高齢者の血漿中のフェノール代謝産物の質量分析に組み合わせた半標的超高速クロマトグラフィー

サルコペニアは、高齢者集団における筋肉の加速的な喪失に関連する進行性の骨格障害である。この状態は転倒のリスクを高め、日常生活の限られた活動につながります。サルコペニアは、65歳以上の人の約5%〜10%、80歳以上の人の約50%に存在します¹。サルコペニアの治療には特定の薬は承認されていないため、身体活動とバランスの取れた食事による予防が重要です^1,2。乳製品タンパク質と必須アミノ酸が豊富に配合された特別に処方された食品による栄養介入は、サルコペニアの予防に肯定的な結果を示しています²。他の研究では、著者らはビタミンEやイソフラボンなどのビタミンや抗酸化物質を食事に含め、腰と腰の筋肉増加の利点を高めています³。

ブロシムムアリカストラム Sw.(ラモン)は、メキシコの熱帯地域で育つ木です。それはその高い栄養価のためにマヤの文化によって消費されてきました⁴。それはタンパク質、繊維、ミネラル、およびクロロゲン酸などのフェノール系酸化防止剤の良い供給源です⁵。粉末に粉砕してベーキング製品に使用したり、飲料に消費したりすることができるため、最近の研究では、栄養価を向上させるためにラモン種子粉(RSF)をさまざまな食品に組み込むことが評価されています。RSFを補ったカプチーノ風味の飲料が処方され、食物繊維が多く、1サービングあたり6g以上のタンパク質を含み、消費者に高く評価されました。したがって、それは特別な食事要件を満たすための潜在的な代替手段と考えられていました⁶。追跡調査では、RSFはマフィンとタンパク質、食物繊維、微量栄養素、フェノール系抗酸化物質が豊富な新しい飲料を処方するためにも使用されました。マフィンと飲料は、30日間、1日2回両方の製品を消費した高齢者のための食事介入に使用された。この期間の後、参加者の栄養状態およびサルコペニック状態は改善し、血漿の総フェノール含有量は増加した⁷。しかし、血漿中の全フェノール化合物の測定は分光光度法によって行われたため、吸収された実際のフェノール化合物の同定は不可能であった。さらに、この方法はフェノール化合物に完全に特有のものではないため、過大評価が起こる可能性があります⁸。

これらの抗酸化物質が豊富な食品の摂取後に吸収されるフェノール化合物の同定および定量化は困難な作業であるが、これらの植物化学物質の生物学的活性を実証するために必要である。ほとんどのフェノール化合物の生物学的利用能は低いです;それらの5%未満がプラズマ中の構造変換なしで見つけることができます。フェノール化合物は、メチル化、スルホン化、グルクロン酸抱合などのいくつかの生体内変換を受け、腸細胞および肝細胞によって行われる⁹。フェノール化合物はまた、微生物叢によって細菌の異化物に生体内変換され、血漿に吸収された後、体内で有益な効果を発揮する可能性がある¹⁰。例えば、フェニル酢酸は、フラボノイドおよびオリゴメリックプロアントシアニジンの細菌形質転換の産物であり、クランベリー摂取後の尿路における細菌(大腸菌)接着の最大40%を阻害することができる¹¹。

天然に存在するフェノール化合物の構造的多様性は、それらの代謝産物の多様性およびそれらの低いバイオアベイラビリティーに加えて、血漿中でのそれらの同定をさらに困難にする。核磁気共鳴(NMR)やタンデム質量分析(MS/MS)などの分光分析プラットフォームを使用したメタボロミクスプロファイリングは、おそらくこの目標を達成するための最良のアプローチです。残念ながら、この機器は簡単にはアクセスできず、分析プロトコルの開発はまだ限られています¹²。いくつかの研究では、メタボロミクス研究における質量スペクトルの複雑さを軽減するための戦略として、分離システム(液体クロマトグラフィーなど)と組み合わせたMS / MSが報告されています。近年の超高速液体クロマトグラフィー(UPLC)分離法の導入により、従来の高速液体プロトコルと比較して分析時間が短縮され、分解能と感度が向上したため、UPLC-MS/MSシステムは分析メタボロミクスコミュニティによって急速に広く受け入れられています¹³。このようにして、いくつかの研究では、フェノール代謝産物を調査し、カフェ酸、ケルセチン、フェルラ酸からのグルクロン酸誘導体、ならびにクランベリー摂取後の個体の血漿中のシリンギー酸およびバニリン酸からのスルホン化誘導体を検出した¹⁴。以前のプロトコールは、血漿などの生体液中のフェノール化合物およびフェノール代謝産物を見出すことを意図していた。これらのプロトコールは、UV-vis検出器に結合された高速液体クロマトグラフィー(HPLC)による同定および定量に基づいていた¹⁵。それにもかかわらず、そのようなプロトコルは、絶対的な識別と正確な定量化を評価するために本物の標準の使用を必要とします。幅広い研究により、生体液中の最も一般的な代謝産物(スルホン化、グルクロン酸抱合型、メチル化形態)がUPLC-MSおよびUPLC-MS/MSによって同定されている。しかし、細菌代謝産物の大部分は、完全な情報を含むデータベースがないために報告されていません¹⁶。代謝産物の同定は、代謝産物標準のコストおよび商業的入手可能性によって複雑になる。したがって、最良の戦略は、分子特徴情報(m / z、モノアイソトピック正確質量、同位体分布、および断片化パターン)を使用して化学的同一性を決定し、ポリフェノールリッチトの消費後に生体液中で同定されたポリフェノール代謝産物を含む自由に利用可能なオンラインデータベースと比較する非標的または半標的MS / MS代謝産物分析であり^得る12.フェノール化合物とその代謝産物の同定のためのUPLC-MS/MS研究で使用される最も重要なデータベースは、ヒトメタボロームデータベース(HMDB)、LipidBlast Library、METLINライブラリ、およびPubChem、ChemSpider、Phenol Explorerなどの他の補完的なデータベースです¹⁷。

