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方法論記事

元ウテロ マウス胚の採虫前から高度器官形成までの培養

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DOI:

10.3791/63160

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2021年10月19日

 , 
1Department of Molecular Genetics, Weizmann Institute of Science

この記事について

サマリー

全胚培養のための強化されたプラットフォームは、着床後マウス胚の連続的かつ堅牢な 子宮外 発生を、胃支前段階から高度な器官形成まで、最大6日間可能にする。このプロトコルでは、静的プレートと回転ボトルシステムを使用して胚培養を成功させるための標準的な手順を詳述しています。

要約

着床後哺乳動物胚培養方法は、一般に非効率的であり、子宮から解剖した後の短い期間に限定されてきた。プラットフォームは最近、卵筒段階から高度な器官形成までのマウス胚の非常に堅牢で長期の 子宮外 培養のために開発されました。これらのプラットフォームは、後肢形成段階(E11)までの胃骨前胚(E5.5)の適切かつ忠実な発達を可能にする。後期胃胚(E7.5)は、これらの設定で回転ボトルで増殖するが、胃形成前段階(E5.5またはE6.5)からの拡張培養は、静的および回転ボトル培養の組み合わせを必要とする。さらに、O2 およびCO2 濃度、ガス圧、グルコースレベル、および特定の 子宮外 培養培地の使用の敏感な調節は、適切な胚発生にとって重要である。ここでは、拡張 された子宮外 マウス胚培養のための詳細なステップバイステップのプロトコールが提供される。正常なマウス胚を胃胞形成から器官形成まで 子宮外で 成長させる能力は、胚発生中の異なる実験的摂動の影響を特徴付けるための貴重なツールを表す。

概要

哺乳類胚の子宮内発育は、着床後発達の初期段階の研究を制限している1,2。発達中の胚にアクセスできないことは、動物の身体計画の確立、生殖層の仕様、または組織および器官の形成など、胚が子宮に移植された後に起こる重要な発生プロセスの理解を妨げる。さらに、早期移植後胚のサイズが非常に小さいため、E103の前に子宮内での生体内イメージングによる観察が困難になる。これらの段階で生きている胚を観察して操作することができないため、早期着床後胚発生の研究は発生中のスナップショットに限定されています。

着床前哺乳動物胚の体外培養のためのプロトコルは、十分に確立されており、信頼性が高く、定期的に利用されています4。それにもかかわらず、適切な哺乳動物の着床後胚成長をサポートできる元子宮培養システムを確立しようとする試みは、限られた成功にとどまった5。1世紀以上にわたり、主に従来の静的プレート6,7,8または回転ボトル(ローラー培養)5,9,10で胚を培養することによって、様々な培養技術が提案されている。これらのプラットフォームは、正常な胚生存には非常に非効率的であり、短期間に限定されているにもかかわらず、移植後の哺乳類の発達に関する知識を広げるのに有用であることが証明されました11,12。胚は、培養開始後24〜48時間で発生遅延および形態学的異常を示し始めた。

この研究は、着床後発達の最大6日間にわたって、胃形成前から高度な器官形成段階までの継続的な発達を可能にする 元子宮 胚培養システムを設定するための詳細な説明を提供する13。この論文では、E7.5胚(神経プレートおよびヘッドフォールドステージ)から後肢形成段階(〜E11)までの成長をサポートする改良されたローラー培養プロトコルと、静的プレートおよびローラー培養プラットフォーム上での培養を組み合わせることによってE5.5 / E6.5からの拡張培養について説明する。

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プロトコル

すべての動物実験は、ワイツマン科学研究所の動物保護ガイドラインに従って実施され、関連するワイツマン研究所IACUC(#01390120-1、01330120-2、33520117-2)によって承認されました。健康な妊婦は、ランバム医療センターヘルシンキ委員会(#RMB-0452-15)によって承認されたように、臍帯から血液を採取するためにインフォームドコンセントを与えるよう求められました。健康な成人は、ワイツマン科学研究所ヘルシンキ委員会(#1566-3)のガイドラインに従って血液を採取することにインフォームドコンセントを求められました。

