN末端をサイトリシンAと融合させることによってEVを標的としました。関連するサイトライシンA-nanoLucを有する20〜100 nm EVを含む初期のクロマトグラフィー画分は、遊離タンパク質を含む後の画分とは異なっていました。EV関連ナノルシフェラーゼの存在は、免疫金標識および透過型電子顕微鏡によって確認された。このEV分離ワークフローは、他のヒト腸関連グラム陰性菌種およびグラム陽性菌種に適用できます。結論として、遠心分離、ろ過、限外ろ過/ TFF、およびSECを組み合わせることで、多様な細菌種からEVをスケーラブルに分離できます。標準化された分離ワークフローを採用することで、種を超えた微生物EVの比較研究が容易になります。

概要

細胞外小胞(EV)は、脂質、タンパク質、糖鎖、核酸で構成されるナノメートルサイズのリポソーム様構造であり、原核細胞と真核細胞の両方から分泌されます1。グラム陰性菌2からのEVの放出を視覚化する初期の研究以来、細菌のEVに起因する生物学的機能の数(直径20〜300 nm)は過去数十年で絶えず増加しています。それらの機能には、抗生物質耐性の転移3、バイオフィルム形成4、クオラムセンシング5、および毒素送達6が含まれます。また、細菌性EVを治療薬として使用すること、特にワクチン学7 とがん治療8への関心も高まっています。

EV研究への関心が高まっているにもかかわらず、隔離方法に関する技術的な課題がまだあります。具体的には、再現性があり、スケーラブルで、多様なEV産生生物に適合する分離法が求められています。EVの分離と研究方法を計画および報告するための統一された一連の原則を作成するために、国際細胞外小胞学会はMISEVポジションペーパー9を発行および更新します。さらに、EV-TRACKコンソーシアムは、透明性を高めるために、公開された原稿で使用されているEV分離の詳細な方法論を報告するためのオープンプラットフォームを提供します10。

このプロトコルでは、哺乳類細胞培養物からのEVの単離に使用された以前の方法論が、細菌細胞培養物からのEVの単離を可能にするために適応されました11,12。私たちは、スケーラブルなさまざまな微生物からEVを分離し、EVの純度と収量のバランスをとる方法を採用することを目指しました(MISEVポジションペーパー9で説明されています)。遠心分離とろ過によって細菌の細胞や破片を除去した後、培養液は遠心装置限外ろ過(最大~100 mLの容量の場合)またはポンプ駆動のTFF(大容量の場合)のいずれかによって濃縮されます。その後、EVは、小型EVの精製に最適化されたカラムを使用してSECによって分離されます。

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図1:細菌EV分離ワークフローの概略図。 略語:EV =細胞外小胞;TFF =タンジェンシャルフローろ過;SEC = サイズ排除クロマトグラフィー;MWCO =分子量カットオフ。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Escherichia coliのマウス共生株(すなわち、大腸菌MP113)をモデル生物として使用し、以前に報告されているように、細胞ライシンAへの融合によってEV関連ナノルシフェラーゼを発現するように改変した14。ここで使用される方法は、少なくとも最大数リットルの細菌培養を処理し、EV関連タンパク質と非EV関連タンパク質を効果的に分離することができる。最後に、この方法は、他のグラム陽性菌種およびグラム陰性菌種にも使用することができる。報告された実験のすべての関連データは、EV-TRACKナレッジベース(EV-TRACK ID:EV210211)10に提出されました。

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プロトコル

注:細菌と組換えDNAを含むすべての作業が、各株のバイオセーフティハザードレベルに適したバイオセーフティ封じ込めのベストプラクティスに従っていることを確認してください。作業は、地域、国内、および国際的なバイオセーフティ規制に従って行う必要があります。

1. 菌株と培養条件

注:この研究で使用された細菌株は、大腸菌MP113、アッカーマンシア・ムシノフィラ、バクテロイデス・テタイオタオミクロン、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、およびビフィドバクテリウム・デンチウムでした。

