ブレフェルジンA注射による腎臓内の分泌タンパク質源の同定

サマリー

腎臓病の病態生物学を理解するためには、サイトカインの分泌に関与する細胞種を特定する必要があります。ここでは、分泌阻害剤であるブレフェルジンAと細胞種特異的マーカーを用いて、腎臓上皮細胞や間質細胞が産生するサイトカインを腎臓組織に定量的に染色する方法について述べます。

要約

慢性腎臓病(CKD)は、米国における死因のトップ10に入っています。急性腎障害(AKI)は、多くの場合回復可能ですが、患者は後年CKDにかかりやすくなります。腎臓上皮細胞は、AKIとCKDの両方で重要なシグナル伝達ノードとして同定されており、これにより、細胞はサイトカインやその他のタンパク質の分泌を通じて疾患の経過を決定できます。特にCKDでは、不適応に修復された尿細管細胞が、トランスフォーミング成長因子ベータ(TGF-β)、結合組織成長因子(CTGF)、およびその他の線維化促進性サイトカインの分泌を通じて疾患の進行を促進することがいくつかの証拠で示されています。しかし、 in vivo で異なる細胞タイプから分泌されるタンパク質の供給源と相対的な数を特定することは依然として困難です。

この論文では、ブレフェルジンA(BFA)を使用してサイトカインの分泌を防ぎ、標準的な免疫蛍光法を使用して腎臓組織のサイトカインを染色する技術について説明します。BFAは、サイトカインや他のタンパク質の分泌に必要な小胞体(ER)からゴルジ体への輸送を阻害します。犠牲の6時間前にBFAを注入すると、AKIのマウスシスプラチンモデルおよびCKDのマウスアリストロキア酸(AA)モデルのTGF βの近位尿細管細胞(PTC)内にTGF-β、PDGF、およびCTGFが蓄積します。解析の結果、BFA+シスプラチンまたはBFA+AAは、BFA+生理食塩水、シスプラチン、またはAA単独と比較して、TGF-β陽性シグナルを有意に増加させることが明らかになりました。これらのデータは、BFAを使用して特定のサイトカインを産生する細胞タイプを特定し、産生されるサイトカインの相対量および/または異なるタイプを定量化できることを示唆しています。

概要

世界人口の>10%が何らかの腎臓病にかかっていると推定され^{ています1}。その急速な発症によって定義されるAKIは、主に治癒可能です。しかし、AKIのエピソードは、患者が後年にCKDを発症する素因となる可能性があります^2,3。CKDはAKIとは異なり、進行性の線維化と腎機能の悪化を特徴とし、腎代替療法を必要とする末期腎疾患を引き起こします。腎臓のほとんどの損傷は、ネフロン^4,5を構成する足細胞や近位尿細管細胞などの特殊な上皮細胞を標的としています。損傷後、生き残った上皮細胞は、サイトカインや他のタンパク質の分泌を通じて修復応答を調整するのに役立ちます。このようにして、生き残った細胞は免疫応答を調節し、細胞外マトリックスの直接的なリモデリングを行い、臓器の回復を助けることができます。

サイトカインは、多細胞生物の成熟、成長、および応答性を調節するために不可欠な小さな分泌^{タンパク質です6,7}。それらは、免疫細胞や上皮細胞など、さまざまな細胞タイプ間でシグナルメッセンジャーとして機能します⁸。サイトカインは主に免疫細胞から分泌されると考えられていますが、長年の研究により、腎臓上皮細胞および間質細胞は、尿細管細胞、間質細胞、免疫細胞などの他の常在腎臓細胞のシグナルとしてサイトカインを分泌することも実証されています^9,10。特に PTC は、AKI¹¹ 以降の開始フェーズと復旧フェーズで重要な役割を果たします。しかし、不適応修復されたPTCは、トランスフォーミング成長因子-β(TGF-β)、血小板由来成長因子-D(PDGF-D)、結合組織成長因子(CTGF)などの線維化促進性サイトカインを分泌し、CKDの進行に寄与することが知られています¹²。したがって、腎臓上皮細胞は分泌されたサイトカインを使用して腎障害を調節します。

