毒性試験および表現型薬物スクリーニングのためのiPS細胞由来心筋細胞におけるカルシウムシグナルのハイスループット光学制御および記録(英語)

ヒト人工多能性幹細胞(iPSC)由来のモデルは、動物実験で定められた3Rの目的(置換、縮小、精製)に対する有望なソリューションと考えられています^1,2。iPS細胞由来の心筋細胞は、ヒト生物学の本質的な側面を再現するため、疾患モデリングや創薬に使用されています³。カルシウムイメージングは、典型的には化学染料を用いて、薬物治療前後の細胞活性を観察するために使用されてきた^4,5。しかし、化学色素ベースのカルシウムセンシングプローブは、Na、K-ATPaseを直接阻害し、細胞機能を破壊します⁶。したがって、化学染料を使用する場合、同じ細胞を数時間または数日にわたって追跡することは問題でした。ここでは、遺伝的にコードされたカルシウムインジケーター(GECI)⁷、^8、9、10の範囲が、幅広い励起/放出およびカルシウム親和性スペクトルにわたって利用され^、長期間にわたるリアルタイムの多細胞小器官測定を提供する心毒性試験プラットフォームを形成します¹¹。

赤方偏移カルシウムインジケーターR-GECOまたはK-GECOと光遺伝学的ツールChR2^12,13の共発現による光学制御およびカルシウムイメージングのための遺伝的にコードされたツールを使用して、iPSC-CMモデルにおけるハイスループットカルシウムベースのスクリーニングコンセプトを以前に実証された学術的文脈を超えてさらに発展させるために、既製のウイルスキットが作成されました。イメージングを自動マイクロ流体システムを備えたハイコンテント機器に移行することにより、化合物添加のシングルチャンネルピペッティングが生細胞イメージングの上に重ねられます。最後に、実験経路、画像処理、および分析の両方の重要な側面が改善され、自動化されます。

左室非圧迫型心筋症(LVNC)患者のiPS細胞由来心筋細胞(iPSC-CM)は、国立台湾大学病院から提供されました。iPS細胞に再プログラミングするための患者サンプルの収集と研究目的の維持プロトコル¹⁴ は、ヘルシンキのWMA宣言(ヒトを対象とする医学研究の倫理原則)に従い、NTUHの研究倫理委員会事務局(#201612099RINC)によって承認されました。他のiPSC-CMは商用ベンダーから入手した。iPS細胞誘導体の使用には、当院での特定の許可は必要ありません。

1. iPS細胞由来心筋細胞製剤

1. iPSC-CMを解凍のために冷蔵倉庫から取り出す前に、マルチウェルプレートを準備します。96ウェルマイクロプレートの各ウェルを100 μLの50 μg/mLフィブロネクチン/0.2%ゼラチン溶液( 材料の表を参照)でコーティングして、すべての表面を完全に覆います。
2. プレートを加湿インキュベーター内で37°Cで1時間インキュベートします。
3. 細胞融解する前に、培地( 材料表を参照)を室温に30分間温めます。
   注意: 現在のプロトコルでは、室温を25°Cと説明しています。
4. iPSC-CMを液体窒素貯蔵タンクから37°Cの水浴に移します。
   注:iPS-CMは通常、学術的または商業的な情報源によってドライアイスで出荷されます。それらは、使用まで受領時に液体窒素貯蔵庫に移される。
5. 氷が完全に溶ける前にバイアルを取り出し、バイアルに75%エタノールをスプレーします。
6. バイアルをクラスIIバイオセーフティキャビネットに持ち込み、内容物を9 mLの室温培地を含む新しい15 mLコニカルチューブにそっと移します。
7. 細胞を200 x g で室温で3分間遠心分離します。
8. 上清をピペットで廃棄し、10 μMのROCK阻害剤(Y27632)を含む1 mLの培地に細胞を静かに再懸濁します( 材料の表を参照)。
   注意: 最大限の細胞回収を確実にするために、解凍した細胞の繰り返しのピペッティングは避けてください。
9. ウェルからコーティング溶液を取り出し、10 μMのROCK阻害剤を含む50 μLの培地をすばやく加えます。
10. 血球計算^盤15でトリパンブルー排除法を用いて生細胞数を確認する。
11. コーティングされた96ウェルプレート内のプレートセルを、製造元の指示に従って100,000〜150,000セル/ cm²の密度で¹⁶。
12. 24時間後、プレートの表面に付着した細胞が他の細胞と接触していることを確認します。
    注:単一細胞は長期培養では生存率が低く、通常はより多様な挙動を示します。
13. 予熱したメンテナンス培地を2日ごとに交換してください。
    注:長期薬物治療のために、LVNC iPSC-CMは、2日ごとに低分子薬物の有無にかかわらず、半分の培地置換で交換されました。