  1. 大腸菌の場合、滅菌ループを使用して単一コロニーを250〜1,000 mLのLuria-Bertani(LB)ブロスに接種し、振とうインキュベーター内で300 rpmおよび37°Cで48時間インキュベートしてから培養を処理します。p114-mCherry-Clyluc(補足方法および補足図S1)を保持する組換え大腸菌MP1株の場合、クロラムフェニコールをLB寒天培地およびブロスに最終濃度17 μg/mLで添加します。
  2. A.ムシノフィラ、B.セタイオタオミクロン、B.ブレーブ、およびB.デンチウムの場合、脳心臓注入(BHI)寒天プレートにストリークし、ビニール嫌気チャンバー内で嫌気的にインキュベートします。単一コロニーを100 mLの予め還元したBHIブロスに接種し、嫌気的に48時間インキュベートします。

2. EVアイソレーション

  1. 遠心分離とろ過による細菌培養培地の清澄化
    1. ステップ1で接種した菌体培養物を、注ぎ込んで250 mLまたは500 mLのポリプロピレン製遠心分離機ボトルに移します。大容量の固定角度ローターでボトルを4°C、5,000 × g で15分間遠心分離します。上清を慎重に注いで洗浄した遠心分離機ボトルに移し、再び10,000 × g で15分間遠心分離します。
      注意: バイオセーフティー適切な洗浄と除染の後、ボトルを再利用してください。
      1. 2回目の遠心分離後に細菌細胞の大きなペレットが存在する場合は、清潔なボトルで遠心分離を繰り返して細胞をさらに除去します。
    2. 上清を注いで適切なサイズの0.22 μmポリエーテルスルホン真空駆動フィルター装置に移します。ろ過装置を真空壁供給に接続してろ過します。ろ過速度が大幅に低下した場合は、ろ過されていない材料を新しいデバイスに移動するだけです。ろ過した培地を4°Cで一晩保存し、必要に応じて翌日もプロトコルを継続します。
      注:上記の遠心分離では、通常、各デバイスを介して、示された量の~2倍の細胞培養を処理できます。例えば、1台の500 mLフィルター装置で、~1,000 mLの遠心分離前の培養物をろ過できます。通常、これらのデバイスは再利用されません。このステップでシリンジフィルターを使用することは、テストされたモデルで大きな損失が認められたため、最適化なしでは推奨されません。これは潜在的な停止点です。
    3. この時点で、ろ過した上清のアリコートを適切な寒天プレートに広げて生細胞が完全に除去されていることを確認し、細菌株に最適な条件でインキュベーションした後にコロニーがないことを確認します。細菌が検出された場合は、追加の遠心分離および/またはろ過を実行して、上記の手順をさらに最適化します。
  2. ろ過媒体の濃度
    1. 100 mL >容量で作業する場合は、手順 2.2.2 に進みます。 ~100 mLの容量で作業する場合は、血清学的ピペットを使用して、ろ過した培養液90 mLをそれぞれの容量100 kDa分子量カットオフ(MWCO)遠心限外ろ過装置のリザーバーにロードします。常に一致する限外ろ過装置とバランスを取り、上部のリザーバー内の培地の体積が<0.5 mLに濃縮されるまで、4°Cおよび2,000 × g のスイングバケットローターで15〜30分間隔で遠心分離します。
      1. 残りのろ過された培養培地をリザーバーに補充します。「補充」する場合は、デバイスの下部にあるフロースルーを取り外し、デバイスのバランスを取り直します。
        注:これらのデバイスを使用して濃縮できるろ過された培養液の最大容量は、推奨容量の<2倍であることが観察されました。
      2. リザーバー内の濃縮培地の粘度が目に見えて上昇した場合(暗くて粘性のある物質)、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で希釈し、遠心分離によって再濃縮して、MWCOの100 kDa未満の非EVタンパク質を希釈します。
        注: これは潜在的な停止点です。
      3. 濃縮培地を低タンパク質結合チューブに移し、4°Cで一晩保存し、必要に応じて翌日もプロトコールを継続します。
    2. 100 mL>容量を扱う場合は、処理する容量に合わせて適切なサイズのTFFデバイス(100 kDa MWCO)を選択してください。
