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生体分子モデリングの重要なスキルは、タンパク質中の活性部位の表示とコメント付けです。この技術は、高分子視覚化のための4つの一般的なフリープログラムを使用して実証されています: iCn3D, Jmol, PyMOL, および UCSF ChimeraX.
生体分子可視化技術は、構造機能関係や分子相互作用など、生物科学の主要な概念を理解する上で最も重要です。様々なプログラムにより、学習者は3D構造を操作することができ、生体分子モデリングはアクティブな学習を促進し、計算能力を構築し、2次元の教科書画像と生命の3次元の間のギャップを埋めます。この分野の重要なスキルは、タンパク質活性部位をモデル化し、結合相互作用を示す方法で、小分子、またはリガンドと相互作用できる高分子の部分を表示することです。このプロトコルでは、このプロセスを、iCn3D、Jmol/JSmol、PyMOL、UCSF ChimeraXの4つの自由に利用できる高分子モデリングプログラムを用いて記述します。このガイドは、特定のプログラムの基礎を学ぶ学生と、カリキュラムに生体分子モデリングを組み込んだ講師を対象としています。このプロトコルを使用すると、ユーザーは特定の視覚化プログラムを使用してアクティブなサイトをモデル化したり、利用可能なフリープログラムのいくつかをサンプリングしたりできます。このプロトコルで選ばれたモデルは、解糖の第一段階を触媒する酵素ヘキソキナーゼのアイソフォームであるヒトグルコキナーゼです。酵素は、その基質の1つと非反応性基質アナログに結合し、触媒複合体における相互作用を分析することを可能にする。
分子世界の表現を理解することは、生体分子科学1の専門家になるために重要である。高分子の紹介は、通常、細胞膜、小器官、高分子などの2次元教科書画像の形で紹介されますが、生物学的現実は、これらは3次元構造であり、その特性を理解するには3Dモデルから意味を視覚化して抽出する方法が必要です。
したがって、上位部門の分子ライフサイエンスコースにおける生体分子視覚リテラシーの発達が注目を集めており、ビジュアライゼーションスキル1、3、4、5、7、8、9の教育と評価の重要性と難度を報告する記事が数多くあります。 .これらの記事に対する反応は、教室の介入の数が増加しており、通常は単一の機関で1学期以内に、分子可視化プログラムとモデルを使用して困難な概念2、10、11、13、14、15をターゲットにしています。 .さらに、研究者たちは、学生が生体分子可視化プログラムおよび/またはモデルを使用して特定のトピック16、17、18、19にアプローチする方法を特徴付けようとしました。私たち自身のグループBioMolVizは、視覚リテラシーのテーマを学習目標と目標に細分化して、そのような介入を導く目標と目的に細分化するフレームワークを説明し、視覚リテラシースキルを測定するための評価の後方設計においてフレームワークを使用するように教員を訓練するワークショップを主導しています。
この研究の中心にあるのは、生体分子可視化のためのプログラムを使用して高分子の構造を操作する能力という重要なスキルです。これらのツールは、さまざまなプラットフォームを使用して個別に開発されました。したがって、操作と使用において、かなりユニークなことができます。このため、プログラム固有の命令が必要となり、ユーザーが使い慣れやすいプログラムを識別することが、継続的な実装を容易に行うことが重要です。
3Dで構造を操作する(モデルの回転、選択、変更)の非常に基本的な点を超えて、タンパク質の活性部位をモデル化することが大きな目標です。このプロセスにより、学習者は、バイオモルヴィズフレームワークによって記述された3つの包括的なテーマ(分子相互作用、リガンド/修飾、および構造機能関係20,21)において理解を深めることを可能にする。
生体分子可視化のためのプログラムの4つの一般的な選択肢は、次のとおりです: Jmol/ JSmol23、 iCn3D24、 PyMOL25、および UCSF キメラ26,27.我々は、キメラに新しい人々がUCSF ChimeraX、プログラムの現在サポートされているバージョンであるキメラ分子可視化プログラムの次世代を使用することをお勧めします。