2. 遺伝子にコードされたカルシウム指標の発現

1. 細胞を72時間プレーティングした後、GECIウイルスキット( 材料の表を参照)を氷上で解凍します。
2. メンテナンス培地で2xウイルスキットストック溶液を調製します。
3. 培地容量をウェルあたり100 μLに調整して、感染用の細胞を準備します。100 μLのプレミックスウイルス溶液を加え、37°Cで8〜16時間インキュベートします。
4. インキュベーション後、200 μLの予熱培地と交換してください。
5. イメージングシステムを使用して、形質導入の24時間後にGECIの発現を視覚化します( 材料表を参照)。
   注:発現レベルは、形質導入後48〜72時間で最大に達します。細胞は24時間の時点から画像化することができる。ただし、GECIから得られた信号は1か月以上持続します。
6. 機能アッセイを実行する前に、加湿インキュベーター内の細胞を維持します。
7. 感染プロトコルを使用して、分化後25日目にiPSC-CM(LVNC患者由来のiPSC-CM)をChR2-K-GECOウイルスキット( 材料の表を参照)に感染させます(ステップ2.1-2.6)。

3. Fluo-4を用いた色素系カルシウムイメージング

1. Fluo-4粉末( 材料の表を参照)をストック溶液(5 mM)としてDMSOに溶解します。
2. ストック溶液をタイロードバッファー中の10 μM Fluo-4の濃度に希釈します。
   注:タイロードのバッファーは、1.0 g / Lの重炭酸ナトリウム、0.2 g / Lの塩化カルシウム、0.1 g / Lの塩化マグネシウム、0.2 g / Lの塩化カリウム、8.0 g / Lの塩化ナトリウム、0.05 g / Lのリン酸一ナトリウム、および1.0 g / LのD-グルコースで構成されています。
3. ハーフ培地を10 μMのFluo-4溶液(最終濃度5 μM)と交換します。
4. 細胞を37°Cで30分間インキュベートします。
5. 事前に温めたTyrodeバッファーで細胞を洗浄し、画像取得前に培地と交換します。
6. ストリーム取得プロトコルで録音を開始します。
   注:ストリーム取得は、インターバル時間なしで画像を継続的に取得することです。iPSC-CMの拍動周波数は約1Hzであり、このストリーム取得プロトコルは拍動パターンを収集するために使用されます。