      注:100mLから>1,000mLを処理するためのろ過装置は市販されています。現地での入手可能性、コスト、ポンプおよびチューブ/接続との互換性によって、どの特定のモデルが最も役立つかが決まります。フィルターを洗浄する前に、 材料表 に示されているデバイスで最大2 Lの培地を処理しました(洗浄プロトコルについては、以下のステップ2.3を参照してください)。
      1. 補足図S16に示すように、#8低結合/低浸出チューブ、1/8インチのホースバーブからルアーアダプター、TFFデバイス、および蠕動ポンプを使用してろ過回路を組み立てます。
        注意: バイオセーフティキャビネット内でTFFを実行して、EVの準備を環境細菌で汚染するリスクを最小限に抑えます。
      2. 室温で、ろ過および調整された培地を約200 mL /分(最小100 mL /分)で循環し始めます。200 mLのPBSをメス容器にポンプで送り、目的の流量に対応する適切なRPMを決定します。ろ過された馴化培地を循環させる場合、限外ろ過膜を通過する分子<100 kDaを別の容器に廃棄物として収集します。
        注:以下の例は、2 Lの培養の開始量を想定しています。
      3. その容量が~100-200mLに減少するまで、馴化培地を循環させ続けます。必要に応じて小型船に移動します。PBSで2倍に希釈し、ポンプで循環を続け、75〜100 mLまで濃縮します。PBSで2倍に希釈し、最終容量25 mLまで循環させ続けます。PBSで2倍に希釈し、<10mLまで循環を続けます。
      4. フィードチューブをサンプルリザーバーから持ち上げ、ポンプを続けてフィルターをパージし、最大量のサンプルを回収します。
        注: これは潜在的な停止点です。
      5. 濃縮したサンプルをコニカルチューブに移し、必要に応じて4°Cで一晩保存します。または、プロトコルを続行します。
      6. 濃縮サンプルを容量15 mLの100 kDa MWCO遠心限外ろ過装置に移します。上部リザーバー内の培地の体積が<2 mLに濃縮されるまで、4°Cおよび2,000 × g のスイングバケットローターで15〜30分間隔で遠心分離します。
        注: これは潜在的な停止点です。
      7. 濃縮培地を低タンパク質結合チューブに移し、4°Cで一晩保存し、必要に応じて翌日プロトコールを継続します。
  3. TFF デバイスのクリーニング (オプション)
    注意: TFFデバイスがプロセス中に「詰まり」始めると、ろ過速度が低下します(ファウリング)。必要に応じて、フィルター装置を洗浄して、同じ精製ランで追加のサンプルのろ過を容易にすることができます。理論的には可能ですが、相互汚染を避けるために、洗浄されたTFFフィルターは別の精製実行には使用されていません。
    1. 清掃するには、TFFデバイスからすべてのチューブとキャップを取り外し、残っている液体をすべて排出します。
    2. 蠕動ポンプとチューブを使用して、TFFデバイスの内側と外側の両方のコンパートメントを( つまり、材料の表にリストされているモデルの平行ポートと垂直ポートを介して)、~100 mLの蒸留水でフラッディングします。すべてのチューブ/キャップを取り外し、TFFデバイスを排水します。
    3. 外側(垂直、ろ液)ポートにキャップをし、250 mLの20%エタノールを蒸留水に>200 mL / minで内側のコンパートメントから10分間循環させます。排水し、蒸留水で溢れさせ、上記のように再び排水します。
    4. 250 mLの0.5 Nの新鮮なNaOH溶液を内部コンパートメントに30分間循環させ、再度排水します。
    5. 補足図S2のように、すべてのチューブとキャップを入口、出口、およびろ液ポートに再接続し、1 mL / cm 2のNaOH>1 mL / cm2の体積がフィルター膜を透過し、ろ液/廃棄物として収集されるまで、0.5 N NaOH溶液を再度循環させます。
    6. 上記のようにTFFデバイスを蒸留水ですすいでください。TFFデバイスをすぐに使用するか、~100 mLの20%エタノールをデバイスにフラッディングし、4°Cで一晩保存します。
      注意: エタノールで保管する場合は、必ず排水し、水ですすぎ、排水し、> mL/ cm 2 のフィルター表面積の容量がフィルター膜を透過し、ろ液/廃棄物として収集されるまで、デバイスを通して250 mLのPBSを循環させ、サンプル処理の前に残留エタノールを除去してください。