腎臓上皮細胞がサイトカインを分泌することは知られているが、分泌タンパク質の研究には技術的な課題があるため、各細胞型の正確な発生源と相対的な寄与を特定することは困難であった¹³。サイトカインの測定に使用される一般的なアプローチであるフローサイトメトリーは、損傷した腎臓、特に線維性の高い腎臓に対して行うのが困難です。サイトカインプロモーターによって駆動されるCreリコンビナーゼでは、サイトカインレポーターマウスは、特定のサイトカインを発現する細胞タイプを同定するためによく使用されます。しかし、レポーターマウスをさまざまなノックアウトバックグラウンドにクロスする必要があること、適切なレポーターが不足していること、および一度に1つのサイトカインしか分析できないという事実のために、レポーターマウスの使用は制限されています。したがって、サイトカインを放出する腎臓細胞を検出するための、シンプルで汎用性が高く、手頃な価格の技術を開発する必要があります。

我々は、in vivoでの小胞体-ゴルジ体輸送を阻害する分泌阻害剤であるBFAの注射により、フローサイトメトリーベースのアッセイで示されているように、腎臓組織中の分泌タンパク質の染色が可能になるという仮説を立て^ました(図1A、B)。この技術は、細胞型特異的なメーカーとともに、損傷した腎臓におけるサイトカイン産生細胞の供給源と相対的な寄与を特定するために使用できます。フローサイトメトリーのサンプルとは異なり、固定組織はタンパク質や細胞構造を保存したまま長期間保持できるため、分泌細胞をより徹底的に調べることができます。この仮説を検証するために、マウスの腎臓をAKI(シスプラチン)のモデルとCKD(アリストロキア酸腎症(AAN))のモデルで損傷させ、BFAを注射し、標準的な免疫蛍光法を用いて染色しました。

プロトコル

すべての動物実験は、ヴァンダービルト大学医療センターの動物管理およびユーザー委員会によって承認された動物使用プロトコルに従って行われました。

1. 動物たち

1. シスプラチンまたはアリストロキア酸誘発性腎症には、8-12週齢のBALB/c雄マウス(体重約25g)を使用してください。
2. マウスが健康で、戦いによる明らかな苦痛や傷の兆候がないことを確認してください。
   注:特に尾部の傷は、ここで説明するプロトコルを妨げる可能性があります。BALB/cマウスを選んだのは、これらのマウスでは注射用の尾静脈を視覚化しやすいためです。ここで説明するプロトコルは、他のマウス系統に対しても機能します。ただし、シスプラチンまたはアリストロキア酸の投与量は、株ごとに異なる場合があります。.

2. シスプラチン注射

1. シスプラチンを滅菌生理食塩水に溶解し、最終濃度1 mg / mLにします。.
   注:シスプラチンは室温では完全には溶解しません。ヒュームフードで取り扱ってください。
2. シスプラチン溶液を37°Cの水浴で温め、シスプラチンが完全に溶解するまで繰り返しボルテックスします。
3. マウスの体重を量り、20 mg/kg 体重 (bw) を注射するために必要なシスプラチン溶液の量を計算します。
4. ポビドンヨード(7.5%)とアルコール(70%)の綿棒をそれぞれ3回交互に使用して腹部の皮膚を消毒します。
5. 25 G針付きのインスリン注射器を使用して、シスプラチン溶液を腹腔内に注入します。.
6. 注射後3日目にセクション4に進みます。