4. 毒性試験と表現型スクリーニングのための画像取得と機能アッセイ

1. ハイコンテントイメージングシステムのすべてのデバイスの電源を入れます(材料表を参照)。
2. チャンバーの温度が37°Cに達し、5%の_CO2 補給が行われることを確認します。画像取得の前に、システムを2時間平衡状態に保ちます。
   注:熱ドリフトは長期の生細胞観察にとって重要な問題であり、1°Cは焦点面を~1μm変化させる可能性があるため、画像を取得する前にレンズとステージを目標温度に到達させることが不可欠です。
3. イメージングソフトウェア( 材料表を参照)を開き、96ウェルプレートのプレート設定を選択します。
4. 蓋なしの96ウェルプレートをチャンバーに入れ、生細胞シールリングを上にしてロードします。
   注意: 生細胞シールリングは、環境平衡に達するためのアダプターです。
5. 必要な空間分解能に応じて、20倍(図1および図2)、60倍(図3および図4)、および20倍(図5)の水浸対物レンズを選択します。
6. 実験的な取得前に、鮮明な画像を撮影するためにフォーカスを調整します。
7. カルシウム活性記録のために、ウェルごとにランダムに3〜5領域を選択します。
   注: すべての領域には、少なくとも 20 個のセル (n ≥ 20) が含まれている必要があります。
8. さまざまなインジケーターに適切なフィルターを選択します。FITC 475/536 for mNG-GECO, mtGCEPIA3, および Oria1-G-GECO;Cy5 631/692 (NIR-GECO2用)ER 530/593 (ER-LAR-GECO)K-GECO用のテキサスレッド560/624。
9. 使用するイメージングチャネルごとに適切な発光ダイオード(LED)電力を設定します。
   注意: 信号(物体の検出強度)とノイズ(バックグラウンドの検出強度)の比率で画像取得用のLEDパワーを最適化する場合、S / N比は2より高くする必要があります。このプロトコルでは、TRITCおよびFITCの10%のLED電力。Cy5の20%が典型的でした。
10. 心筋細胞で発現するmNG-GECOおよびK-GECOプローブによって報告されるカルシウム過渡現象を観察するために、カメラの露光時間を最大40ミリ秒(25Hz)に設定し、記録時間を30秒に設定します(図1-3および図5)。より高いフレームレートで信号/ノイズが<2の場合は、LED電力を増やします。
11. 光遺伝学的刺激(図2 および 図3C、D)の場合、1Hzでの青色光のパワー(通常は5%〜10%)と周波数を最適化します。
    注:一般的に、ヒトiPSC-CMは~1Hz前後で自発的に拍動し、オペレーターは自発速度よりも速いペースで行動する必要があります。
12. 逐次測定(図3)または拡張測定(図4)を計画している場合は、光毒性を絶対に避けてください。これは、照明パワー強度を下げ、細胞内^Ca2+ 信号の3チャンネルリアルタイム観察に使用されるタイムラプスプロトコルを使用して、たとえばカメラの露光時間を100ミリ秒に増やすことでこれを補うことを意味する場合があります(図4)。
13. 自動マイクロフルイディクスシステム を介した 10 mMカフェイン添加には非同期ディスペンスプロトコルを使用します( 材料表を参照)(図4)。
    注:非同期ディスペンスプロトコルにより、カフェインなどの薬物を添加しながら、画像間にギャップなく画像を取得できます。
14. 取得を開始します。

5. 低分子製剤

1. E4031、ドフェチリド、ベラパミルをDMSOに再懸濁し、タイロードバッファーで希釈します。培地中のDMSOの最終濃度は0.1%(v/v)であった。
2. 化合物溶液を所望の使用濃度の2倍(すなわち2倍)で調製し、添加前に37°Cで平衡化します。
   注:収縮性は温度に依存し、温度変化の影響が急速であるため、培地添加後の温度変動を最小限に抑えることが重要です。
3. 化合物を対応するターゲットウェルに配置します。
4. 自動マイクロフルイディクスシステム(材料表を参照)を介して100 μLの倍強度(2x)化合物をウェルに加え、目的のインキュベーション期間(通常は15分)後に取得を開始します。

6. 画像処理・解析

1. ソフトウェアで時間回転に対するパルスの特徴を自動的に検出することにより、信号領域をバックグラウンドから分離します。
2. カルシウムピーク解析ソフトウェア( 材料表を参照)を使用して、ビート周波数(BPM)、ピーク信号(振幅)、カルシウム過渡持続時間50%(CTD50)、カルシウム過渡持続時間90%(CTD90)、立ち上がり時間、および減衰時間を解析します(図1C)。
   注意: これらの設定では、最初の10秒間で光退色が見られ、その後信号は安定します。従って、カルシウムピークを11〜30秒で分析した。3チャンネル記録(図4)では、強度変化を測定するためにセルの輪郭を手動で境界付けします。

