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方法論記事

経口投与薬物の連続採血のためのラットにおける永久頸静脈梁冠形成を確立する微小外科的スキル

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DOI：

10.3791/63167

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2021年12月14日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Xi'an Key Laboratory of Stem Cell and Regenerative Medicine, Institute of Medical Research, Northwestern Polytechnical University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

詳細な顕微手術技術が、同じ動物における逐次採血のためのより長期の頸静脈カニューレラットモデルを確立するために実証される。生理学的および血液学的パラメータは、ラットの回復期にモニターされている。このモデルは、動物のストレスを誘発することなく経口投与されたポリフェノールの薬物動態を研究するために適用されている。

要約

小型実験動物での採血は、医薬品のリードの最適化に必要ですが、実験動物に大きな害とストレスを引き起こす可能性があり、結果に影響を与える可能性があります。ラットの頸静脈カニューレ(JVC)は、繰り返し採血するために広く使用されているモデルですが、手術スキルと動物ケアの適切な訓練が必要です。この記事では、頸部カニューレの配置とシーリングに特に焦点を当てて、恒久的なJVCラットモデルを確立し維持するための顕微手術手順を詳述します。生理学的(例えば、体重、食物、および水分摂取量)および血液学的パラメータをモニタリングすることの重要性を、ラットの回復中に手術後6日間提示された結果で強調した。経口投与された天然フェノールエラグ酸の薬物 - 血漿濃度 - 時間プロファイルをJVCラットモデルにおいて決定した。

概要

げっ歯類、モルモット、ウサギなどの小型実験動物からの血液サンプルの反復取得は、医薬品リードの最適化と研究に使用される動物の数を減らすための重要な側面です1,2。新しい診断ツールおよび薬物製剤(例えば、ワクチン)を開発するためのパイプラインは、薬物動態(PK)、毒性、および感受性などのインビボでのそれらの堅牢性および性能を評価するために、異なる量の血液へのアクセスを必要とする3、4、5。

血液サンプル採取に対する実験室アプローチは、外科的および非外科的6の2つのタイプに大別される。非外科的アプローチは、心臓穿刺、眼窩洞穿刺、伏在静脈および尾静脈の出血などの一般的な技術を含む、研究者にとって比較的容易に把握可能である。いくつかの非外科的方法によって複数の血液サンプリングが可能であるが、サンプル量は少なく、動物1に身体的創傷および心理的ストレスを引き起こし得る。一方、外科的アプローチは、反復静脈穿刺に代わる好都合な代替手段であり、動物の血管に一時的または永久的なカニューレを配置することを含む7,8,9。大量の血液は、取り扱い技術、拘束、麻酔によるストレスや痛みを避けながら、意識のあるラットのカニューレを通して繰り返し引き抜くことができました7,8,10,11。しかし、カニューレの移植には、血液をうまく採取するために十分な訓練を受けた経験豊富な研究者が必要です。

ラットにおける頸静脈カニューレーション(JVC)による採血は、薬物PK6、10、12、13を研究するために最も広く使用されている方法である。しかし、JVCラットモデルの確立には、顕微手術のスキルと術後のケアとメンテナンスに関する知識の慎重な実践が必要です。とりわけ、手術後、ラットは、鎮痛剤の投与およびさらなる実験13、14、15のための安定した生理学的状態に達するのに十分な回復時間を必要とする。体重増加(すなわち、>10g)は、ラットの回復のための有効かつ一般的に適用される指標であるが、ラットが脱水、感染、および炎症のために術後に予期せぬ死を迎えることは珍しくなく、これは早期発症時に気づくのに微妙である可能性がある14,15。さらに、JVCモデルにおけるカテーテル閉塞は、採血中の問題であることが依然として問題である。

本プロトコールは、頸静脈の同定、単離、およびカニューレに特に焦点を合わせた麻酔ラットにおけるJVCの顕微手術手順を詳細に実証した。回復段階におけるラットの生理学的および血液学的モニタリングの重要性が強調される。最後に、静脈カテーテルを通して連続血液サンプルを採取し、経口投与された天然フェノールエラグ酸のPKを生物学的利用能が低い(すなわち、低全身濃度)で研究し、JVCラットモデルを検証した。

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プロトコル

以下に説明する手順は、ノースウェスタン工科大学の施設動物ケアおよび使用委員会(No. 202101117)によって承認されたプロトコルの一部として実施されました。

1.術前準備(手術前日)

注:必要な溶液:通常の生理食塩水(0.9%w / v塩化ナトリウム)、ヘパリン化生理食塩水(1% w / vヘパリンナトリウム)、カテーテルロック溶液、メロキシカム溶液(2mg / mL)などの非ステロイド性抗炎症薬(NSAID)。