本研究では、RSF含有マフィンおよび飲料消費試験に関与する高齢者群の血漿サンプルを分析するために、セミターゲットUPLC-MS/MS法を開発しました⁷。血漿代謝産物のさまざまな無料のオンラインデータベースからのデータが収集され、専門のデータベースに統合されました。このデータベースは、30日間の栄養介入の前後に5つの血漿サンプル中のポリフェノール代謝産物を同定するために、装置ソフトウェアによって自動的にアクセスすることができる。これは、サルコペニアの予防のために設計された特別に処方された機能性食品から吸収される主なフェノール化合物、またはその代謝産物を特定するために行われます。

このプロトコルで使用された血漿サンプルは、すべての倫理ガイドラインに従って以前の研究で収集され、シウダーフアレス大学の制度倫理および生命倫理委員会(CIEB-2018-1-37)によって承認されました。UPLC-MS/MSによる血漿中のフェノール化合物および代謝産物の抽出および同定のための完全なプロトコルは、 図1に示されている。

図1:半標的UPLC-MS/MS法による血漿中のフェノール化合物および代謝産物の抽出および同定の概略図。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

1. サンプル調製

1. 分析まで血漿サンプルを-80°Cで保存する。
2. プラズマサンプルを室温で15分間解凍する。
   注:サンプルを37°Cの水浴に入れて、プロセスを加速することができます(5分)。
3. 200 μLの血漿サンプルを2 mLマイクロチューブに入れ、1,000 μLの純粋なエタノールと混合する。プラズマサンプルを30秒間渦巻きます。
   注:血漿サンプルを扱うときは、常に手袋を使用してください。
4. サンプルを 6,580 x g で 5 分間遠心分離します。遠心分離後、マイクロピペットまたはパスツールピペットで上清を収集し、新しいマイクロチューブに入れます。上清を4°Cで保存する。
5. 前のステップのペレットを1,000 μLの100%エタノールと混合し、ボルテックスで30秒間、次いで6,580 x g で5分間遠心分離する。
   注:ペレットは強く充填されており、サンプルと純粋なエタノールとの接触を確実にするためによく再懸濁する必要があります。ペレットをエタノールで洗い流すためにマイクロピペットを使用することが推奨される。
6. 遠心分離後、上清を収集し、ステップ1.4から以前に得られた上清と混合する。2mLのマイクロチューブに入れた。
7. 135psiで純窒素(99.997%)を使用してサンプルからエタノールを除去します。サンプルの損失を防ぐために、針をマイクロチューブの上部から1cm離し、サンプルが乾くまで洗い流してください。エタノールを蒸発させるために熱は必要ありません。
   メモ:サンプルの損失を防ぐために、窒素流量を低くする必要があります。エタノールが乾燥したら、サンプルの乾燥を確実にするために窒素流を少なくとも5分間保ちます。プロトコルはこの時点で一時停止できます。サンプルは-20°Cで保存する必要があります。 サンプルを 12 時間以上保管しないでください。
8. 乾燥サンプルをアセトニトリル:水の混合物100 μLに50:50(v:v)の割合で再懸濁する。
9. サンプルを 0.45 μm ナイロンシリンジメンブレンを通して HPLC バイアルマイクロインサートに直接ろ過します。
   注:バイアル内のサンプルは、分析前に-20°Cで保存することができます。サンプルを8時間以内で保管してください。ろ過直後にサンプルをUPLCシステムに注入することをお勧めします。