薬物治療の有無にかかわらず、iPS細胞由来心筋細胞(iPSC-CM)によって発現されるmNG-GECO10における自発的なカルシウム振動の観察を図1およびアニメーションビデオ1に示します。 mNG-GECOを使用して得られたキネティックトレースは、小分子イオンチャネル阻害剤であるベラパミル、ドフェチリド、およびE4031が予想どおりにカルシウム過渡現象に影響を与えたことを示しています(図1B)。図1Cに示す典型的なカルシウム過渡現象をカルシウムピーク解析ソフトウェアで解析して、ピーク信号(振幅)、カルシウム過渡持続時間50%(CTD50)、カルシウム過渡持続時間90%(CTD90)、立ち上がり時間、および減衰時間を導き出すことができます。L型カルシウム遮断薬17であるベラパミルは、予想通り細胞内へのカルシウム流入を完全に阻害する(図1B)。ドフェチリドおよびE4031は、hERGチャネル阻害剤18、19、20であり、実験的クラスIII抗不整脈薬として列挙されている。崩壊時間は、ビヒクル群と比較した場合、ドフェチリド(p < 0.05)およびE4031処理(p < 0.001)の両方で延長される。E4031治療によるCTD50(p<0.01)およびCTD90(p<0.001)の延長は、ビヒクルのみと比較して観察され(表1)、これらの結果は、Q波の開始からT波の終了までの長い時間から表面心電図から決定される再分極の臨床的に関連する測定であるQT間隔に対する報告された効果と一致し、 以前の研究では12,21。

自発的に拍動する細胞におけるCTD評価の難しさは、拍動速度がCTDに課す変動性である。これはiPSC-CMモデルで特に問題であり、すべての細胞が同じ親バイアルから来ているにもかかわらず、96ウェルプレートの各ウェルが独自のビートレートを持つことができます。光学的または電気的ペーシングによってビートレートを課すことが可能である。標準化されたペース条件下でのE4031の線量反応を評価するために、iPSC-CMを発現するChR2およびK-GECO7を1Hz 470nmパルスの光を用いて光学制御し、赤色K-GECOシグナルを用いて観察した(図2Aおよび補足図1)。E4031の濃度の増加に伴い、カルシウム過渡現象のピーク振幅の漸進的な減少(p < 0.01)および減衰時間の増加(p < 0.05)が発生します(図2B1)。E4031の線量依存的効果は、ピーク振幅の減少に対して最も明白であった(図2B1、B2)。

数分にわたる短期試験は通常、心毒性の評価に使用されますが、数週間、数か月、または数年にわたる患者の薬物への曝露と並行して、慢性毒性評価には盲点があります。臨床診療に関連する治療期間を反映した間隔での疾患または毒性の影響を研究することは有利であろう。全光学制御・検出システムを用いて、左室非圧迫(LVNC)患者のiPS細胞由来心筋細胞を研究した。iPSC-CMは、分化25日目にK-GECOウイルスキット(ステップ2.2-2.6)で形質導入されました。その後、K-GECOシグナルは、追加の薬物治療の有無にかかわらず、同じウェルで1〜2週間ごとに追跡されました。自発的なカルシウム活性(図3A、3B)と光学ペーシング下でのカルシウム動態(図3C、D、ステップ4.11)の両方を、ハイコンテントイメージングシステム(ステップ4.1-4.12)を使用して取得し、カルシウムピーク分析ソフトウェア(ステップ6)で処理しました。図3A、Cに示すように、明らかなカルシウムトランジェントは、光ペーシングに使用される追加の光の有無にかかわらず、ウイルス形質導入後1か月後に目に見えるままです。この研究では、LVNC iPSC-CMモデルにおいて、拍動速度を増加させ、収縮間隔を規則化し、一過性カルシウム振幅を増加させると思われる薬剤を特定しました(図3A、B)。このデータから行うべき2つの重要な観察があります。第一に、治療の観点から、薬物効果は63日目と70日目の時点で持続的に見えます。第二に、一般的にアッセイが早い時点(典型的には<50日)の短いウィンドウ(<1分)の間に複合効果をもたらす分野との関連性。化合物の疾患表現型修飾効果は60日目以降にのみ明らかであり、標準的なスクリーニングプロトコルで作用機序が遅い薬物を割り引くのは簡単かもしれないことを示唆しています。