本プロトコルでは、これら4つのプログラムのそれぞれを用いて、結合基板アナログ複合体(PDB ID:3FGU)を有するヒトグルコキナーゼの活性部位をモデル化し、特定の結合相互作用を示す測定値を表示する方法を示す。モデルは酵素の触媒複合体を表す。触媒前の状態で活性部位を捕捉するために、ATPの非加水分解可能なアナログをグルコキナーゼ活性部位に結合した。このホスホアミノホスホン酸アデニルエステル(ANP)は、この位置で通常のリンと酸素の結合の代わりにリンと窒素の結合を含んでいます。活性部位には、グルコース(モデル内で示されるBCG)およびマグネシウム(MGと表記)も含まれています。また、この構造にはカリウムイオン(K)があり、結晶化溶媒に使用される塩化カリウムから生じる。このイオンは生物学的機能に重要ではなく、活性部位の外側に位置しています。
図1: ATP/ANP構造体 アデノシン三リン酸(ATP)構造と比較してホスホアミノホスホン酸アデニル酸アデニル酸エステル(ANP)。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
このプロトコルは、基質アナログ複合体の結合リガンドの選択と結合複合体の5Å内の活性サイト残基の同定を実証し、疎水性およびファンデルワールス相互作用を含む関連する分子相互作用を行うことができるアミノ酸および水分子を捕捉する。
ディスプレイは、最初は漫画表現でタンパク質の大部分を示すために操作され、活性部位アミノ酸残基は、タンパク質の関連する原子を示し、分子相互作用を強調するためにスティック表現で。各プログラムのプロトコルのステップ3の後、これらの表現が適用され、タンパク質のビューはプログラム間で類似しています(図2)。プロトコルの最後に、タンパク質の漫画は、ビューを簡素化し、アクティブなサイトに焦点を当てるために非表示になります。
図2: プログラム間の構造比較 「表現の調整」ステップ(各プロトコルのステップ2または3)に続く各プログラムにおける3FGUの構造の比較。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
CPK着色は、活性部位アミノ酸および結合リガンド29、30に適用される。この着色スキームは、ライン、スティック、ボールとスティック、およびスペース充填表現で示される分子モデルにおける異なる化学元素の原子を区別します。水素は白、窒素は青、酸素は赤、硫黄は黄色、リンはCPKの着色スキームではオレンジ色です。伝統的に、黒はカーボンに使用されていますが、現代ではカーボンカラーリングが異なる場合があります。
水素原子は結晶構造では見えませんが、これらのプログラムはそれぞれその位置を予測することができます。大きな高分子構造に水素原子を加えることは、ビューをあいまいにすることができるため、このプロトコルには表示されません。したがって、水素結合は、これらの構造における2つのヘテロ原子(例えば、酸素から酸素、酸素から窒素へ)の中心から測定することによって示される。
プログラムの概要
ダウンロード可能なグラフィカル ユーザ インターフェイス(GUI): PyMOL (バージョン 2.4.1)、キメラX (バージョン 1.2.5)、および Jmol (バージョン 1.8.0_301) は GUI ベースの分子モデリングツールです。これらの 3 つのインターフェイスは、入力型付きコードのコマンド ラインを備えています。同じ機能の多くは、GUI のメニューとボタンを通じて使用できます。これらのプログラムのコマンド ラインの一般的な機能は、キーボードの上下方向キーを使用して、以前のコマンドを読み込んで再実行する場合です。
Webベースの GUI:iCn3D(I-see-in-3D)は、Web上で3次元の高分子構造や化学物質をインタラクティブに表示するためのWebGLベースのビューアで、別のアプリケーションをインストールする必要はありません。完全な Web バージョンは編集可能なコマンド ログを備えていますが、コマンド ラインは使用しません。JSmol は、Web サイトや Web ブラウザ ウィンドウで使用する JavaScript または HTML5 バージョンの Jmol であり、Jmol との動作に非常に類似しています。JSmol は、アニメーションを含むオンライン チュートリアルを作成するために使用できます。
プロテオペディア31、32、Jmol33の最初の視線、およびミルウォーキーバイオ分子モデリング工学センターのJSmolウェブインターフェース(JUDE)は、Jmolベースのオンライン設計環境34の例である。プロテオペディアウィキは、ユーザーが高分子構造をモデル化し、ウェブサイト35内でこれらのモデルをフィーチャーしたページを作成することを可能にする教育ツールです。JSmolを使用して構築されたプロテオペディアシーンオーサリングツールは、Jmol GUIでは利用できない追加機能を備えたGUIを統合します。