2. UPLC-MS/MS 解析

1. C18 逆相カラム (50 mm x 2.1 mm; _1.8 μm) を備えた UPLC に 3 μL のサンプルを注入します。オートサンプラーの温度を 20 °C に設定し、カラム サーモスタットを 25 °C に設定します。 各サンプルを3連で注入する。
2. 溶媒Aとして水中の0.1%(v:v)ギ酸を使用し、溶媒Bとして100%アセトニトリルを使用します。流量を0.4mL/分に設定し、グラジエントプログラムを次のように設定します:0-1分10%B、1-4分30%B、4-6分38%B、6-8分60%B、8-8.5分60%B、8.5-9分10%B(表1)。
3. 質量分析計を負モードイオン化に設定します。窒素を340°Cで乾燥ガスとして使用し、流量は13L/minです。ネブライザーの圧力を 60 psi に設定します。キャピラリー電圧を4,000 V、フラグメンタ電圧を175 V、スキマー電圧を65 Vに設定し、衝突エネルギーを20 Vで使用します(表2)。
4. 質量を100~1100質量対電荷比(m/z)でスキャンし、MS/MSの場合は50~1000m/zの質量をスキャンします(表2)。 データ集録を自動MS/MSモードに設定します。次の参照質量を使用します: 119.036 および 966.0007。

表1:UPLCによるフェノール化合物の分離に用いた移動相勾配。

表 2: MS/MS 分析のイオン化パラメータ

3. データベース構築

1. フェノール化合物、フェノール代謝産物、または科学文献で関心のある他の化合物を検索します。
2. UPLCシステムに含まれているデータベース管理ソフトウェアを開きます。 ファイル|の選択新しいパーソナル・データベース複合ライブラリー (PCDL) |新しい PCDL を作成します。PCDL のタイプを選択します: LC/ms メタボロミクス。PCDL の名前を設定します。次に、[ 作成] を選択します。
3. ツールバーで、[ PCDL ] を選択し、[ 編集を許可する] オプションを選択します。次に、「 化合物を検索 」ボタンをクリックします。
   メモ: これは新しい PCDL であるため、テーブルの結果は空になります。これは、新しい化合物がPCDLに追加されると変化します。
   1. 特殊なパーソナルデータベースの化合物ライブラリにコンパウンドを追加するには、計測器の一般ライブラリからコンパウンドをコピーします。データベース管理ソフトウェアに含まれている計測器の既存のデータベースを開きます。「 化合物を検索」ボタンをクリックします。単一検索オプションに、複合 検索 基準を入力して、目的の複合を検索します。
      注:化合物は、名前、分子式、正確な質量、および保持時間で見つけることができます。
   2. 化合物結果表で、目的の化合物を選択します。複数の化合物を選択するには、最初の化合物をクリックし、 Ctrl キーを押しながら、目的の各化合物をクリックします。次に、強調表示されたすべての化合物を右クリックし、[ PCDLに追加]を選択します。
   3. 新しいウィンドウで、特殊なパーソナル・データベース・ファイルを検索して選択します。[ 化合物が存在する場合はスペクトルを含める] ボックスに マークを付け、存在する場合は [イオン移動度情報を含める] ボックスにマークを付けます。「 追加」 ボタンをクリックします。新規ダイアログボックスで、「 はい 」を選択して、追加された新規コンパウンドをチェックします。[ いいえ ] を選択して、関心のあるコンパウンドをさらに検索し続けます。
4. 目的の化合物が機器の一般ライブラリで利用できない場合は、新しい化合物を手動で追加します。
   1. 特殊なパーソナル・データベースを開きます。開いたら、ステップ3.3に従います。「コンパウンドを 編集」 オプションを選択します。「 新規追加」 ボタンをクリックします。
   2. ウィンドウの上部セクションで、新しいコンパウンドの情報を入力します。式、名前、IUPAC名、CAS番号、ケムスパイダーID、およびその他の識別子を入力します。
   3. 無料のオンラインライブラリ(Chemspider、PubChem、およびPhenol Explorer)で利用可能な情報を使用して、目的の新しい化合物の情報を入力します。完了したら、[ 新規として 保存]ボタンをクリックして、新しい複合情報を特殊なパーソナルデータベースに保存します。
      注:フリーライブラリから情報を追加する場合は、塩化物イオンやヨウ化物イオンが存在しない化合物情報を必ず含めてください。これは、目的の化合物の正確な質量および分子式を修飾し得る。
5. 目的のすべての化合物でこのプロセスを繰り返して、特殊なパーソナルデータベースを完成させます。