  4. サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)
    注:SECは、EVの純度を高め、非小胞タンパク質を除去するために使用されます。
    1. <100 mL の出発物質から EV を単離するには小さな SEC カラム(10 mL 床容量)、>100 mL の出発物質から EV を単離するには大きなカラム(47 mL のベッド容量)を使用します。
      注: 次の例では、大きい列のボリュームがリストされ、小さい列のボリュームが括弧内に一覧表示されます。
    2. SECカラムとPBSを数時間かけて室温に戻します。標準のラボスタンドとホルダーを使用して、SECカラムを垂直位置に安定させます。あるいは、市販のクロマトグラフィーカラムスタンドを使用してください。
    3. SECカラムに接続する前に、5 mLのPBSをフリットを通って廃棄物容器に流して、サンプルリザーバーを水和します。SECカラムのインレットキャップを外し、サンプルリザーバーに2 mLのPBSを加え、PBSがフリットから滴り落ちるので、リザーバーをカラムに慎重に接続します(小さなSECカラムには適用されません)。
      メモ: この前の手順により、気泡が SEC 列の上部に閉じ込められるのを防ぎます。空気が閉じ込められている場合は、リザーバーを取り外し、カラムをタップして気泡を取り除き、接続手順を繰り返します。小さいカラムの場合は、SECカラムの上部のキャップを外し、サンプルホッパーを取り付けるだけです。
    4. 47 mL(10 mL)のPBSをサンプルリザーバーに加え、SECカラムの下部のキャップを外します。ロードされたすべてのサンプルバッファーを平衡化のためにカラムに流します。フロースルーを破棄します。
    5. 最大2 mL(0.5 mL)のサンプルをサンプルリザーバーにロードし、フロースルーを破棄して、サンプルがカラムに完全に入るようにします。
    6. すぐにPBSをサンプルリザーバーまたはホッパーに14.25 mLからサンプル容量を引いた容量(小カラムの場合は3 mLからサンプル容量を引いたもの)で追加します。溶液がカラムを流れるのを待ち、カラムのボイド体積に等しいこの量を廃棄します。
      注:通常の2 mLサンプルの場合、サンプルリザーバーまたはホッパーに追加するPBSの量は12.25 mLになります。
    7. 2 mL 低結合マイクロチューブを SEC カラムのすぐ下に配置します。すぐに2 mL(0.5 mL)のPBSをサンプルリザーバーに加え、カラムに入れます。この最初の2 mL(0.5 mL)のフロースルーを フラクション1としてラベル付けします。サンプルリザーバーに一度に2 mL(0.5 mL)を追加し続け、後続の各フラクションを収集します。
      注:ほとんどの細菌性EVは最初の5つの画分で溶出します。最適化中に、最初の12個のフラクションが収集されました。
    8. フラクションは、短期保存(日)の場合は4°C、長期保存の場合は-80°Cで保存します。
    9. 再利用可能なSECカラムの洗浄と保管
      注:このプロトコルで説明されているSECカラムは、製造元に応じて最大5回再利用できます。SECカラムの流速が<5回の使用後に減少した場合、メーカーは、SECの前に凝集物を除去するために、濃縮サンプルを10,000 x gで10分間遠心分離することを推奨しています。次に、この遠心分離の上清をSECカラムにロードしてEVを分離します。
      1. 使用するたびにSECカラムを洗浄して保管するには、0.5 M NaOHを2 mL(0.5 mL)加え、カラムに完全に浸します。100 mL(20 mL)の20%エタノールをカラムに通し、次の使用まで4°Cで保存します。次の使用の前に、上記のようにエタノールを室温に平衡化し、さらに150 mL(30 mL)のPBSをカラムに通してPBSバッファーと交換します。
      2. SECカラムを洗浄し、使用するたびにすぐに再利用するには、2 mL(0.5 mL)の0.5 M NaOHを加え、カラムに完全に浸します。約150 mL(30 mL)のPBSバッファーを実行して、NaOHを洗い流します。溶出液のpHがPBS(~7)に等しい場合、新しいサンプルをロードすることができます。