3.アリストロキア酸(AA)注射

1. アリストロキア酸-Iをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に最終濃度0.5 mg/mLで溶解します。
   注:AAはドラフトで取り扱ってください。AA-Iは、腎障害を誘発する主要な形態であるため、使用する必要があります。
2. AA溶液を37°Cのウォーターバスで温め、完全に溶解するまで繰り返し渦巻きます。
3. マウスの体重を量り、5 mg/kg bw を注入するための AA 溶液の体積を計算します。
4. ポビドンヨード(7.5%)とアルコール(70%)の綿棒3xを使用して腹部の皮膚を消毒します。
5. 25 G針付きのインスリン注射器を使用して、AA溶液を腹腔内に注入します。.
6. AAを隔日で合計3回注射します。
7. 最後の注射後42日目にセクション4に進みます。.

4. BFA溶液の調製

1. BFAをジメチルスルホキシドに10 mg / mLの濃度で溶解して、ストック溶液を作ります。
2. ストック溶液は-20°Cで保存してください。
3. BFAストック溶液を滅菌PBSで最終使用濃度1.25 mg/mLで希釈します。
   注:注射の直前に毎回新鮮な作業溶液を準備します。

5. BFAの尾静脈注射

1. 注射する前に、ケージを半分に、半分を加熱パッドから下げて10分間マウスを温め、尾部の血管の血管収縮を引き起こし、注射を妨げる可能性のある体温の低下を防ぐためにマウスを温めます。
   注意: ケージを加熱パッドに置き、ケージの半分がパッドにあり、半分がパッド上にないようにします。そうすれば、マウスが暖かく感じると、ケージの反対側に移動したり、その逆を行ったりすることができます。
2. 適切なサイズの市販の拘束装置を使用してマウスを拘束します。
3. 上記のように、ポビドンヨードとアルコール綿棒を使用して尾を3回消毒します。
4. 尾を水平に持ち、尾側静脈を視覚化します(図1C)。尾の下に光源を使用して、静脈を視覚化します。
5. 28 Gの針を挿入し、針と注射器を静脈と平行にしてヘッドの方向に向けてください。
6. 1.25 mg/mL BFA 溶液 (0.25 mg BFA) を 200 μL 注入します。血液が注射液に置き換わり、注射が成功したことを示すため、静脈が透明になるのを待ちます。
7. 針を取り外し、出血が止まるまでテールをそっと押します。
8. マウスをケージに戻し、追加の出血や苦痛の兆候がないかマウスを監視します。

6.腎臓の犠牲と収穫

1. イソフルランの過剰投与でマウスを安楽死させ、続いてBFA注射の6時間後に子宮頸部脱臼を行います。
   注:6時間の時点は、他の臓器での6時間のBFA治療により、免疫蛍光染色によってそれらを視覚化する細胞内のサイトカインの十分な蓄積が可能になることを示す文献に基づいて選択されました¹⁶。
2. 犠牲の直後に、腹側正中線切開によりマウスの腹部と心臓を露出させます。
3. 心臓穿刺による血中尿素窒素(BUN)アッセイのために100〜500μLの血液を採取します。25 Gの針と1 mLのインスリン注射器を使用して血液を採取します。.凝固を防ぐために、各サンプルに5 μLのヘパリン溶液(100 mg/15 mLのdH₂O)を加えます。
   注:BUNアッセイには最低20μLの血液が必要です。ただし、安楽死後に心臓穿刺によって約500μLを収集できるため、他のアッセイに役立つ可能性があります。できるだけ多くの血液を集めてください。
4. 以下のセクション7で腎臓が採取されるまで、血液サンプルを氷上に保存します。
   1. 血液サンプルを1,300 × g で10分間遠心分離します。
   2. 血漿を穏やかに単離し、以下のセクション17のBUNアッセイを実行する準備ができるまで-20°Cで保存します。あるいは、クレアチニンアッセイのために血漿サンプルを保存します。