4. データ解析

1. 装置の定性管理ソフトウェアを使用して、サンプル中に存在するフェノール化合物およびフェノール代謝産物を同定します。
2. サンプル ファイルを開きます。クロマトグラムパネルで、[クロマトグラムの定義]を選択し、トータルイオン クロマトグラム (TIC)、抽出されたMS(EIC)、およびMS/MSのEICを抽出します。クロマトグラムの統合オプションを選択します。
3. コンパ ウンドを 検索パネルで、「 フォーミュラで検索」-「オプション」を選択します。新しいウィンドウで、[ 数式ソース] を選択し、[ データベース/ライブラリ] オプションを選択します。以前に作成したパーソナルデータベースを見つけて、[ 開く]をクリックします。
4. 「フォーミュラマッチング」オプションを選択し、質量マッチング公差を 5 ppm に設定します。
   注:質量の異なる一致公差は10ppmに設定することができます。この違いは、使用する質量分析計によって異なります。
5. 「マイナスイオン」オプションを選択し、「-H」ダイアログ・ボックスのみを選択します。「結果」オプションで、「EIC の抽出」、「クリーニングされたスペクトルの抽出」、「生のスペクトルの抽出」、および「構造を含める」ダイアログボックスにマークを付けます。
6. 「結果フィルター」オプションを選択します。スコアが [マーク] の場合は警告し、スコア一致を 80.00% に設定します。スコアが一致しない場合は一致しないマークを付け、スコアを 75.00% に設定します。
   注: 一致/不一致のスコアは、必要に応じて低い値に変更できます。これにより、識別の精度が低下します。
7. 「式で化合物を 検索」 をクリックして、サンプル中の目的の化合物を特定します。

血漿サンプルの半標的UPLC-MS/MS分析(ネガティブモード)によるフェノール代謝産物の同定のための段階的なプロセスを 図2に示します。まず、血漿フェノール抽出物(全血漿試料のタンパク質沈殿後に得られた)から総イオンクロマトグラム(TIC)を、装置の定性ソフトウェアを介して得た。次に、抽出したイオンクロマトグラムを用い、各シグナル(または分子特徴)の正確な質量およびフラグメンテーションパターン(MS/MS分析)を、機器のソフトウェアでも作成された特定の個人データベースのものと比較した。5ppm未満の質量一致を有するシグナルは、データベースから分子式を割り当てた。最後に、各シグナルの同位体分布を、割り当てられた分子式の分布と比較し、最終的な仮同定を達成した。a)1回の複製でのみ同定されたか、またはb)10,000未満の領域を提示した化合物は、偽同定として扱われた。この分析から、血漿サンプル中に合計25のフェノール化合物および代謝産物が同定された(表3)。このリストでは、フェノール化合物およびその代謝産物、例えば3−ヒドロキシフェニル吉草酸およびイソプロピル3−(3,4−ジヒドロキシフェニル)−2−ヒドロキシプロパン酸の両方が見出された。負のイオン化モードは、アントシアニンを除くすべての種類のフェノール化合物に最も適しているため、これらの化合物は本方法では検出できなかった。アントシアニンが食物マトリックスの重要な成分である場合、陽性モードも使用すべきである。

表3:半標的UPLC-MS/MS法による血漿サンプル中のフェノール化合物および代謝産物の暫定同定。

RSF含有マフィンおよび飲料から吸収された主要なフェノール化合物またはそれらの代謝産物の同定のために設計された方法の有効性を評価するために、30日間の介入の前後に得られた研究参加者の5つの鎮痛サンプルを分析した。各化合物の相対存在量は、処理後の曲線下面積(AUC)を処理前のAUCで割ることにより算出した。この分析から、いくつかの化合物は治療前に得られたサンプルにのみ出現し、他の化合物は変化せず、そのうちのいくつかは機能性食品の消費後に増加したことを観察することができた。 表4 は、RSF含有食品の30日間の消費後に血漿の増加を示した12のフェノール化合物のリストを示す。フェニル酢酸は、治療後により高い濃度で一貫して見出された唯一の代謝産物であった。グリシチン、グリコシル化イソフラボン、および3-ヒドロキシフェニル吉草酸(フェノール代謝産物)は、5つのサンプルのうち3つで増加したが、他の2つでは減少した。リグナンであるゴミシンM2は、栄養介入後にのみ5つのサンプルのうち3つで検出された。他のフェノール化合物(ヘスペレチン、セコイソラリシレジノール、バニリンなど)および代謝産物(2-ヒドロキシ馬尿酸など)は、1つのサンプルでのみ、処理後にのみ見出された。

表4:RSF含有食品の30日間の消費後に高齢者の血漿中で増加したフェノール化合物のリスト。 データは、処理前のそれらの存在量と比較した処理後の各化合物の存在量(AUC)の比である。Tは、化合物が処理後の試料においてのみ同定されたことを示す。Nd: 検出されません。

図2:半標的UPLC-MS/MSによるフェノール化合物代謝産物の同定のためのプロトコル。この図の拡大版を見るにはここをクリックしてください。

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