1. メディアの準備

  1. フェノールレッドおよびL-グルタミンを含まないダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)500mL、10%ウシ胎児血清、5mLのペニシリン/ストレプトマイシンを添加し、0.22μmフィルターを用いてフィルター滅菌して解剖培地を調製する。
    注:解剖媒体を4°Cで最大1ヶ月間保管してください。
  2. 25%の胚性培地に50%のラット血清と25%のヒト臍帯血血清(HCS)またはヒト成人血清(HBS)を加えたものを使用して、生体フード内で毎日 新鮮な子宮 胚培養培地(EUCM)を調製する。
  3. 胚性培地を調製するには、フェノールレッドおよびL-グルタミンを含まない500mLのDMEMに5mLのグルタミン、5mLのHEPES、および5mLのペニシリン/ストレプトマイシンを加える。10〜15mLのアリコートを調製し、4°Cで最大2ヶ月間保存する。
    注:汚染が発生した場合は、抗生物質濃度を2倍にしてください。
  4. ラット血清を56°Cで30〜45分間熱失活させ、0.22μmのポリビニリデンジフルオライドフィルターでろ過する。不活化の同じ日に培養のために血清を使用してください。HCSまたはHBSを解凍し、すぐに実験に使用してください。
    注:市販のラット血清は一貫した結果を提供する(少なくとも4ロットが明らかな変動なしに試験された)。あるいは、前述のように高品質のラット血清を社内で入手することもできます8,14。HCSが利用できない場合は、社内で収集したHBSと交換してください。ラット血清、HCS、およびHBSは、一度再凍結し、別の日に使用するために-20°Cに保持することができる。再凍結血清を解凍し、解凍したての血清のより大きな量と組み合わせ、それを再凍結しないでください。

2. ヒト臍帯血血清及びヒト成人血清の採取

  1. HCSを単離するには、予定された帝王切開出産の日に健康な妊婦から臍帯血を採取する。
    1. 臍帯から5〜7cmの臍帯を二重にクランプし、乳児の出産直後にクランプ間をトランセクトする。
    2. 胎盤が その場で 残っている間、大口径の14G針と50mLシリンジを使用して臍静脈から直接血液を手動で採取し、溶血の痕跡を避けます。
      注:乳児が手術の分野から取り除かれた後に血液を採取し、臨床検査のために臍帯血が採取されています。
  2. 採取した血液を5mLの凝固促進剤滅菌試験管に分注し、直ちに4°Cに15分間移して完全な凝固を可能にする。凝固した試験管を2,500× g で4°Cで10分間遠心分離する。
  3. 溶血の兆候を示すチューブ(ピンク - レッド血清)を捨てる。5 mL ピペットを使用して血清 (黄色) を収集し、0.22 μm フィルターでろ過します。血清を直ちに56°Cの水浴中で45分間加熱不活化する。
  4. 不活化血清の1〜1.5mLアリコートを調製し、それらを-80°Cで最大6ヶ月間保存する。必要に応じて、ドライアイスを使用して -70 °C で出荷します。
  5. 成人ヒト血清採取の場合、健康な成人から血液を採取し、臍帯血血清について説明したのと同じプロトコールに従って直ちに血清を単離する。HBSを熱不活化およびろ過したアリコートとして-80°Cで最大6ヶ月間保管してください。
    注: 社内 で新たに調製したヒト臍帯血清及び成人ヒト血清は、市販の血清よりも優れた結果を得た。セサリアンセクションの出産が予定されている18歳以上40歳未満の健康な女性からHCSを収集します。膣内出産をした女性、および妊娠糖尿病や高血圧症などの慢性疾患や活動的な病状を持つ女性を除外する。