7.腎臓の灌流と除去

1. 20mLシリンジを使用して、20mLシリンジを使用して左心室に10〜20mLのPBSをマウスに灌流し、灌流液が透明になるまでします。
2. 鉗子で腎動脈と静脈を乳頭に近づけ、腎臓から離れた側の血管を切断して、腎臓を摘出します。
3. 腎臓嚢を手で、または細い滅菌鉗子で剥がして、そっと取り出します。
4. 抗体に応じて、パラフィン固定包埋組織の調製についてはセクション8に、固定凍結組織の調製についてはセクション10に進みます。
   注:組織処理は、染色に使用する各抗体に対して最適化する必要があります。

8. TGF-βおよびPDGF-D染色用のパラフィン包埋組織

1. きれいなスライドガラスの上に置き、新しいカミソリの刃で水平に切断して腎臓を二等分します。10 mLの4%パラホルムアルデヒド(PFA)の10 mLに半分をPBSに入れ、エンドオーバーエンドローテーターに10回転/分(rpm)の速度で24時間置きます。
   注:切片化には腎臓全体は必要ありません。腎臓の半分は保存したり、他のアッセイに使用したりできます。
2. PFAを70%エタノールに交換します。
3. この段階で、処理とパラフィン包埋のために腎臓半分を提出し、次にミクロトームを使用してパラフィン包埋腎臓組織を4〜6μmで切片化し、それらを事前に洗浄された帯電したスライド^17,18にマウントします。
   注:腎臓は、ヴァンダービルト大学医療センターのトランスレーショナル病理学共有リソースによって処理され、パラフィンに埋め込まれ、室温で保存されました。

9.脱パラフィンと再水和

1. スライドをスライド染色ラックに入れ、D-リモネンを含む染色ウェルに5分間浸漬し、組織が完全に沈むようにします。新鮮なD-リモネンを含むウェルで繰り返します。
2. スライドをエタノール100%(2倍)、95%、90%、70%の段階希釈液にそれぞれ5分間浸して、組織を再水和します。
3. スライドを流れるdH₂Oで5分間洗浄します。
4. クエン酸緩衝液(pH 6.0)中の切片を圧力鍋で121°C、15psi、45分間インキュベートすることにより、抗原賦活化を行います。
5. スライドを流れるdH₂Oで20分間洗浄します。
6. セクション12に進みます。

10. CTGF染色のための凍結組織の調製

1. 新しいかみそりの刃を使用して、水平軸に沿って腎臓を二等分します。
   注:切片化には腎臓全体は必要ありません。腎臓の半分は保存したり、他のアッセイに使用したりできます。
2. 腎臓の半分を15 mLチューブ内の0.5% PFA10 mLに入れ、ローテーターで4°C、10 rpmの速度で2時間静注します。
3. PFAを容器にデカンタンして適切に廃棄し、0.1 Mグリシン10 mLをPBSに1時間、4°C、10 rpmの速度で加えます。
4. グリシンをデカンタントし、PBSに溶解した15%スクロース10 mLを加え、チューブをローテーターに4°C、10 rpmで一晩置きます。
5. 15%スクロースをデカントし、PBSに溶解した30%スクロース10 mLと10 mLで4°Cおよび10 rpmで1時間交換します。
6. 埋込み型に最適な切断温度コンパウンド(OCT)を充填し、ステップ10.5の腎臓半分を腎臓の切断面を下に向けて埋め込みます。
7. 半腎臓とOCTを含む型を液体窒素のプールに注意深く置き、凍結します。
   注:液体窒素がOCTに直接接触すると、気泡が発生する可能性があるため、OCTに接触させないでください。液体窒素を使用する場合は、ゴーグル/フェイスシールド、極低温手袋、白衣などの適切な個人用保護具を着用する必要があります。型を液体窒素に入れるには、~25 cmの長い鉗子を使用するのが最善です。
8. 固く凍結したら、金型を-80°Cで保管します。

