方法論記事

オプトジェネティクスを使用して神経可塑性を逆転させ、ラットのコカイン探索を阻害する

DOI：

10.3791/63185

⸱

2021年10月5日

 ,  , 
1Department of Psychiatry, University of Pittsburgh, 2Department of Psychiatry, Rutgers University

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここで説明する方法は、ラットの行動関連回路におけるコカイン誘発可塑性を光遺伝学的に逆転させるために使用される手順を概説する。視床-扁桃体シナプスの持続的な低周波光刺激は、長期うつ病(LTD)を誘発します。コカインを経験したラットにおける in vivo 光遺伝学的に誘導されたLTDは、その後の手がかり動機による薬物探索の減弱をもたらした。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルは、視床-扁桃体回路でコカイン誘発性を逆転させ、ラットにおけるその後のコカイン探索行動を減らすために光遺伝学的ツールを使用するために必要なステップを示しています。私たちの研究では、ラットが視聴覚キューと組み合わせてコカインを静脈内投与すると、視床の内側膝状核(MGN)から外側扁桃体(LA)の主要なニューロンへの入力で形成されるシナプスが、キューとコカインの関連が学習されるにつれて強くなることがわかりました。これらのシナプスでのコカイン誘発可塑性の逆転は、合図動機によるコカイン探索行動を減少させるという仮説を立てた。このような神経調節を in vivoで実現するために、MGN-LAシナプスの強度を低下させるシナプス長期抑制(LTD)を誘導したいと考えました。この目的のために、私たちは光を使って脳回路の神経調節を可能にするオプトジェネティクスを使用しました。興奮性オプシンoChiEFは、oChiEFを含むAAVをMGNに注入することにより、LAのシナプス前MGN末端に発現しました。次に、光ファイバーをLAに埋め込み、473 nmのレーザー光を1 Hzの周波数で15分間パルスして、LTDと逆コカイン誘発可塑性を誘導しました。この操作は、薬物探索行動を誘発するコカインに関連する手がかりの能力の長期的な低下をもたらします。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

薬物乱用は、米国および世界中で非常に深刻な公衆衛生問題です。何十年にもわたる集中的な研究にもかかわらず、効果的な治療オプションはほとんどありません1,2。治療の大きな後退は、慢性的な薬物使用が環境手がかりと薬物自体との間に長期的な連想記憶を生成するという事実です。薬物関連の手がかりへの再曝露は、継続的な薬物使用と再発を動機付ける生理学的および行動的反応を促進します3。新しい治療戦略は、薬物と手がかりの関連を調節することに関与する回路を操作することを目的とした記憶ベースの治療法を制定することです。最近、外側扁桃体(LA)のシナプス、特に視床の内側生殖核(MGN)から生じるシナプスは、手がかりに関連するコカインの自己投与を繰り返すことによって強化され、この増強がコカイン探索行動をサポートできることが観察されました4,5。したがって、MGN-LAシナプスの可塑性を逆転させることで、キュー誘発による回復を減衰させることができると提案されました。

特定の脳回路のシナプス可塑性を正確に標的にする能力は、この分野にとって大きな課題でした。従来の薬理学的ツールは、再発行動を減少させることにある程度成功しているが、....

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルに記載されている実験は、 実験動物の世話と使用のための 国立衛生研究所ガイドによって定められたガイドラインと一致しており、ピッツバーグ大学の施設動物管理および使用委員会によって承認されました。すべての手順は、到着時の体重が275〜325 gの成体のナイーブなSprague-Dawleyラットを使用して実行されました。

1.光ファイバーインプラントとパッチケーブルの構築

  1. 以前に公開されたプロトコルに従って光ファイバーインプラントを準備します 9.このプロトコルで説明されている実験では、200 μmコアファイバ(0.5 NA)とØ1.25 mmマルチモードLC / PCセラミックフェルール、Ø230 μmの穴サイズを使用しました。
    1. ドレメルツールを使用して、フェルールの下3分の1(フェルールの平坦な端に最も近い)にスコアを付けます。フェルールにスコアを付けることで、歯科用セメントに付着したままになり、実験の全範囲を通じて安全性が維持される可能性が高くなります。
    2. ワイヤーカッターを使用して、~35mmの繊維を切断します。ファイバーストリッピングツールを使用して、~25 mmのファイバーを剥がし、10 mmを露出させません。
    3. メーカーの指示に従って熱硬化性エポキシを準備します。樹脂粉末1gを硬化....