3. E7.5から E11 までの胚の元子宮ローラー培養

  1. ローラー培養インキュベーターとガス調整器のセットアップ
    1. ローラー培養インキュベーターシステムを用いた5以上の高度胚の培養E7.5。胚解剖の前に、回転子と加熱部を37°Cで少なくとも1時間オンにします。オートクレーブ処理された水をガス入口ボトルと出口試験管に加えます。
      メモ:温度計を回転ドラムの隣に配置して、インキュベーター内の温度の安定性を頻繁に確認してください。長時間の開放時間が温度を上昇させ、胚発生に影響を与えるので、できるだけ早くインキュベーターを開きます。必要に応じて、ガス入口ボトルと出口試験管にオートクレーブ処理された水を追加して、培養中にそれらを最小の半分の容量に保ちます。インキュベーターを布で覆うことで、インキュベーター内の胚を光から保護します。
    2. メインスイッチを押し、酸素/窒素コントローラとCO2コントローラをオンにして、ガスレギュレータモジュールの電源を入れます(図1A)。それぞれのコントローラを使用して、酸素とCO2の値を5%に設定します。ガスレギュレータを開き、圧力トランスミッタの電圧スイッチを動かして、ガス圧力を約6.5~7ポンド/平方インチ(psi)に設定します(図1B)。デジタル圧力計を使用してガス圧力値を確認します。
    3. 精密インキュベーター内に割り当てられた出口水で満たされた試験管内に生成された気泡の速度をチェックして、ガスの流れを監視します。水筒の蓋のガス流量バルブを開閉して、適切な気泡率を設定します。ガス流が 毎秒2〜4 個の気泡の速度で気泡の形成を可能にすることを確認するか、またはバブリングが水で満たされた出口管に出てくる最初の点に気泡流を設定する。
    4. 培養瓶に2mLの培養液を充填し、くり抜いた回転ドラムに差し込んで1時間予備平衡化します。くり抜いたシリコンバンを使用して、ボトルをドラムに密封します。固体バンズを使用して回転ドラム内の空きスペースを密閉してください。
      注:出口管に気泡がない(ガスがシステムを通過しない)か、または非常に高いガス流が胚の発生に影響を与える可能性があります。出口試験管への気泡の流れが不足している場合は、すべてのシリコンバンが回転ドラムに正しく配置され、システムを密閉し、ウォーターボトルが正しく閉じられ、すべてのチューブが正しく接続されていることを確認してください。水筒に入る泡立ちの欠如は、ガスレギュレータの誤動作を示している可能性があります。
  2. 妊娠中のマウスからのマウス胚の解剖
    1. インキュベーター内の解剖培地を37°Cおよび5%CO2 で最低1時間予備平衡化します。蓋を少し開けたままにして、ガス交換をしてください。
    2. 子宮頸部脱臼によって妊娠中の女性を犠牲にし、70%エタノールで女性の腹部をきれいにし、はさみで皮膚と腹壁を切る。子宮の一端を見つけて、卵巣と子宮の交点で切断します。次に、子宮に沿って他端まで切断し、室温のダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)で満たされた100mmのシャーレに移す。
      注:ホルモンプライミングされていない、自然に交配した女性の使用が推奨されます。
    3. DPBSの概念をすばやく洗い流し、胚の取り扱いを容易にするためにペアで切断します。概念のすべてのペアを60mmのペトリ皿内の事前平衡化された解剖媒体に移動し、個々の概念に切断する。
    4. 一対の肉眼鉗子を用いて子宮組織を引き裂くことによって概念の子宮壁を除去する。細かい顕微手術用鉗子を使用して、洋ナシ形の脱落膜の先端を切断する。その長軸に平行な胚の隣に鉗子を挿入し、鉗子を開いて脱落膜を半分に分割する。
    5. 最後に、脱落体から胚を把持し、微細な鉗子を用いて胚から頭頂卵黄嚢を剥がすことによって、卵筒に取り付けられた無傷の外側胎盤円錐形を残す。
      注:胚に影響を与えないように、加熱プレートを備えた顕微鏡で37°Cで最大30〜40分以内に解剖を行ってください。一度に1つの胚のゴミを解剖する。
    6. 解剖直後に、ガラスパスツールピペットを使用して平衡化した解剖培地で満たされた新しいプレートに胚を移し、胚が組織破片に付着するのを防ぎます。
    7. 神経プレート/初期頭部折り畳み段階の胚を選択し、エピブラストに損傷を示さず、ボトルあたり5〜6個の胚を予め平衡化されたガラス培養ボトルに移す。
      注:ガラスパスツールピペットを準備するには、ガラスカッターを使用してピペットの開口部を胚にフィットするように適切なサイズに切断し、汚染を避けるためにエタノールに保管してください。胚を移植する前にガラスピペットをPBSで洗ってください。胚を培養瓶に移すときは、EUCMを希釈しないように、できるだけ少ない量の解剖培地を持ち越すようにしてください。
    8. ボトルを37°Cの回転培養システムに入れ、5%O2および5%CO2 の雰囲気下で置く。
    9. 培養の毎日、培養器からボトルを1本ずつ取り出し、実体顕微鏡下で胚発生を評価した。ボトルを取り外すときは、ドラムの空の穴をしっかりとしたバンで塞いでください。滅菌プラスチックパスツールピペットの先端を胚のサイズに合わせて切断し、観察を容易にするために胚をペトリ皿に移動します。胚が常に培地で覆われていることを確認してください。
      注:体温の低下による胚の有害な影響を避けるために、胚がインキュベーターの外にいる時間を最小限に抑えてください。卵黄嚢血管の破裂を避けるために胚を慎重に取り扱い、胚の生存に影響を与えます。
    10. 培養1日目(E8.5に相当)に、3つの胚のグループを、余分な3mg/mLのDグルコースおよび13%O2、5%CO2の混合ガスを含む2mLの新鮮で予め平衡化されたEUCMを含む新しいボトルに移す。
    11. 48時間後(E9.5に相当)、2つの胚のグループを、18%O2および5%CO2のガス雰囲気下で、新鮮な予熱EUCMと3.5mg / mLのグルコースを加えた新しいボトルに移す。
    12. 72時間の培養(E10.5に相当)で、各胚を、4mg/mLのグルコースと21%O2および5%CO2のガス供給を添加した1.5〜2mLの新鮮な培地を含む個々のボトルに移動する。
      注:胚は、培養4日目の真夜中頃に最大成長に達する。
    13. 細かい鉗子を使って卵黄嚢と羊膜を取り除き、胚の形態を適切に観察するために臍帯を切り離します。ガス調整モジュールと精密インキュベーターの電源を切ります。
      注:胚期に応じて適切なガス雰囲気下でローラー培養でガラス瓶内で培養することにより、培養液を1時間予備平衡化する。培養瓶とすべてのインキュベーターのガラス製品を、使用のたびに、実行中の蒸留水で3回の洗浄を行い、続いて70%エタノールに沈めた一晩洗浄することによって洗浄する。ランニング蒸留水で3回再洗浄し、ボトルを一晩乾燥させ、オートクレーブで滅菌します。同様に、シリコンプラグを定期的にオートクレーブします。すべての解剖ツールを70%エタノールで徹底的に洗浄し、乾式滅菌します。