11. 冷凍切片

1. クライオスタットが-20°Cにあることを確認します。
2. OCT中の試料を含む型をクライオスタットに-20°Cで2時間保存し、温度を平衡化します。
3. タブを持って下から押して型を取り外します。
4. 新鮮なOCTを検体ホルダーに置き、凍結した検体ブロックを上に置き、組織側を検体ホルダーの反対側に向けて置きます。
5. 試料ホルダーと試料を冷凍棚に置きます。
6. ブロックの上に加重熱抽出器を配置して、表面を平らにします。温度変動を防ぐために、使用しないときはクライオスタットカバーを閉じたままにしてください。
7. 試料ブロックと試料ホルダーの間の新しいOCTが凍結したら、接続がしっかりと固定されていることを確認してください。
8. 試料ホルダーをクライオスタットミクロトームヘッドにクランプします。
9. 組織が標本ブロックに見えるまで切片化を開始します。
10. 腎臓組織を4〜6μmで切片化し、室温でチャージされたスライド¹⁹に切片をピックアップします。
11. ティッシュをピックアップしたら、スライドを-20°Cから-80°Cで染色する準備ができるまで保管します。染色を開始する準備ができるまで解凍しないでください。
12. 染色する前に、スライドを保管場所から取り出し、室温まで温めます。セクションを乾燥させないでください。
13. 室温に戻したら、すぐに切片をPBSで5分間室温で2回洗浄し、OCT化合物を除去します。
14. セクション12に進みます。

12. 免疫蛍光染色

1. 疎水性バリアマーカーペンで組織切片の輪郭を描きます。組織から疎水性バリアアウトラインまでの距離を少なくとも5mm維持します。
2. 切片の上に1%ウシ血清アルブミン/トリス緩衝生理食塩水(TBS)に3%ロバ血清と0.1%トリトンを含むブロッキングバッファー50μLを加え、加湿チャンバー内で室温で1時間インキュベートします。
3. 一次抗体をPBSで適切な濃度で希釈します。サイトカインの検出には、TGF-β1(1:200)、PDGF-D(1:400)、およびCTGF(1:200)に対する一次抗体の溶液50μLを使用してください。筋線維芽細胞の標識には、Cy3と1:200で結合したα平滑筋アクチン(α-SMA)に対する一次抗体の溶液50μLを使用します。
4. ブロッキング溶液を取り出し、一次抗体を切片に添加して、円形の疎水性アウトラインから漏れないようにし、加湿チャンバー内で4°Cで一晩インキュベートします。漏れが発生した場合は、疎水性バリアを再度適用してください。
5. PBSで3回5分間洗浄します。
6. 適切な二次抗体をPBSで1:200に希釈します。
7. サンプルを50 μLの二次抗体溶液と室温で1時間、加湿チャンバー内でインキュベートします。
8. PBSで5分間洗浄します。
9. Ca2⁺およびMg²⁺ の濃度でPBS中のフルオレセインと結合した蓮のテトラゴノロブスレクチン(LTL)を10 μg/mLの濃度で希釈します。
   注:Ca²⁺ およびMg²⁺ はLTL結合に必要です。
10. 加湿チャンバー内で、組織を50 μLのLTL溶液と室温で30分間インキュベートします。
11. Ca²⁺ およびMg²⁺ を入れたPBSで5分間洗浄します。
12. 50 μLの4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI、5 μg/mL水溶液)とインキュベートし、DNA/核を室温で5分間染色します。
13. 20 μLの退色防止用マウント試薬をティッシュに添加し、カバースリップをゆっくりと配置して、カバースリップをマウントします。褪色防止剤が固まるまで24時間待ってからイメージングしてください。
    注:レクチン結合は時間の経過とともに劣化し、シグナルが失われる可能性があります。レクチン染色されたサンプルは、マウント試薬をセットした直後にイメージングするのが最善です。シグナルの損失が観察された場合は、Ca²⁺ およびMg²⁺ をマウント試薬に添加して染色を保持できます。