  1. 溶液調製
    1. 1.5 mL滅菌微量遠心チューブに予め包装されたカテーテルロック溶液200 μLをアリコートする。
      注:カテーテルロック溶液は、グリセロール(v/v,1:1)と混合されたヘパリン化生理食塩水(0.4% v/vヘパリンナトリウム)で構成されています。
    2. 100mLの通常生理食塩水に1gのヘパリンナトリウムを混合し、1%ヘパリン化生理食塩水を調製した。
    3. メロキシカムを通常の生理食塩水に溶解し、術後の疼痛緩和のために2mg/mL濃度の溶液を調製する。
      注:調製したヘパリン化生理食塩水およびメロキシカム溶液は、0.22μmフィルターでろ過されます。すべての溶液は滅菌され、将来の使用のために4°Cで保存されます。
  2. 手術器具および材料
    1. すべての清潔な手術器具を袋に詰め、オートクレーブ滅菌テープでテープで留めます。使用される特定の手術器具については、 図1A を参照してください。
    2. 外科用パウチを121°Cで30分間オートクレーブし、翌日使用。
  3. 動物の準備
    1. 手術前に、すべての雄のSprague-Dawley(SD)ラットを、22 ± 1°Cで温度を制御した標準的な動物室に収容する。 標準的な実験室の食物と水を少なくとも7日間 自由摂取 させてください。
      注:JVCモデルには雄ラットと雌ラットの両方を使用することができ、その典型的な年齢と体重はそれぞれ9〜14週と294〜57g±さまざまです。
    2. 麻酔前チャンバー内で酸素と混合した3%〜3.5%イソフルランでラットを麻酔する。ラットが足のピンチに対する反応の欠如によって意識不明になるかどうかを決定する。
    3. ラットを静かに取り出し、ラットの鼻を2%〜2.5%イソフルランを供給する麻酔薬ノーズピースに入れる。
    4. 腹側と背側の位置では、脱毛クリームとペットの剃刀で右肩と首の後部の周りの毛皮を徹底的に取り除きます。ラットをケージに戻し、翌日に手術を行う。

2.当日の手術前

  1. 無菌ワークステーションの準備
    1. 75%の医療用アルコールをスプレーして手術領域を消毒し、加熱パッドを清潔なクッションで覆った状態にします。ワークステーションの横に冷たい光源の付いたLEDランプをセットします。
    2. 必要な溶液(ステップ1.1)を室温に予備加熱する。
    3. 0.6 mL のヘパリン処理生理食塩水および 0.15 mL のカテーテルロック溶液を、それぞれ 2 つの滅菌 1.0 mL の鈍い先端シリンジに充填します。滅菌5.0 mLシリンジを用いて2.5 mLの通常の生理食塩水を抜き取る。
    4. 綿球を75%の医療用アルコールに浸します。使用前に余分なエタノールを絞り出す。
    5. ラットの体重を計量して記録します。