拍動周波数の変動性とそれに続くカルシウム過渡持続時間への影響は、任意の時点での井戸間の問題だけではありません。また、iPSC-CMが培養液中で維持されるにつれて変化し、これは時間の経過とともに十分に変化する(図3B)。連続した実験内で一貫性を持たせるために、薬物治療の有無にかかわらず1Hzの光学ペーシングを適用できます(図3C、D)。ここでは、63日目の結果は、有意に高い振幅、より短いCTD90、およびより短い減衰時間を伴うカルシウム過渡現象の有望な傾向を示しています。70日までに、そして希少疾患の薬物スクリーニングプロセス中の慢性評価の必要性を示す、脱分極(EAD)が検出された後の早期。疾患表現型、または低分子評価にペーシングプロトコルを追加することの価値は、拍動速度、カルシウム過渡振幅、CTD90、および減衰時間について 図3B、D に示されている結果の比較によって定性的に評価できます。

カルシウム過渡現象を可視化するための化学色素ベースの方法論と比較して、GECIの利点は、プローブを細胞内の特定のコンパートメントに制限できることです。これは、単一細胞内の複数の色および/または親和性バリアントを多重化することによってさらに拡張することができる。したがって、ER-LAR-GECO9、mtGCEPIA 22,23(またはOria1-G-GECO)、およびNIR-GECO2 8,24を含むいくつかのGECIは、小胞体/筋小胞体(ER / SR)、ミトコンドリア(またはCRACチャネル)およびサイトゾルで生じるリアルタイムカルシウム活性測定のための細胞モデルにおいて、単独で、または組み合わせて発現するために開発されました。これらをiPSC-CMモデル(図4A、C)で組み合わせて、異なる細胞内カルシウム貯蔵間の相互作用を研究することができます。例えば、10mMのカフェイン処理を使用して、SRカルシウム貯蔵庫を空にすることができる。ここで、ER-LAR-GECOシグナルの減少(SRからのカルシウムの損失を示す)は、予想通りNIR-GECOシグナルの低下(細胞質カルシウム濃度の増加を示す)と並行していました。他の細胞内コンパートメントがこれらの変動によってどのように影響を受けるかは十分に研究されていません。それでも、緑色のミトコンドリアを標的とするmtGCEPIA3を含めることは、これらの条件でミトコンドリアでカルシウムの取り込みが起こることを示しています(図4A、B)。

同様に、異なるカルシウム電流間の相互作用を視覚化することは、カルシウム放出活性化チャネル(CRAC)Ca2+電流を明らかにするためにプローブOrai1-G-GECO25を含めることによって見ることができます(図4C、D)。iPSC-CMモデルでは、このシグナルは自発的な細胞質一過性カルシウムとともに増加します(図4D1、D2)。これに合わせて、カフェインによる治療は、細胞質ゾルとOrai1チャネルの両方から大きなカルシウム過過性を呼び起こします。.

心筋細胞モデルにおけるほとんどのカルシウム一過性イメージングは、カルシウム色素を用いて決定されていることが認められている26。iPS細胞由来心筋細胞モデルでは、遺伝的にコードされたカルシウム指標を化学色素と比較し、異なるカルシウムイメージングアプローチを並べて比較できるようにしました。iPSC-CMを発現するK-GECOを、Fluo-4を装填した細胞と一緒にイメージングした。心筋細胞を発現するK-GECOは、経時的に一貫した拍動挙動を示した(図5A、C)。しかし、Fluo-4の負荷は、このモデルの拍動周波数とCTDの両方に影響を与え(図5B、C)、Fluo-4自体がそのような実験の結果に影響を与える可能性があることを示唆しています。これは、イメージングプローブに長期間さらされた後、特に当てはまり、ウェルごとのイメージングがウェルあたりの微小滞留時間で行われる場合、多層イメージングフォーマットで発生する可能性があります。