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

実験の順序を概説するタイムラインを 図1に示します。行動実験を通して、コカイン注入の数とアクティブレバーで行われた反応の数は、コカイン探索行動の強度の尺度として機能します。コカインの自己投与の最初の数日間は、積極的な反応の数は、2週目に安定する前に、各獲得日にわたって徐々に増加するはずです。逆に、非アクティブなレバー応答は、実験全体を通して低いままである必要があります(図2A)。器械消滅の初日には、コカインの予期せぬ欠如がコカイン探索行動のエスカレーションをもたらすため、通常、アクティブなレバー反応の数が増加します。ただし、ラットが新しい偶発事象を学習するにつれて、この応答はその後のセッションで徐々に減少し、6〜10 d以内のアクティブなレバー応答の数が少なく安定した数になります(図2B)。実験の自己投与段階または機器絶滅段階のいずれかで指定された取得基準に達しなかったラットは研究から削除され、データは最終分析に含まれません。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

上述したように、適切な実験結果を達成するために重要ないくつかの重要なステップがある。このプロトコルは、コカインの自己投与を適切に獲得した動物にのみ有効である可能性が高く、これまでのところ、上記で概説したパラメーターを使用してのみテストされています。コカインの投与量、強化のスケジュール、およびキューパラメータは、行動の結果にほとんど影響を与えずに変更できる可能性がありますが、これは直接テストされていませんが、二次的な強化スケジュールが扁桃体非依存性のコカインシークにつながる可能性があることを除いて、これは直接テストされていません14。.プロトコル全体を通して、光ファイバーの適切な構造と機能を検証することが、光刺激の成功を確実にするのに役立ついくつかのポイントがあります。ヘッドキャップからの損失を防ぐためにフェルールを適切にスコアリングし、光ファイバーを研磨し、インプラントを介した光出力の損失が30%を超えないことをテストする必要があります9。さらに、レーザー刺激パラメータは重要な考慮事項です。レーザーは比較的低出力(5〜7 mW)で操作する必要.......

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

開示するものは何もありません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らは、USPHS助成金K01DA031745(MMT)、R01DA042029(MMT)、DA035805(YHH)、F31DA039646(MTR)、T32031111(MTR)、およびペンシルベニア州保健省からの支援に感謝したいと思います。

....