3. 手術中

  1. 外科的準備
    1. 手術用コート、滅菌手袋、フェイシャルマスクを着用してください。その後、滅菌した手術用パウチを開き、すべての手術器具を75%の医療用アルコールに入れたままにし、使用前に乾燥させます。
  2. 頸静脈隔離
    メモ: この部品の推定動作時間は 10 分です。
    1. 誘導チャンバー内で酸素と混合した3%〜3.5%イソフルランで手術準備完了の剃毛ラットを麻酔し、ラットが足のピンチに対する反応の欠如によって意識を失うかどうかを決定する。
    2. 麻酔を維持するために、2%〜2.5%イソフルランを供給されたノーズピースにラットの鼻を入れる。
    3. 皮下注射(s.q.)メロキシカム溶液を2mg / kgの用量で投与する。
      注:薬物動態試験において、目的の薬物化合物と相互作用しない鎮痛薬を必ず選択してください。
    4. 粘着テープを使用して、ラットの前腕を腹側位置で外科的プラットホームの両側に拘束する。
    5. 75%の医療用アルコールに浸した綿球とヨウ素ベースのスクラブを交互に3回交互にして手術部位を優しくこすります。
    6. 鉗子で首の正中線の右側の鎖骨付近の皮膚を慎重に持ち上げ、外科用はさみで長さ約1.5〜2.0cmの胸に向かって切開します。
    7. 鈍い麻痺は、虹彩はさみで薄い組織カバーを解剖し、頸静脈の下を露出させる。外頸静脈の近位頭蓋端は、視覚的に識別することができる2つの枝からなる。
      注:ラットの年齢および性別に応じて、頸静脈を覆う軟部組織(例えば、唾液腺、リンパ節、および脂肪組織)は変化する。若いラットと比較して、古いラットはより太っている(例えば、BW>300g)ので、頸静脈が見える前により多くの組織分離が必要である。
    8. 頸静脈とその結合膜組織を持ち上げて、頸静脈に付着したリンパ腺を視覚化します。血管方向に沿って静脈を周囲の筋肉、脂肪、および他の組織から慎重に分離する。
    9. 側副血管を損傷することなく頸静脈の下に鉗子をナッジし、血管の両端を個別にマークするために静脈の下に2つの6-0縫合糸を通す。
    10. 縫合糸の1枚をラット頭部に向かってできるだけ遠くに引っ張り、鉗子を使用して静脈を2〜3ノットで頭蓋に結紮する。
    11. 2番目の合字を静脈の尾端に1つの緩い結び目で配置します。
  3. 頸静脈カニューレ
    メモ: この部品の推定動作時間は 15 分です。
    1. 11cmポリウレタン(PU)カテーテル(内径0.6mm×外径0.9mm、 図1B)を含むパッケージを開き、ヘパリン処理生理食塩水で満たされた準備された鈍い先端シリンジにカテーテルを取り付ける。
    2. 気泡を避けるために、ヘパリン処理した生理食塩水をゆっくりとカテーテルに押し込みます。
    3. 鉗子の非先端平らな側を頸静脈の下に引っ張って、反対側に出ます。一対のカストロビエホマイクロハサミで頭蓋結びの近くの静脈に小さなV字型の切り傷を作り、肘の血管拡張鉗子の先端で切開部を静かに開きます。
      注:少量の血液が噴出する場合は、あらかじめ温めた通常の生理食塩水(37°C)で切開部をすすいでください。
    4. 頸静脈カテーテルの前端の斜め開口部を切り出す。チューブの斜めの端を鉗子で締め付け、頸静脈にスライドさせます。
      注:このステップでは、カテーテルのスライドを容易にするために別の人が必要な場合があります。
    5. カテーテルを前進させながら、肘の顕微手術用鉗子をゆっくりと引き抜き、鉗子で血管の外表面をクランプする。
      注:正しい血管が選択され、カテーテルの先端が血管に正常にスライドした場合、カテーテル挿入プロセス全体が流れの抵抗を感じることはありません。
    6. PUチューブの最初の青いマーク(図1B)に当たったら、カテーテルの挿入を停止します(長さは約3.0cmです)。
    7. 挿入したカテーテルを鉗子を用いて尾側と吻側の両方の結紮で静脈に固定する。
    8. 縫合針(1/2湾曲切断、12mm)を用いて切開部の右側の露出組織を通して6-0縫合糸を通し、結紮を止血剤で結ぶ。
    9. 2番目の青いマーク(図1B)でカテーテルを曲げて、同じ合字で結合し(ステップ3.3.8)、PUチューブを閉塞しないようにします。
    10. 余分な縫合糸をすべて切り取り、先端が鈍いシリンジを22Gステンレス製のプラグに交換してカテーテルを閉じます。
  4. カテーテル外装
    メモ: この部品の推定動作時間は 10 分です。
    1. ラットを背側の位置に置き、75%の医療用アルコールに浸した綿球で肩甲骨の間の領域を優しくきれいにする。
    2. 外科用はさみで背頸部の中心に非常に小さな切開を行います。背側切開部を通して、皮膚の下のトロチャーを首の右側の腹側切開部に向かって導き、優しく押し込む。
    3. 静脈カテーテルをトロチャーに入れ、静脈カテーテルを引き出し、背部切開部に導く。
    4. 縫合糸と同じ方法で外装カテーテルを筋肉層に固定します(ステップ3.3.8および3.3.9の手順を参照)。
    5. 腹側および背部切開部の皮膚層を6-0ナイロン縫合糸および縫合針(3/8湾曲切断、17mm)で閉じる。すべての外科的切開部をヨードフォアで拭きます。
      注:創傷クリップは、皮膚切開を閉じるための代替方法です。
    6. カテーテルを指先で握りしめてカテーテルプラグを外します。新しい鈍い先端のシリンジを置き、ゆっくりとシリンジを引き戻して血流をテストします。
      注:ラットは仰臥位にあるため、血液サンプルを取得できない場合があります。血液サンプルは、サイドボディの位置に変更することによって得ることができた。
    7. カテーテルを再び指先で持ち、先端が鈍いシリンジを使用して、0.2 mLのヘパリン処理生理食塩水と0.1 mLのロック溶液をカテーテルに注入します。
    8. 指先でカテーテルを持ち、シリンジをステンレス製のプラグと交換します。カテーテルのクランプを外し、プラグをわずかに押し込んでカテーテルの気密性を確保します。