4. E5.5/E6.5からE11への拡張胚培養

  1. 胃前期(E5.5)および初期胃形成(E6.5)胚を初期ソマイト期(E8.5)まで静的プレートで培養する。
  2. 解剖培地を37°Cで5%CO2 のインキュベーター内で1時間予備平衡化する。
    メモ: ガス交換を可能にするために、チューブの蓋を完全に閉じないでください。
  3. 各ウェルに250 μLの新しく調製したEUCMを加えて培養プレートを調製する。プレートを37°CのCO2 インキュベーター内に置き、事前平衡化を行います。
    注:8ウェルプレートは胚の成長に適していますが、プレートのサイズに応じて培地の体積を調整することで、他のプレートで培養を行うことができます。
  4. E7.5で説明した技術に従って、卵筒胚を子宮から解剖する。胚の頭頂卵黄嚢を除去し、卵筒に取り付けられた無傷の外胎盤円錐を残す。
  5. マイクロピペットを用いて個々の胚を8ウェルプレートの各ウェルに移し、プレートを37°Cで5%CO2 でインキュベーター内に置いた。
  6. 実体顕微鏡下で胚を画像化し、明確な損傷がなく、ライヒャート膜のない、よく形成された羊膜を有するもののみを培養用に選択する。
    注: E5.5 胚を移植するには 20 μL のピペットチップを使用し、E6.5 胚を移植するには 200 μL のチップを使用します。E6.5で始まる培養物の場合、HCSは新たに収集されたHBSに置き換えることができる。
  7. 培地の半分を取り出し、24時間の培養後に新たに調製した予め加温したEUCMを250μL加え、胚が常に培地に浸漬されるようにする。E5.5から開始した培養の場合、2日間の培養(E7.5に相当)後、200 μLを除去し、250 μLの新しいEUCMを添加する。
    注:静的培養中、胚がプレートに付着することがあり(主にプラスチックプレートを使用する場合)、胚の発生を著しく損なう。プレートへの胚の付着は、E5.5胚を培養した最初の日により頻繁に起こる。付着を防ぐために、微細で滅菌された鉗子を使用して胚をプレート表面から慎重に押し離してください。外部胎盤円錐のみがプレートの表面に付着したままであることを確認します。
  8. 初期のソマイト段階(4〜7ソマイト;E5.5で外植された胚については3日間の培養後、E6.5で開始された培養については2日後)に、E8.5段階の胚について以前に説明したのと同じ適応症に従って、胚をローラー培養に移す。
    注:上記とは異なるソマイト段階で胚をローラー培養に移すと、さらなる発達が失敗する。E7.5 ex utero culturesとは対照的に、胚を21%酸素および5%CO2の一定の雰囲気に維持することが可能であり、動的酸素濃度の雰囲気よりも胚発生の効率がわずかに高い。

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結果

E7.5胚について記載したローラー培養条件(後期胃形成段階)は、培養4日後に75%に近い平均効率で一定かつ正常な胚増殖を支持する(図2 および 表1)。胚発生の効率は、多様なマウスの遺伝的背景によって異なる可能性があるが、一貫して頑健である(図2C)。HCSの代わりにHBSを補充すると、マウスの遺伝的背景に応じて、 元子宮 培養の4日後に〜68%の効率が得られる(図2D および 表2)。 子宮外で 発達した胚は、約44ソマイト段階まで適切な発達を再現する。その後、胚はアラント性胎盤の不在のために胚性異常を示し、この段階での体の大きさの増加を考えると、不十分な酸素化および栄養供給をもたらす。