3. EV準備の品質管理

  1. 無菌試験
    注:これらのEVは細菌培養物に由来するため、下流で使用する前に無菌性を確保することが重要です。
    1. アッセイに使用する画分を100 μL(20 μL)取得し、ソース細菌の増殖に使用する培地3 mLを接種します。それぞれの最適条件下で少なくとも3日間培養し、濁度を観察します。あるいは、生産細菌を増殖させ、コロニー形成を探すために使用される培地を含む寒天プレートに画分サンプルを適用します。
      注意: 細菌汚染が検出された場合、実験にEV製剤を使用することはお勧めしません。代わりに、(a)コンディショニングされた細菌細胞培養培地の十分な遠心分離/ろ過を行い、(b)清潔なボトル、チューブ、フィルター、クロマトグラフィーカラムを使用し、(c)適切な無菌技術を採用することにより、細菌汚染のリスクを最小限に抑えるように注意しながら、分離を繰り返します。
  2. タンパク質定量
    注:高感度の蛍光ベースのタンパク質定量キットを使用しました( 材料の表を参照)。このキットは、485/590nmの励起/発光波長で対応する独自の蛍光計で動作します。
    1. すべての試薬、標準物質、およびサンプルを室温に戻します。
    2. アッセイするサンプルおよび標準物質ごとに1 μLの試薬を199 μLのバッファーに加えることにより、タンパク質試薬とバッファーのマスターミックスを調製します。薄肉の0.5 mL PCRチューブを使用して、10 μLのスタンダード + 190 μLのマスターミックスを各標準チューブに加えます。
      注:アッセイの範囲内にあるように、各サンプルチューブに添加される各画分の量は、精製の予想されるタンパク質収率に依存します。典型的には、各画分5μL+マスターミックス195μLを使用した。サンプル+マスターミックスの最終容量は200μLでなければなりません。
    3. アッセイチューブをボルテックスし、暗所で室温で少なくとも15分間インキュベートします。
    4. 適切な独自の蛍光計( 材料の表を参照)で標準を測定するには、矢印ボタンを使用して タンパク質アッセイ オプションを選択し、 GO ボタンを押して確認します。画面の指示に従って、各標準チューブを挿入し、 GOを押します。
    5. 実験用サンプルチューブを挿入します。 GO を押して読み取ります。表示された結果(アッセイバッファー/サンプル混合物中の実際のタンパク質濃度)に注意してください。サンプル中のタンパク質濃度を取得するには、矢印キーを使用してサンプル 濃度の計算 オプションを選択し、 GOを押して、矢印キーを使用して、特定のサンプルのアッセイバッファーに追加する サンプル量 を選択します。 GO を押して、サンプルタンパク質濃度を記録します。分析するサンプルごとにこの手順を繰り返します。
  3. 粒子計数とサイズ分布
    注:マイクロフルイディクス抵抗パルスセンシング(MRPS)を使用して、EVの濃度とサイズ分布を定量化しました。
    1. 0.02 μmシリンジフィルターでろ過した1%Tween-20を添加したPBSでサンプルを約0.1 μg/mLのタンパク質濃度に希釈します。
      注:希釈の目標は、EV含有画分で1010 粒子/ mLの範囲で予想される粒子濃度に到達することです。最適な希釈は経験的に決定する必要があるかもしれません。後のフラクション(フラクション6以降)にはEVがほとんど期待されていません。したがって、粒子濃度は、低希釈で分析しても<10 10 粒子/ mLになる可能性があります。
    2. 各サンプル3 μLをマイクロピペットで使い捨てマイクロフルイディクスカートリッジに入れ、カートリッジをMRPS装置に挿入し、青色に照らされたリムの金属ボタンを押します。
    3. 取得ソフトウェアの [Go!] をクリックし、サンプルが装置によって分析されるのを待ちます。1,000〜10,000の粒子イベントを取得して、分析の技術的な統計誤差を最小限に抑えます。この時点で、[ 実行の停止 と 終了 ] をクリックして、サンプルの取得を完了します。
      注:生データファイルとともに、機器はサンプル中の粒子濃度をリストした要約スプレッドシートを出力します。サンプル希釈に応じてこの値を修正してください。
    4. 分析ソフトウェアを使用して、生データをロードし、サイズ分布のカスタマイズされたグラフを生成します。