4. 手術直後のケア

  1. ラットを背側褥瘡の位置に回復させるには、新鮮なトウモロコシの穂軸寝具で個別にケージに入れます。多くの場合、深部体温を維持するために温度調節された加熱パッドを提供する。
    注:動物福祉のために、寝具に食べ物や水を残すことは、飲食時に首の動きによって引き起こされる痛みを和らげる効果的な方法です。
  2. 手術の終了時間を記録し、ラットを2時間間隔で少なくとも4時間監視する。ラットが痛みや苦痛の兆候を示している場合は、回復のための追加の鎮痛を提供します。

5. 回復期の生理学的および血液学的モニタリング

  1. 体重と食物と水の摂取量を毎日監視し、データを記録します。
  2. 血液学的検査のために少量の新鮮な血液を採取するには、ラットを拘束器に入れる。プラグを開き、シリンジを静脈PUカテーテルに挿入して、カテーテルが妨げられていないことを確認します。
    注:採血は6日間連続して毎日同時に行った。
  3. 血液、ヘパリン化生理食塩水、およびカテーテルロック溶液の混合物を含む最初の抜き取り血液を捨てる。
  4. 新しいシリンジを使用して150 μLの新鮮な血液サンプルを収集し、チューブ壁に乾燥させたK2EDTA(1.8 mg/mL血液)スプレーを含む0.5 mLチューブに血液サンプルを移します。
    注:カテーテルが閉塞している場合は、0.2mLのヘパリン処理生理食塩水をカテーテルに注入して、次の採血時間の数分前にカテーテルを洗い流すことができます。
  5. 吸引された血液を補うために同じ容量の滅菌生理食塩水を注入する。予め加温した通常生理食塩水(37°C)150 μLを注入し、カテーテルを通して滅菌ヘパリン処理した通常生理食塩水0.2 mLを注入する。
  6. 100 μLのロック溶液をカテーテルに注入して、次のサンプル採取前にカテーテルのシールと無菌性を確保します。
  7. 自動血球カウンターを使用して、収集から2時間以内に血液サンプルを分析します。

6. 経口投与薬物の薬物動態学的研究のための反復採血

注:体重増加>10gで血液学的レベルが安定したラットは、将来の研究のために登録されることが示唆される。現在のプロトコルに従って、JVCラットは回復するのに4〜6日かかりました。

  1. 手術の4〜6日後、ラットを水に無料でアクセスして12時間絶食させる。
    注:実験目標に応じて、動物の断食はオプションです。
  2. 絶食中のラットを天然フェノール生理活性エラグ酸で6mg / kgの用量で直立経管栄養針で経口経管栄養する16。
  3. 経口投与後24時間にわたって予め決定された時点で、頸静脈カニューレ を介して ヘパリン処理チューブ内の血液サンプル200μLを採取する。採血プロセスは、ステップ5.5の手順に従います。
    注:採血が完了するまで、カテーテルをロック溶液で閉じる必要はありません。
  4. 直ちに血液サンプルを3000 x g で4°Cで10分間遠心分離する。
  5. 抽出した血漿試料を液体クロマトグラフィー・質量分析法17,18により分析する。

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結果

このプロトコルは、連続採血のための顕微手術スキルを使用して長期的なJVCモデルを確立する方法を徹底的に実証しました。 図1Aは 、手術を行うために使用される必須の手術器具および材料を示す。3つの青いマークが付いたPUカテーテルの仕様も示されており、これは、ステップ3.3.で静脈カニューレを配置するように研究者を導くのに役立ち、PUカテーテル上のマークを使用してカニューレを導く方法(図1B)。また、JVC ratモデルを確立するために必要なタイムラインに注意することも重要です(図1C)。JVCの動作時間は約35分ですが、研究者が熟練している場合、適切なトレーニングですぐに使用できる尾の切り取りや眼窩洞穿刺などの非外科的アプローチと比較して、JVCラットモデルが使用できるようになるまでに10〜14日(適応および回復段階)かかります。

術後6日間にわたる生理学的および血液学的状態も調査した(<...