Jmol および iCn3D は Java プログラミング言語に基づいています。JSmol は Java または HTML5 を使用し、PyMOL と ChimeraX は Python プログラミング言語に基づいています。これらの各プログラムは、4桁の英数字PDB ID36、37の下でRCSBタンパク質データバンクからダウンロードすることができるタンパク質データバンクファイルをロードします。最も一般的なファイルの種類は、.pdb拡張子を含むタンパク質データバンク(PDB)ファイルと.cif拡張子を含む結晶学的情報ファイル(CIFまたはmmCIF)です。CIF は、プロテイン データ バンクの既定のファイルタイプとして PDB に置き換わりましたが、両方のファイル形式がこれらのプログラムで機能します。PDBファイルとは対照的に、CIFを使用する場合のシーケンス/構造の表示方法に若干の違いがあります。ただし、ファイルは同様に機能し、相違点についてはここでは詳しく説明しません。分子モデリングデータベース(MMDB)は、国立バイオテクノロジー情報センター(NCBI)の産物であり、カテゴリ情報が関連付けられているPDB構造のサブセット(例えば、生物学的特徴、保存タンパク質ドメイン)38である。iCn3D は、NCBI の製品で、MMDB データを含む PDB ファイルをロードすることができます。
モデルを表示するには、ユーザーは、構造の専用のタンパク質データバンクページから目的のファイルをダウンロードし(例えば、https://www.rcsb.org/structure/3FGU)、その後、プログラムのドロップダウンファイル メニューを使用して構造を開くことができます。すべてのプログラムは、インターフェイスを通じて直接構造ファイルをロードする機能があり、そのメソッドはプロトコル内で詳細に説明されています。
キメラX、Jmol、PyMOL の各 GUI には、コーナーをドラッグしてサイズを変更できるコンソールの 1 つ以上のウィンドウが含まれています。iCn3D と JSmol は完全に Web ブラウザに含まれています。iCn3D を使用する場合、ユーザーは画面のサイズと解像度に応じて、ポップアップ ウィンドウ内をスクロールしてすべてのメニュー項目を表示する必要があります。
ここで詳述するプロトコルは、各プログラムを用いて酵素の活性部位を表示する簡単な方法を提供する。なお、各プログラムでステップを実行する方法は複数ある。たとえば、ChimeraX では、ドロップダウン メニュー、上部のツールバー、またはコマンド ラインを使用して同じタスクを実行できます。特定のプログラムを詳細に学習することに興味があるユーザーは、これらのプログラム39、40、41、42、43、44、45、46で利用可能なオンラインチュートリアル、マニュアル、Wikiを探索することをお勧めします。
これらのプログラムの既存のマニュアルやチュートリアルでは、このプロトコルの項目を個別のタスクとして示します。アクティブなサイトを表示するには、ユーザーはさまざまなマニュアルやチュートリアルから必要な操作を合成する必要があります。この原稿は、分子相互作用を持つラベル付きアクティブサイトをモデリングするための線形プロトコルを提示することによって利用可能な既存のチュートリアルを増強し、他のモデルやプログラムに適用できるアクティブなサイトモデリングのためのロジックをユーザーに提供します。
図3:キメラックスGUI ドロップダウンメニュー、ツールバー、ストラクチャービューア、コマンドラインにラベルが付いたChimeraX GUIインタフェース。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4: iCn3D GUI. iCn3D の GUI インターフェイスドロップダウン メニュー、ツールバー、構造ビューアー、コマンド ログ、選択セットのポップアップ、およびシーケンスと注釈のポップアップ メニューのラベルが付いています。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5: Jmol GUI ドロップダウンメニュー、ツールバー、ストラクチャービューア、ポップアップメニュー、コンソール/コマンドラインがラベル付けされたJmol GUIインタフェース。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:PyMOL GUI ドロップダウンメニュー、ストラクチャービューア、名前/オブジェクトパネル、マウスコントロールメニュー、コマンドラインラベル付きPyMOL GUIインタフェース。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