静的プレートにおけるE6.5胚(初期ストリーク)の発生は、HCSおよびHBSの両方を有するEUCM(図3、

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ディスカッション

本明細書に提示される培養プロトコールは、E5.5からE11までの6日間、子宮外で適切かつ連続的なマウス胚発生を維持することができる。以前は、これらの発生段階の胚は、短期間(最大48時間)の培養で正常に発達することができました15。酸素濃度および高圧ガス圧を正確に制御するためのローラー培養器へのガス調節モジュールの結合は、本明細書に記載の適切なマウス胚培養にとって重要である。ガス圧力を7psiに高めると酸素拡散が促進され、長期的には胚に有害である可能性のある95%O216の以前に採用された条件とは対照的に、最大21%O2 / 5%CO2の雰囲気下でE11までの胚発生が可能になる。さらに、酸素濃度は、着床後の早期胚発生が低酸素条件下で起こるため、胚発生において重要な役割を果たすことが知られている17。したがって、後期胃胚の培養を成功させるには、初期5%のO2雰囲気が必要であ...

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開示事項

J.H.H.はBiological Industries Ltd.のアドバイザーであり、ここに記載されているローラーおよび静的培養条件をカバーする特許出願を提出しました(J.H.H.およびワイツマン科学研究所によって提出されました)。他の著者は、競合する利益を宣言していません。

謝辞

この作品はパスカルとイラナ・マントゥーによって資金提供されました。欧州研究評議会(ERC-CoG-2016 726497-細胞性);客室乗務員医学研究評議会(FAMRI);イスラエルがん研究基金(ICRF)教授職、BSF、ヘレン・アンド・マーティン・キンメル幹細胞研究所、ヘレン・アンド・マーティン・キンメル賞(革新的調査)イスラエル科学財団(ISF)、ミネルバ、シャーマン薬化学研究所、ネラとレオンベノジヨ神経疾患センター、遺伝性疾患研究のためのデビッドとフェラシェイペルファミリーセンター、ケクストファミリー遺伝研究所、ベスロムライマー幹細胞研究基金、エドモンドデロスチャイルド財団、ザントカー慈善財団、ズビアゼロニの不動産。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.22 以上m孔径フィルター(250 mL)JetBiofilFCA-206-250
0.22 µm細孔サイズシリンジPVDFフィルターミリポアSLGV033RS
8ウェルµプレートガラス底/ ibiTreatiBidi80827/80826
ガス入口用アダプターキャップ付きボトルアラドテクノロジー
ズ バングス (穴)B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision EngineeringBTC 06ドラム缶にボトルを密封するために使用されます
バングス (固体)B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision EngineeringBTC 07回転ドラムのシールに使用
培養ボトルB.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision EngineeringBTC 03/BTC 04ガラス瓶 (小) BTC 03 またはガラス瓶 (大) BTC 04
D(+)-グルコース 一水和物J.T. Baker
ダイヤモンドナイフファイン サイエンス ツール10100-30/45
デジタル圧力計上海Benxu電子技術有限公司BX-DPG80
DMEMGIBCO11880
ダルベッコのリン酸塩緩衝生理食塩水生物産業02-020-1A
ウシ胎児血清生物産業04-013-1A
ガス調整モジュールアラドテクノロジーズ HannaLab1
GlutamaxGIBCO35050061glutamine
Graefe鉗子Fine Science Tools11052-10
HEPESGIBCO15630056
Microsurgical Forceps (Dumont #5, #55)Fine Science Tools11255-20
パスツールピペット (ガラス)Hilgenberg3150102
パスツールピペット (プラスチック)AlexredSO P12201
ペニシリン/ストレプトマイシン生物産業03-031-1B
ペトリ皿 (60 mm および 100 mm)ファルコン351007/351029
精密インキュベーターシステムB.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision EngineeringBTC01BTC01 ガスバブラーキット付き
プロ凝固剤滅菌試験管 (5 mL)Greiner Bio-One#456005
ラット全胚培養血清ENVIGO BioproductsB-4520
加熱プレートを備えた立体顕微鏡ニコンSMZ18
ろ過用滅菌注射器(5、10ml)Pic
外科用ハサミファインサイエンスツール14094-11
血清溶液

参考文献

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