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ディスカッション

容器のカニュレーションのテクニックを習得するには、かなりの練習が必要であり、各操作から教訓を学ぶ必要があります。Christakisらは、累積和(CUSUM)分析を用いて、研究者が薬物候補のPK評価の準備をする前に、1年間にわたって200匹のラットを練習する必要があることを発見しました20。しかし、静脈カニューレに必要な操作時間は、13、20を行うラットの数によって大幅に短縮することができる。我々のプロトコールを用いて、頸静脈を効果的にカニューレし、血液サンプルを採取することの成功率は、約50%から80%以上に増加し(実施したラットの総数は15匹であった)、最初の操作時間は2時間から35分に短縮された。

JVC ラットモデルを確立するデモには、いくつかの重要なステップが含まれます。まず、頸部の周りの切開領域は、最初に頸静脈の位置を特定するために重要である。右のJVCが行われる場合、切開領域は、一般に、頸部正中線の右側に...

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開示事項

著者らは開示するものは何もありません。

謝辞

この研究は、中国国家自然科学財団(No. 82003692)からR.X. Zhangへの支援を受けています。ノースウェスタン工科大学のトップアカデミック奨学金をR. Miaoに授与。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
EDTA抗凝固剤が入った0.5mL試験管新康N/A血液検査用血液サンプルの採取
0.5*20 mm 1.0 mLシリンジKLMEDICALN/A液体を生理食塩水に交換または洗浄
0.6*28.5 mm 5.0 mLシリンジHDN/A皮下注射
1.0mL 鈍い先端注射器 (22G)skillsmodelS4-PKT22G生理食塩水を注入し、カテーテル
1.5mL滅菌微量遠心チューブAxygenMCT-150-C-S滅菌カテーテルロック溶液ヘパリン食塩水とメロキシカム溶液
1.5 mLマイクロ遠心チューブバイオシャープBS-15-M採血
1/2 サークルカット5 * 12 mm縫合針スキルモデルS4-FHZカテーテルを固定するために筋肉層を通す
/8サークルカット7 * 17 mm縫合針スキルモデルS5-FHZ縫合ネズミ皮質の切開
6-0滅菌非吸収性シルク縫合糸JUNSHENGN / A結紮糸
75%医療用アルコールHONGSONGN / A消毒
粘着テープLIUTAIN / Aラットの位置決め
クレーブ滅菌テープシャープBS-QT-028アイテムをマークします
自動血球カウンターシスメックスXN-550血液学テスト
ストロビエホマイクロはさみスキルモデルWA1010血管の開口部を切る
遠心分離機サーモフィッシャーサイエンティフィック75002402血漿製剤
クリーンクッションQingjieN/A手術エリアの準備
コットンボールHCN/A創傷の消毒と滅菌
綿棒BEITAGOGON/A消毒
湾曲止血器skillsmodelN/A結紮糸
DN50 ステンレス製ラット拘束skillsmodelS4-RGDQ1ラットの動きを制限して操作を容易に
エラグ酸アラジンE102710-25g経口投与用天然フェノール
半湾曲鉗子skillsmodel53072筋肉層と組織を持ち上げ、頸静脈を分離し、縫合糸
を結びます加熱パッドウォームメイトN/A動物の熱損失を防ぐ
ヘパリンナトリウムSolarbioH8060抗凝固剤
ヨードフォアXidebaoN/A傷口をきれいに
虹彩はさみskillsmodel54002ブルーエント分離 筋肉層
イソフルランRWDR510-22-16麻酔
LEDランプEMPERORFEELN/Asugery
液体クロマトグラフィー-質量分析サーモフィッシャーサイエンティフィックVQF01-20001/TSQ02-10002血漿中の薬物濃度の検出
メロキシカムHongqiangN/A鎮痛剤
生理食塩水KLN/A溶液を準備し、血管を乾燥から保護する
ペットカミソリCodos3180毛皮を剃る
リン酸緩衝生理食塩水ZHHCPW012エラグ酸溶液の調製
PUカテーテルスキルモデルRJVC-PU頸静脈カニューレ挿入
小動物手術 麻酔コンソールRWD68620操作ワークステーション
スプレーボトルその他N/A無菌ワークステーション
ステンレス製プラグ (22G)スキルモデルS4-PKD22Gカテーテルを差し込んで密閉性を確保
ステンレス製トロチャースキルモデルS$-PKDGZカテーテルの外装化をガイド
します 滅菌ロックソリューションスキルモデルSK-FBカテーテルをロックして無菌性を確保します
ストレートフィーディングニードルスキルモデルN/A経口強制手術
ポーチBKMAMN/A手術器具の滅菌のための容器
外科用ハサミskillsmodelJ21070ラットの皮膚に切開を切る
血管拡張器バランス鉗子skillsmodelWA3020血管を拡張し、カニューレをZS-MVでスライドするようにガイド
小動物麻酔器ZSLab1057003麻酔を誘発し、維持します
3オートバイオ滅菌カ具 する 法 します

参考文献

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