4. EVストレージ

  1. 個々の画分またはプールされた画分を、低タンパク質結合チューブ内の個々の画分サイズの25〜50%(使用するカラムのサイズによって異なります)に分注し、凍結融解サイクルを回避するために-80°Cで保存します。
    注:異なるアプリケーションでは、各実験で使用される予想される量に応じて、より小さなまたはより大きなアリコートが必要になる場合があります。これは経験的に決定する必要があります。EV非含有画分は、研究目的に該当しない場合は廃棄することができます。

5. 透過型電子顕微鏡

  1. ネガティブ染色
    1. 5 μLのEVサンプルを炭素被覆銅400メッシュグリッドに加え、室温で10分間インキュベートします。試料側を5滴の5 mM Tris緩衝液(pH 7.1)で洗浄し、次に5滴の蒸留水で洗浄します。
    2. 標本側を5滴の2%酢酸ウラニルで染色します。ろ紙で余分な汚れを拭き取り、グリッドを数時間または一晩完全に乾かします。80 kVで操作した電子顕微鏡で試料を可視化します。
  2. イムノゴールドラベリング
    1. 10 μLのEV懸濁液をホルムバー/カーボン400メッシュグリッドに塗布し、室温で1時間インキュベートします。PBSでグリッドを3回洗浄し、4%パラホルムアルデヒドを10分間塗布してサンプルを固定します。グリッドをPBSで5回洗浄します。
    2. 0.1%ウシ血清アルブミン(BSA)を含むPBSを3回洗浄してグリッドをブロックします。次に、10 μLの一次抗体を室温で40分間塗布します(ここでは、1 μg/mLのnluc抗体)。0.1%BSAを含むPBSで再度3回洗浄します。
    3. 10 μLの二次金標識抗体をグリッドに加え、室温で40分間インキュベートします。グリッドをPBSで3回洗浄します。
      注:ここでは、ブロッキングバッファーで1:10に希釈した後、10 nmの金ナノ粒子を結合させたヤギ抗マウス抗体を使用しました。金標識によってEVの可視化が不明瞭になる場合は、代わりに、より小さな金ナノ粒子(5 nmなど)の二次抗体を使用できます。
    4. グリッドを10 μLの2.5%グルタルアルデヒドで室温で10分間ポストフィックスします。PBSで3回洗ってください。2%酢酸ウラニル(10 μL)で15分間陰性染色を行います。サンプルを10 μLの0.5%酢酸ウラニルおよび0.13%メチルセルロース溶液に10分間埋め込みます。
    5. 電子顕微鏡でイメージングする前に、サンプルグリッドを室温で一晩乾燥させます。
    6. 顕微鏡取得ソフトウェアで、画像の最適な品質(たとえば、この特定のセットアップでは0.80851秒)を取得するために経験的に露出を決定し、 この値を露光時間 オプションボックスに入力して調整します。 80 kV オプションを選択し、[ 取り込みを開始] をクリックして画像をキャプチャします。

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結果

どのSECクロマトグラフィー画分がEV用に濃縮されているかを評価するために、SECカラムにTFFによって1,000倍濃縮された2 mLの 大腸菌 MP1馴化培養液をロードし、順次画分を収集しました。MRPSを使用すると、フラクション1〜6に最も多くのEVが含まれていることがわかりました(図2A)。その後の画分にはEVがほとんど含まれておらず、EVフリーのタンパク質の代わりに含まれていました(図2B)。EVは主に直径<100nmでした(図2C)。TEMは、特にフラクション2〜6でEV濃縮とサイズを確認しました(図2D)。

この方法がEVを非EV関連タンパク質から分離できることをさらに確実にするために、細胞ライシンA-ナノルシフェラーゼ融合タンパク質および遊離(非融合)mCherryを発現する 大腸菌 MP1...