図1:iPS細胞由来心筋細胞に適用した低分子イオンチャネル阻害剤。 (A-B)25Hzで撮影したmNG-GECOを発現するiPSC-CMのタイムラプス画像。 スケールバー= 50μm。 (B)化合物添加後の代表的なCa2+振動。mNG-GECO発現細胞から得られた蛍光シグナルは、蛍光比F/F0として提示され、F0は基礎強度、Fは各時点で検出された強度として定義されます。(C)カルシウムピーク解析ソフトウェアは、半値幅(CTD50)、90%過渡期間(CTD90)、立ち上がり時間、減衰時間などのパラメータを抽出できます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:光学ペーシングシステム内でhERG阻害剤E4031を使用した用量反応の例 。 (A)異なる濃度のE4031の10%青色光による微量の光刺激。25Hzで撮影されたK-GECOを発現するiPS細胞由来心筋細胞のタイムラプス画像。 (B1)異なる化合物用量で得られたカルシウム過渡現象の代表的な痕跡。振幅(B2)と減衰時間(B3)におけるE4031のピーク分析と線量反応。青いバーは、1Hz 470nmのパルス光刺激を示します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:LVNC患者由来心筋細胞における長期薬物表現型スクリーニングに適用される全光学プラットフォーム。 (A)患者由来心筋細胞における自発拍活動の代表的な痕跡(分化後70日目)5μM薬物治療あり(赤)またはなし(青)。(B)5μM薬物処理の有無にかかわらず、自発拍動活性のピーク分析。(C)1Hzの光刺激下での患者由来のiPSC-CMにおける薬物反応の強度トレース。(D)1Hz光刺激による患者由来心筋細胞のピーク解析。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:iPSC-CMモデルにおける3チャンネルの細胞内Ca2+ イメージング 。 (A-B)iPSC-CMは、細胞質、NIR-GECO2(赤)、小胞体ER-LAR-GECO(黄)、およびミトコンドリアCa2+ 指標であるmtGCEPIA3(シアン)の細胞内カルシウムプローブで形質導入されました。(B)10mMカフェイン処理前後の3チャンネルタイムラプスカルシウムイメージング。(C-D)細胞質、NIR-GECO2(赤)、小胞体ER-LAR-GECO(黄)、およびCRACチャネルインジケーターOrai1-G-GECO(シアン)で形質導入されたiPSC-CMを可視化しました。(D)3チャンネルタイムラプスカルシウムイメージングを撮影した。(D1)自発的な拍動間活動は、NIR-GECO2およびOrai1-G-GECOで観察されました。(D2)ERからのカルシウム流出(ER-LAR-GECOシグナルの減少)は、カフェイン処理時の細胞質カルシウムシグナルの増加を伴いました。. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図5:iPSC-CMにおける遺伝的にコードされたカルシウム指示薬(K-GECO)と化学的カルシウム感受性色素(Fluo-4)の比較。 (A-B) K-GECO(A)およびFluo-4(B)の代表的なカルシウム痕跡が経時的に提示されます。(C)K-GECO形質導入またはFluo-4負荷iPSC-CMのカルシウム過渡解析。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

表1:iPSC-CMモデルにおける一過性カルシウムパラメータに対する化合物添加の影響。有意値は、*(p ≤ 0.05)、**(p < 0.01)、および ***(p < 0.001) で示されます。

アニメーションビデオ1:iPS細胞由来心筋細胞においてmNG-GECOにより自発的なカルシウム活性がビヒクルのみで観察された。グレースケール画像の擬似カラームービーが提供されます。 このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図1:アデノウイルスベクターの模式図。これには、アクチュエータとしてのチャネルロドプシンChR2、全光学アッセイ用のカルシウムレポーターとしての赤色蛍光カルシウムインジケーターK-GECOが含まれます。光感受性イオンチャネルにより、興奮性細胞は可視スペクトルの青緑色範囲の光によって脱分極することができます。これらの実験では470nmの光を用いた。興奮性細胞のカルシウム過渡現象は、緑色の励起光を必要とするK-GECOによって同時にイメージングでき、赤色の発光を生成します。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

LumiSTARは、K-GECO、NIR-GECO、およびLAR-GECOの使用に関する特許保護を申請しています。