13. 画像取得

1. 倒立顕微鏡( 材料の表を参照)を自動XYステージでオンにします。
2. 20x 目標を選択します。
3. 画像取得ソフトウェアを開きます( 材料の表を参照)。
4. 「ライブ」をクリックして、ライブビューウィンドウを開きます。
5. ティッシュ切片を見つけて、ピントが合っていることを確認します。
6. [取得]メニューをクリックし、[大きな画像をスキャン]を選択します。
7. 「大きな画像をスキャン」ウィンドウで、ジョイスティックを使用してステージを組織セクションの左端に移動し、左矢印をクリックしてスキャンする領域を設定します。一番上、右端、および下の組織セグメントについても繰り返します。
8. 取得メニューをクリックします。
9. 大きな画像のチェックボックスがオンになっていることを確認します。
   1. マルチチャンネル画像をキャプチャする場合は、[ Lambda ]タブをクリックします。
   2. 各 チャンネル をクリックし、 露光時間を 、画像のどの部分も飽和せずに染色が明らかになるレベルに設定します。
      注:これらの設定は、1つの実験グループ内で一貫している必要があります。サンプル間で取得設定を変更すると、結果が不正確になります。
   3. 収集するチャネルごとに手順 9.2 を繰り返します。
10. スキャンをクリックします。

14. 画像解析

1. 画像取得ソフトウェアを開きます。
2. [ファイル] | 画像を開いて選択します。
3. 画像ウィンドウを右クリックし、 多角形の関心領域 (ROI) を選択します。
4. フリーハンドツールでROIの概要を説明します。LTL陽性尿細管細胞またはα-SMA陽性間質細胞の概要を説明します。
5. 「測定」タブをクリックします。 |しきい値。
6. スレッショルドの上限と下限を設定するには、スライダーを正の信号領域の両側に調整します。
7. ROIタブをクリックします。
8. [エクスポート]アイコンをクリックして、値を保存します。スプレッドシートソフトウェアを使用して、正の信号面積/ROI面積の割合を計算します。

15. 代替案:フリーソフト(ImageJ)による画像解析

1. ImageJを開きます。
2. [ファイル] |画像を表示するために開きます。
3. フリーハンド選択をクリックします。
4. フリーハンドツールでアウトライン化してROIを選択します。LTL陽性尿細管細胞またはα-SMA陽性間質細胞の概要を説明します。
5. [編集] メニューをクリックし、[外部をクリア] を選択します。
6. 「分析」をクリックし、「測定」を選択して ROI の面積を決定します。
7. 画像に移動 |カラー |チャンネルを分割します。
8. しきい値の上限と下限を調整して、正の信号領域を検出します。
9. 「分析」をクリックし、「測定」を選択します。
10. データを保存します。
11. スプレッドシートソフトウェアでデータを開き、正の信号面積/ ROI面積の比率を計算します。

16.オプション:レーザー走査型共焦点顕微鏡によるイメージング

注:出版用の高解像度画像を取得するために、走査型共焦点顕微鏡は、腎臓組織のより鮮明な画像と減少した背景を提供します。

1. レーザー走査型共焦点顕微鏡の電源を入れます( 材料の表を参照)。
2. 40x対物レンズを選択します( 材料の表を参照)。
3. [場所を特定]タブをクリックし、フォーカスを調整して組織を見つけます。
4. 「Acquisition」タブに移動し、「Channels」をクリックして、ピンホール設定で1 AUを選択します。
5. 各チャンネルのレーザーゲイン強度を調整して、正の信号が見えるようにしますが、飽和していません。実験サンプルのセット内の設定が一定であることを確認してください。
6. [ スナップ ]をクリックして、画像を目的の形式で保存します。