注:各プログラムのプロトコルは、10の包括的なステップで概説されています, (1) プログラムに構造をロードします, (2) アクティブな部位のリガンドを識別する, (3) 表現を調整する, (4) 5 Å内の残基を選択して活性部位を定義する, (5) 活性部位リガンドとの酵素の相互作用を示す, (6) 側面鎖を棒として表示し、活性な位置を示す (7)構造を簡略化し、(8)ラベリングリガンドおよび水素結合側鎖、(9)任意の時点でレンダリングを保存して、その上で作業に戻るか、他の人と共有する、(10)埋め込みまたは印刷するための画像を保存する。ステップ 1、4、7-10 は、各プロトコルで同じです。ただし、各プログラムの固有の動作により、手順 2/3 と 5/6 を交換する場合に、一部のプロトコルの方が効率的に実行されます。
1. UCSF キメラX プロトコル
メモ:トラックパッドとマウスコントロール。回転するには、クリックしてドラッグするか、2 本指でドラッグします(マウス: 左クリックとドラッグ)。ズーム、ピンチとスプレッド(Mac)またはコントロール+2指の動き(PC)(マウス:スクロールホイール)。変換するには(つまり、構造全体を移動)、オプションを押してクリックしてドラッグ(Mac)またはシフト+クリックアンドドラッグ(PC)(マウス:右クリックしてドラッグ)。再センタを再設定するには、インターフェイスの上部にあるドロップダウン メニューを使用して [ アクション] をクリックします> ビュー 。
2. iCn3D プロトコル
メモ: トラックパッドとマウスコントロール:回転するには、クリックしてドラッグします(マウス:左クリックとドラッグ)。ズーム、ピンチ、スプレッド(マウス:スクロールホイールを回転させる)を行います。(つまり、構造全体を移動) をクリックして 2 本の指でドラッグする (マウス: 右クリックしてドラッグ)。中央に移動するには、上部のドロップダウン メニューの [表示] にカーソルを合わせて、[ 中央の選択] をクリックします。
3. Jmolプロトコル
4. PyMOL プロトコル
注:トラックパッドとマウスコントロール:回転、クリックしてドラッグ(マウス:左クリックとドラッグ)。ズームするには、ピンチとスプレッド(マウス:右クリックしてドラッグ)。変換(すなわち、構造全体を移動)、コントロール+クリック&ドラッグ(マウス:コマンド+左クリックとドラッグ)を制御します。再センタリセンタを表示するには、右側のオブジェクトパネルに移動し、[方向] または[中心]をクリックします>。
各プログラムに対して正常に実行されたプロトコルは、アクティブサイト上で分子モデルが拡大され、活性部位の残基とリガンドがスティックとして表示され、タンパク質漫画が隠され、リガンドが対照的な配色で表示されます。相互作用するアミノ酸残基は、その識別子、およびラインで示される水素結合およびイオン相互作用で標識されるべきである。これらの特徴の存在はモデルの目視検査によって決定することができる。
この検査を容易にし、ユーザーがプロトコルの手順を正しく実行したかどうかを判断できるように、各手順に従って構造のイメージを示すアニメーション図を提供しました。キメラックス、iCn3D、Jmol、およびPyMOLの場合、これはそれぞれ 図7-10に示されています。
図7:キメラXプロトコル出力 ChimeraX プロトコルのステップ 1.1 ~1.8 を示すアニメーション図。 こちらをクリックして、この図をダウンロードしてください。
図8:iCn3D プロトコル出力 iCn3D プロトコルのステップ 2.1~2.8 を示すアニメーション図。 こちらをクリックして、この図をダウンロードしてください。
図9: Jmol プロトコル出力 Jmol プロトコルのステップ 3.1~3.8 を示すアニメーション図。 こちらをクリックして、この図をダウンロードしてください。
図10:PyMOLプロトコル出力 PyMOL プロトコルのステップ 4.1~4.8 を示すアニメーション図。 こちらをクリックして、この図をダウンロードしてください。