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ディスカッション

上記のプロトコルでは、スケーラブルで、さまざまなグラム陰性/陽性および好気性/嫌気性細菌からEVを確実に分離する方法が説明されています。手順全体を通していくつかの潜在的な停止点がありますが、馴化細菌培養培地からEVを分離するのに48時間以上かかることは避けることをお勧めします。

まず、細菌を培養して馴化細菌培養培地を生成することからなる。培養時間を少なくとも48時間に増やし、最適な増殖培地を使用すると、EV収量を最大化するのに役立つことがわかりました。各細菌種は、これら2つのパラメータに関して最適化する必要がある可能性があります。細菌培養の量は、目的の用途に十分なEVを確実に分離するためにも重要です。インビ トロ 試験では、EVは通常、最低100 mLから単離されますが、 インビボ 試験では、EVは通常、>1 Lの培地から単離されます。ここでも、各細菌株のEV生産特性とダウンストリームアッセイに必要なEV量によって、最小開始培養量が決まります。

コンディショニングされた培地が利用可能になった...

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開示事項

著者は宣言する利益相反はありません。

謝辞

上記の研究は、NIH TL1 TR002549-03トレーニング助成金によってサポートされました。粒子サイズ分析装置へのアクセスを容易にしてくれたジョンC.ティルトン博士とザカリートロイヤー博士(ケースウエスタンリザーブ大学)に感謝します。Lew Brown(スペクトラダイン)は、粒度分布データの分析に関する技術支援を提供します。コーネル大学のデビッド・パットナム博士は、pClyA-GFPプラスミド14を提供しました。ペンシルベニア大学のマーク・グーリアン博士は、 大腸菌 MP113を提供してくれました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.5 mL フラットキャップ、薄肉 PCR チューブThermo Scientific3430で正確な測定値を得るには、薄肉 PCR チューブを使用することが重要です
電子顕微鏡科学15700
250 mL ファイバーライトポリプロピレン遠心分離ボトルThermoFisher010-1495
500 mL ファイバーライトポリプロピレン遠心分離機ボトルThermoFisher010-1493
65 mm ポリプロピレン丸底/円錐形ボトルアダプターベックマン・コールター392077ビバセルをローター
<>エムに適合させることができます Akkermansia mucinophilaATCCBAA-835
Amicon-15 (100 kDa MWCO)MilliporeSigmaUFC910024
Avanti J-20XPI遠心分離機ベックマン・コールターベックマンから販売終了。アバンティJ-26XPは、最も近い現代モデルです。
Bacteroides thetaiotaomicron VPI 5482ATCC29148
Bifidobacterium breveNCIMBB8807
Bifidobacterium dentiumATCC27678
ブレインハートインフュージョン(BHI)ブロスHimediaM2101オートクレーブ後、BHIブロスと寒天の両方を嫌気性チャンバーに導入し、メナジオン(1 µg / L)、ヘマチン(1.2 µg / L)、およびL-システイン塩酸塩(0.05%)。次いで、嫌気性細菌株を接種する前に、嫌気性条件下で少なくとも24時間インキュベー
C-300 マイクロ流体カートリッジSpectradyne
ChloramphenicolMP BiomedicalsICN19032105
電子顕微鏡FEI 社Tecnai G2 SpiritBT
em>Escherichia coli HST08 (Steller competent cells)Takara636763
Escherichia coli MP1Dr. Mark Goulian (gift)マウス腸由来の共生細菌
Fiberlite 500 mL to 250 mL アダプターThermoFisher010-0151-05Fiberliteローターと併用して、250 mLボトルを小型の細菌培養開始に使用
Fiberlite固定角遠心分離機ローターThermoFisherF12-6x500-LEXは500 mLボトル6本に適合
Formvar Carbon Film 400 Mesh, CopperElectron Microscopescopy sciencesFCF-400-CU
グルタルアルデヒド(EMグレード、10%水溶液)電子顕微鏡科学16100