17. 血漿BUNレベル

1. サンプルを-20°Cから取り出し、氷上で解凍します。
2. プラズマをdH₂Oで1:10の比率で希釈します。
3. 各サンプルについて、96ウェルプレートに3つの別々の反応を重複して設定します。
   1. サンプルと標準試料を添加する場合は、200 mg/dL 尿素 5 μL と希釈血漿 20 μL を添加します。
   2. サンプルのみの場合は、5 μL の dH₂O と 20 μL の希釈血漿を添加します。
   3. サンプルブランクには、5 μL の dH₂O と 20 μL の希釈プラズマを添加します。
4. サンプルあたり85 μLの試薬+1 μLのウレアーゼを混合して、作業溶液を調製します。
5. 80 μLの作業溶液を「sample plus standard」および「sample alone」ウェルに加えます。
6. 上記のステップ17.3の「サンプルブランク」ウェルに80μLの試薬(ウレアーゼなし)を加えます。
7. プレートを軽くたたいて混ぜ合わせ、室温で5分間インキュベートします。
8. プレートリーダーで_OD560 を読み取ります。
9. 尿素濃度Eq(1)を計算し、Eq(2)を使用してBUNに変換します。
   尿素(mg/dL)=(サンプルのみ-サンプルブランク)/(標準-サンプルのみ)×(標準/4)×(希釈係数)(1)
   BUN(mg / dL)=尿素濃度/ 2.14(2)
   注:このアッセイは、血清の尿素(分子量:60)含有量を測定します。ただし、BUNは尿素の窒素含有量(分子量:28)のみを参照しています。したがって、尿素濃度をBUNに変換するには、2.14(60/28)の補正が必要です。

結果

シスプラチン誘発AKI後のサイトカイン産生における尿細管上皮細胞の役割を調べるために、シスプラチンを20 mg / kgの濃度で注射した後、シスプラチン注射後3日目に0.25 mgのBFAを静脈内注射しました。腎臓は6時間後に採取されました。パラフィン包埋腎臓を切片化し、AKIの組織修復に関与する代表的なサイトカインであるTGF-β、PDGF-D、およびCTGFで染色しました。 図2Aに示すように、TGF-β⁺ 小胞は、BFAの存在下でシスプラチン処理された腎臓のLTLで標識されたPTCで観察されます。一方、TGF-β⁺ 小胞は、損傷していない腎臓またはBFA未治療の腎臓では観察されませんでした。

定量により、シスプラチン誘発性AKIにおけるBFA治療によるTGF-β1⁺面積の増加が明らかになりました(図2B)。TGF-βと同様に、シスプラチン誘発性AKIにBFA処理を施すとPDGF-D^+...