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.9% 生理食塩水フィッシャー サイエンティフィNC0291799
A.M.P.I. 刺激アイソレーターIso-Flex
AAV5.hSyn.oChIEF.tdTomatoDuke ウイルス ベクター コア (Roger Tsien 経由)#268Lin et al., 2009;Nabavi et al., 2014
AAV5.hSyn.tdTomato (Control)Duke Viral Vector Core ControlSee Lin et al., 2009;Nabavi et al., 2014
Artificial Tears (Opthalmic Ointment)Covetrus70349
ATP マグネシウム 塩Fisher ScientificA9187
BetadineButler Schein38250
塩化カルシウムFisher ScientificC1016
塩化セシウムFisher Scientific289329
セシウム水酸化物フィッシャー・サイエンティフィック516988
セシウム・メタンスルホン酸フィッシャー・サイエンティフィックC1426
コカイン HClNIDA ドラッグ・サプライ・センター9041-001
クライオスタットライカCM1950
D-グルコースSigma-AldrichG8270
DMSOフィッシャー・サイエンティフィックBP231-1
デュアルチャネル温度コントローラーワーナーインスツルメンツTC-344C
EGTAフィッシャーサイエンティフィックE3889
エタノールピッツバーグ大学 化学 ストックルーム200C5000
フェルール ダストキャップトールラボCAPL1.25 mm フェルール用白色プラスチックダストキャップ
フェルール嵌合スリーブドーリックレンズF210-3011Sleeve_BR_1.25、ブロンズ、1.25 mm ID
フェルール精密繊維製品MM-FER2007C-2300Ø1.25 mmマルチモードLC / PCセラミックフェルール、およびOslash;230 Μm穴サイズ
光ファイバートールラボFP200URT200 μmコアマルチモードファイバー(0.5 NA)
光ファイバーロータリージョイントPrizmatix(Amazonから注文)直径18 mm、ファイバーファイバーストリッピングツール用FC-FCコネクタ
Thor LabsT12S21
DAPI付きフルオロシールドSigma-AldrichF6057
GentamicinHenry Schein6913
GTP ナトリウムソルトフィッシャーサイエンティフィックG8877
ハミルトン シリンジハミルトン8008510 μLボリューム、26ゲージ、2インチ、ポイントスタイル3
ガンAlliedElectronics972-6966250 V、750-800 °F
熱硬化型エポキシ精密繊維製品PFP-353ND-8OZ
ヘパリンヘンリー・シャイン55737
HEPESシグマ・アルドリッチH3375
塩酸フィッシャー・サイエンティフィ・219405490イ
ソフルランヘンリー・シャイン29405
ケタミン HClヘンリー・シャイン55853タミンは規制物質であり、施設のガイドラインに従って取り扱われるべき
Lactated Ringer'sヘンリー・シャイン9846
レーザー、ドライバー、レーザーとファイバーのカプラーOEM レーザー システムBL-473-00100-CWM-SD-xx-LED-0100 mW、473-nm、ダイオード励起固体レーザー (1 つのオプション)
L-グルタチオンフィッシャー サイエンティフィックG4251
リドカインバトラー シャイン14583
光センサートール研究所PM100Dデジタルディスプレイ付きコンパクトエネルギーメーターコンソール
ロックタイトインスタント接着剤グレインジャー5E207
硫酸マグネシウムSigma-Aldrich203726
微小電極増幅器/データ収集分子デバイスMULTICLAMP700B/Digidata 1440A
マイクロインジェクターポンプハーバード装置70-4501デュアルシリンジ
マイクロマニピュレーターサッター機器MPC-200/ROE-200
顕微鏡オリンパスBX51WI電気生理用正立顕微鏡
オリンパスBX61VSエピ蛍光スライド走査顕微鏡
N-メチル-D-グルカミンシグマ・アルドリッチM2004
オルソジェット歯科用セメント・液体ラングデンタル1504BLK黒
オルソジェット歯科用セメント、粉末ラング歯科1530BLKコンテンポラリー パウダー、黒
パラホルムアルデヒドシグマ アルドリッチP6148
パッチ ケーブルトール ラボFP200ERTマルチモード、FT030 チューブ
ピクロトキシンフィッシャー サイエンティフィ
研磨ディスクトール ラボD50FC
研磨パッドThor LabsNRS9139" x 13"
研磨紙Thor LabsLFG5P5 μmグリット
研磨紙ールラボLFG3P3 μmグリット
研磨紙ールラボLFG1P1 μMグリット
研磨紙Thor LabsLFG03P0.3 μm grit
塩化カリウムSigma-AldrichP9333
水酸化カリウムFisher ScientificP5958
メタンスルホン酸カリウムFisher Scientific83000
QX-314-ClAlomone LabsQ-150
Rimadyl (Carprofen)Henry Schein24751
自己投与チャンバー/ソフトウェアMed AssociatesMED-NP5L-D1
重炭酸ナトリウムSigma-AldrichS5761
塩化ナトリウムSigma-AldrichS7653
水酸化ナトリウムSigma-Aldrich1064980500
L-アスコルビン酸ナトリウムSigma-AldrichA7631
ペントバルビタールナトリウムHenry Schein24352
リン酸ナトリウムSigma-AldrichS9638
スホクレアチンナトリウムフィッシャーサイエンティフィックP7936
ビン酸ナトリウムSigma-AldrichP2256
ステンレス鋼小ネジWWグレインジャー 6GB25M2-0.40mm 小ネジ、パン、フィリップス、A2 ステンレス鋼、プレーン、3 mm
フェルール用定位固定装置アダプターThor LabsXCL
定位固定装置フレームStoelting51603
ショ糖Sigma-AldrichS8501
縫合糸ファイン サイエンス ツール18020-50絹糸;サイズ:5/0、直径:0.12 mm
TEA-ChlorideFisher ScientificT2265
チオ尿素Sigma-AldrichT8656
Vetbond 組織接着剤Covetrus001505
VibratomeLeicaVT1200S
XylazineButler Schein33198
ック ヒートックケです ック AC131210010 トトホピル

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Connors, N. J., Hoffman, R. S. Experimental treatments for cocaine toxicity: A difficult transition to the bedside. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 347 (2), 251-257 (2013).
  2. Makani, R., Pradhan, B., Shah, U., Parikh, T.

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

このJoVE記事のテキストまたは図の再利用許可をリクエスト

許可をリクエスト

タグ

関連記事