ヘマチンChemCruz207729Bストック溶液は0.2 M L-ヒスチジン溶液で作られました  1.2 mg/mL
Infinite M Nano+ Microplate readerTecanこの等価物は、mCherry蛍光
In-Fusion HD Cloning PlusTakara638909PCRフラッジメントのPCRライン化ベクターへのクローニング用
JS-5.3 AllSpin Swinging-Bucket RotorBeckman Coulter368690
Lauria Bertani (LB) broth, MillerDifco244620
L-Cysteine HydrochlorideJ.T. Baker2071-05秤量し、嫌気性バイオビクス内のオートクレーブ滅菌BHI培地に直接添加する必要があります。チャンバー
Masterflex フィッティング、ポリプロピレン、ストレート、メス ルアー - ホース バーブ アダプター、1/8" ID; 25/PKコールパーマー -ろ過チューブ回路用HV-30800-08
Masterflex フィッティング、ポリプロピレン、ストレート、オス ルアー - ホース バーブ アダプター、1/8" 内径; 25/PKコールパーマー - ろ過チューブ回路
用特殊 HV-30800-24 接続アダプターMasterflex L/S アナログ可変速コンソールドライブ、20 〜 600 rpmMasterflexHV-07555-00
Masterflex L/S 精密チューブ用イージーロードヘッド、4ローラー、PARA ハウジング、SS ローターMasterflexEW-07514-10
Masterflex L/S 精密ポンプチューブ、PharmaPure、L/S 16; 25 フィートコールパーマーEW-06435-16低結合/低浸出チューブ
メナディオン (ビタミン K3)MP102259ストック溶液は、エタノールで1 mg / mL
MIDIKROS 41.5CM 100K MPES 0.5MM FLL X FLL 1 / PKRepligenD04-E100-05-N大腸菌培養上清
Nano-GloルシフェラーゼアッセイシステムPromegaN1110このアッセイキットは、nlucレポータータンパク質
NanoLuc(Nluc)ルシフェラーゼ抗体の発光を測定するために使用されました。 クローン965808R&D SystemsMAB10026
nCS1 マイクロ流体抵抗パルス検出装置Spectradyne
nCS1 Viewer径分布用スペクトル
OneTaq 2x マスターミックスと標準バッファーNEBM0482DNA ポリメラーゼマスターミックス コロニーチェックのためのルーチン PCR 反応を行うために使用
Protein LoBind, 2.0 mL, PCRクリーンチューブEppendorf30108450
Q5 High-Fidelity 2x Master MixNEBM0492DNA ポリメラーゼマスターミックス
qEV オリジナル 35 nmIzon最大ローディングボリューム 0.5 mL
qEV ラックIzon
qEV-2、35 nmIzon2 mL
Qubit 蛍光光度計ThermoFisherアイテムは販売終了しました。最も近い利用可能な製品は、Qubit 4.0 Fluorometer (cat.いいえ。Q33238)
Qubitタンパク質アッセイキットThermoFisherQ33211室温で保存してください。標準は4°Cで保存されます。
Sorvall Lynx 4000 遠心分離機ThermoFisher75006580
SpectraMax i3x マイクロプレートリーダー分子デバイスこの装置は、ナノルシフェラーゼ生物発光の測定に使用されました
Stericup Quick-release-GP 滅菌真空ろ過システム (150、250、または 500 mL)ミリポアシグマS2GPU01RE
S2GPU02RE
S2GPU05RE		1つまたは複数のフィルターを使用して、作業ボリュームに対応できます。私たちの経験では、製品サイズに記載されているボリュームの2倍をフィルタリングできます。
酢酸ウラニル電子顕微鏡科学22400
ビニール嫌気性チャンバーCoy Lab
Vivacell 100, 100,000 MWCO PESザルトリウスVC1042
Whatman Anotop 10 Plus シリンジ フィルター (0.02 ミクロン)MilliporeSigmaWHA68093002MRPS 希釈剤をろ過します
Qubit 16% パラホルムアルデヒド(ホルムアルデヒド)水溶液トした。<可能 特殊 接続アダプター TFFデバイスとして作られました 私たちは 粒子分析ソフトウェアの最大負荷量

参考文献

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