ディスカッション

腎臓PTCは、TGF-β、TNF-α、CTGF、PDGF、血管内皮増殖因子、ならびに他の多くのタンパク質20,21,22,23の分泌を通じてAKIおよびCKDを調節することが知られている。同様に、糸球体、遠位尿細管、および他の腎臓上皮細胞、ならびに間質細胞は、損傷中にこれらおよび/または他のタンパク質を分泌する24,25,26。サイトカインは産生直後に分泌されるため、これらの各細胞タイプのサイトカイン分泌における相対的な寄与を解明することは困難です。in situハイブリダイゼーションやその他のRNA染色技術を使用...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1 mL インスリンシリンジ	BD 329654
10 mL シリンジ	BD 302995
2 mL チューブ	Fisher ブランド	05-408-138
20 mL シリンジ	BD	302830
25 G 針	BD	305125
28 G 針	BD	329424
96 ウェルプレート	Corning	9017
アリストロチ酸-I	シグマ-アルドリッチ	A9461
&α;-SMA 抗体を Cy3	シグマ-アルドリッチ	C6198	RRID と
クライオスタット	CL Sturkey 用ブレードAB_476856。Inc	DT315R50
シ血清アルブミン (BSA)	シグマ・アルドリッチ	A7906
ブレフェルディン A	シグマ・アルドリッチ	B6542
シスプラチン	シグマ・アルドリッチ	P4394
クエン酸	グマ・アルドリッチ	791725
共焦点顕微鏡	ZEISS	LSM710
共焦点顕微鏡対物レンズ	ZEISS	40x / 1.10 LD C-アポクロマート WATER
共焦点ソフトウェア	ZEISS	ZEN
コプリンジャー	Fisher Scientific	19-4
カバーガラス	Fisher ブランド	12545F
クライオスタット	ライカ	CM1850
CTGF 抗体	Genetex	GTX124232	RRID:AB_11169640
Cy3-AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson immunoresearch	711-165-152	RRID: AB_2307443
Cy5-AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L)	Jackson immunoresearch	705-175-147	RRID: AB_2340415
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
ジメチルスルホキシド (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
使い捨てベースモールドフィ	ッシャーブランド	22-363-553
	クソン免疫研究	017-000-121
タノール	Decon Labs、Inc.	2701
鉗子	VETUS	ESD-13
グリシン	フィッシャー ブランド	12007-0050
加熱パッド	ケント サイエンティフィック	DCT-20
ヘパリン ナトリウム塩	ACROS 有機物	41121-0010	100mg/15ml の dH2O
加湿チャンバー	Invitrogen	44040410	ホイルで覆われたプラスチックの箱は、代替加湿チャンバー。
インスリンシリンジ	BD	329461
倒立顕微鏡	NIKON	Eclipse Ti-E2	免疫蛍光
KIM-1抗体	R&D	AF1817	RRID:AB_2116446
レモゾール(ヒストクリア)	ナショナル診断	HS-200
タステトラゴノロブスレク	チンベクターFL-13212
微鏡スライド	フィッシャーサイエンティフィック	12-550-343
クロトーム	ライヒャート	ング820II
モノクロCMOSカメラ	NIKON	DS-Qi-2
マウス手術用具	Kent scientific	INSMOUSEKIT
NIS Elements	NIKON
対物レンズ	NIKON	Plan Apo 20x/0.75	Eclipse Ti-E2(倒立顕微鏡)にリンクされた画像取得ソフトウェアOCT
コンパウンド	Scigen	4586
パップペン	ベクター	H-4000
カルシウムとマグネシウムを含むPBS	Corning	21-030-CV
PBS カルシウムとマグネシウムを含まない	nbsp;Corning	21-031-CV
PDGF-D 抗体	Thermo-Fisher Scientific	40-2100
PFA	電子顕微鏡 Science	15710	RRID: AB_2533455
プレートリーダー	Promega	GloMax®マイクロプレートリーダーの	4%PFAは、PBS中の16%から希釈されています。
ポビドンヨード(ベタジン)	Avrio Health L.P.	NDC 67618-151-17
鍋	Tristar 8	Qt. Power Cooker Plus
ProLong Gold 退色防止試薬	Invitrogen	P36930
Quantichrom 尿素 (BUN) アッセイキット II	BioAssay Systems	DUR2-100
腎臓解剖用片刃カミソリ刃 (.009", 0.23 mm)	IDL ツール	521013
スライドウォーマー	Lab Scientific Inc.、	XH-2001
ソフトウェア	NIKON	NIS 要素
スクロース	RPI	S24060
TGF-b1 アニボディ	シグマ・アルドリッチ	SAB4502954
トリス EDTA バッファー	コーニング	46-009-CM	RRID: AB_10747473
エン酸三ナトリウム二水和物	シグマ・アルドリッチ	SLBR6660V
エン酸三ナトリウム二水和物	シグマ・アルドリッチ	SLBR6660V
Triton	Sigma-Aldrich	9002-93-1
Tween 20	Sigma-Aldrich	P1379
白色ガラス荷電顕微鏡スライド、25 x 75 mm サイズ、研磨エッジ、ブルーフロスト	ローブ Scientific	1358D