これらのプロトコルの結果に影響を与える可能性がある最も一般的なエラーは、誤った選択であり、その結果、構造の一部が望ましくないレンダリングで表示されます。これは通常、構造自体または表示メニュー ボタンのいずれかで誤ってクリックした結果です。最適でない結果の例としては、アクティブな部位の外側に残基が棒として表示されているモデルが挙されます。ユーザーは、スティックとして表示された残基を視覚的に検査し、それらが活性部位リガンドの近くにあることを確認することによって、このエラーが発生したかどうかの分析を開始することができます。表示された残基が活性部位リガンドの5Å以内にあるかどうかを評価する高度な方法は、各プログラムに組み込まれた測定ツールを使用して、近くのリガンドと活性部位残基との距離を測定することです。測定ツールはこの原稿の範囲を超えています。ただし、この種の分析を詳しく説明する多くのオンライン チュートリアルを、関心のあるユーザーに紹介することをお勧めします。
PyMOLの名前/オブジェクトパネルを誤ってクリックした結果、このプロトコルの最適でない実行の具体的な例を示します。このエラーは、 図 11に示すように、この表現を使用してアクティブな部位だけを表示するのではなく、タンパク質全体を棒として表示します。
図11: 負の結果 負の結果の例。PyMOLで完全な漫画を誤って選択し、スティックを表示します。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
トラブルシューティングを行うには、モデル全体のスティック (名前/オブジェクト パネルに 3FGU というラベルが付いている) を非表示にし、PyMOL の非表示ボタンと表示ボタン/コマンドを使用して、"active" という名前の選択のスティック表現のみを表示する必要があります。このタイプのエラーからモデルを回復することは、ユーザーがモデルのさまざまな部分に対して適切な選択を作成し、効果的に表示および非表示にできるようになると、比較的簡単です。プロトコルを再起動し、別の時間の手順を実行する必要があります。ただし、ユーザーは「オフスクリプト」に進み、モデルを試すことを恐れないことをお勧めします。私たちの経験では、表示エラーを通して作業することで、モデリングプログラムの理解を容易にします。
各プログラムの正常に実行されたプロトコルからの最終的な出力を横に並べて表示する 図 12を参照してください。ビューの向きは、ユーザーが異なるプログラムで作成されたモデルの外観を比較できるように、同様に向けられています。
図12: プログラム間の最終的な構造比較 プロトコルの最後でのアクティブな各サイトレンダリングの構造の比較。A:キメラックス、B:iCn3D、C:Jmol、D:PyMOL。PyMOL活性部位ラベルは、活性部位残基およびリガンド全てを含む。他の出力は、水素結合側鎖のみを標識しています。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
著者らは、本論文に記載されている研究に関連する関連または重要な財政的利益はないと宣言している。
生体分子モデリングの重要なスキルは、タンパク質中の活性部位の表示とコメント付けです。この技術は、高分子視覚化のための4つの一般的なフリープログラムを使用して実証されています: iCn3D, Jmol, PyMOL, および UCSF ChimeraX.
この研究のための資金は、国立科学財団によって提供されています:
学部STEM教育助成金の向上(賞#1712268)
学部生物学教育学部における研究連携ネットワーク(賞#1920270)
私たちは、Jmolに関する有益な議論のために、ウェストフィールド大学博士のカルステン・テイスに感謝しています。
| ChimeraX (Version 1.2.5) https://www.rbvi.ucsf.edu/chimerax/ | |||
| Computer | Any | ||
| iCn3D (web-based only: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/icn3d/full.html) | |||
| Java (for Jmol) https://java.com/en/download/ | |||
| Jmol (Version 1.8.0_301) http://jmol.sourceforge.net/ | |||
| マウス (オプション) | Any | ||
| PyMOL (Version 2.4.1 - educational): https://pymol.org/2 education use version: https://pymol.org/edu/?q=educational |
