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方法論記事

オプトジェネティクスを使用して神経可塑性を逆転させ、ラットのコカイン探索を阻害する

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DOI:

10.3791/63185

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2021年10月5日

 ,  , 
1Department of Psychiatry, University of Pittsburgh, 2Department of Psychiatry, Rutgers University

この記事について

サマリー

ここで説明する方法は、ラットの行動関連回路におけるコカイン誘発可塑性を光遺伝学的に逆転させるために使用される手順を概説する。視床-扁桃体シナプスの持続的な低周波光刺激は、長期うつ病(LTD)を誘発します。コカインを経験したラットにおける in vivo 光遺伝学的に誘導されたLTDは、その後の手がかり動機による薬物探索の減弱をもたらした。

要約

このプロトコルは、視床-扁桃体回路でコカイン誘発性を逆転させ、ラットにおけるその後のコカイン探索行動を減らすために光遺伝学的ツールを使用するために必要なステップを示しています。私たちの研究では、ラットが視聴覚キューと組み合わせてコカインを静脈内投与すると、視床の内側膝状核(MGN)から外側扁桃体(LA)の主要なニューロンへの入力で形成されるシナプスが、キューとコカインの関連が学習されるにつれて強くなることがわかりました。これらのシナプスでのコカイン誘発可塑性の逆転は、合図動機によるコカイン探索行動を減少させるという仮説を立てた。このような神経調節を in vivoで実現するために、MGN-LAシナプスの強度を低下させるシナプス長期抑制(LTD)を誘導したいと考えました。この目的のために、私たちは光を使って脳回路の神経調節を可能にするオプトジェネティクスを使用しました。興奮性オプシンoChiEFは、oChiEFを含むAAVをMGNに注入することにより、LAのシナプス前MGN末端に発現しました。次に、光ファイバーをLAに埋め込み、473 nmのレーザー光を1 Hzの周波数で15分間パルスして、LTDと逆コカイン誘発可塑性を誘導しました。この操作は、薬物探索行動を誘発するコカインに関連する手がかりの能力の長期的な低下をもたらします。

概要

薬物乱用は、米国および世界中で非常に深刻な公衆衛生問題です。何十年にもわたる集中的な研究にもかかわらず、効果的な治療オプションはほとんどありません1,2。治療の大きな後退は、慢性的な薬物使用が環境手がかりと薬物自体との間に長期的な連想記憶を生成するという事実です。薬物関連の手がかりへの再曝露は、継続的な薬物使用と再発を動機付ける生理学的および行動的反応を促進します3。新しい治療戦略は、薬物と手がかりの関連を調節することに関与する回路を操作することを目的とした記憶ベースの治療法を制定することです。最近、外側扁桃体(LA)のシナプス、特に視床の内側生殖核(MGN)から生じるシナプスは、手がかりに関連するコカインの自己投与を繰り返すことによって強化され、この増強がコカイン探索行動をサポートできることが観察されました4,5。したがって、MGN-LAシナプスの可塑性を逆転させることで、キュー誘発による回復を減衰させることができると提案されました。

特定の脳回路のシナプス可塑性を正確に標的にする能力は、この分野にとって大きな課題でした。従来の薬理学的ツールは、再発行動を減少させることにある程度成功しているが、個々のシナプスを操作できないことによって制限されている。しかし、in vivoオプトジェネティクスの最近の開発は、これらの制限を克服し、時間的および空間的精度で神経経路を制御するために必要なツールを提供しました6,7,8。特定の脳回路で光感受性オプシンを発現させることにより、レーザー光を使用して回路を活性化または阻害することができます。周波数依存性光刺激は、行動する動物における回路のシナプス可塑性を特異的に操作するために利用することができる。

この原稿は、 in vivo オプトジェネティクスを使用して行動に関連するMGN-LA回路を操作するために取られた手順を概説します。まず、興奮性オプシンoChIEFをMGNで発現させ、光ファイバーをLAに両側に移植した。次に、動物は、MGN-LA経路を増強する手がかり依存的な方法でコカインを自己投与するように訓練されました。次に、473nmのレーザー光による持続的な低周波刺激を用いて、回路固有のLTDを製造した。 コカイン使用によって誘発される可塑性を逆転させることは、薬物探索行動に関連する行動を引き起こす手がかりの能力の長期的な低下をもたらした。

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プロトコル

このプロトコルに記載されている実験は、 実験動物の世話と使用のための 国立衛生研究所ガイドによって定められたガイドラインと一致しており、ピッツバーグ大学の施設動物管理および使用委員会によって承認されました。すべての手順は、到着時の体重が275〜325 gの成体のナイーブなSprague-Dawleyラットを使用して実行されました。

1.光ファイバーインプラントとパッチケーブルの構築

  1. 以前に公開されたプロトコルに従って光ファイバーインプラントを準備します 9.このプロトコルで説明されている実験では、200 μmコアファイバ(0.5 NA)とØ1.25 mmマルチモードLC / PCセラミックフェルール、Ø230 μmの穴サイズを使用しました。
    1. ドレメルツールを使用して、フェルールの下3分の1(フェルールの平坦な端に最も近い)にスコアを付けます。フェルールにスコアを付けることで、歯科用セメントに付着したままになり、実験の全範囲を通じて安全性が維持される可能性が高くなります。
    2. ワイヤーカッターを使用して、~35mmの繊維を切断します。ファイバーストリッピングツールを使用して、~25 mmのファイバーを剥がし、10 mmを露出させません。
    3. メーカーの指示に従って熱硬化性エポキシを準備します。樹脂粉末1gを硬化剤コンパウンド100mgに溶解する。鈍い25ゲージの針を1mLシリンジに取り付けます。シリンジにエポキシを入れ、鈍い25ゲージの針先を取り付けます。
    4. バイスまたはクランプを使用して、平らな面を上に向けて凸面を下に向けてフェルールをしっかりと保持します。エポキシ充填シリンジを使用して、フェルールの側面から余分なエポキシを拭き取るように注意しながら、フェルールの平らな面にエポキシを1滴加えます。
    5. ファイバーの剥がされた部分をフェルールに挿入して、さらに5mmの剥がされたファイバーを露出させます。LAインプラントの場合、線維は腹側からブレグマまで7.9 mmに移植されるため、剥がされていない線維の露出長は~13 mmである必要があります。
    6. エポキシが黒/琥珀色になるまで、ヒートガンで約30〜40秒間硬化させます。
    7. ダイヤモンドナイフでフェルールの凸端の界面でファイバーを直接刻み、指を使ってファイバーをそっとタップします。
    8. 止血剤で保持し、均等な圧力を加え、一連の研磨紙(高品位から低品位、5、3、1、0.3 μm)でそれぞれ20回の円形回転を行うことにより、フェルールの凸端を研磨します。
    9. ストリップされていないファイバーをテープとスコアストリップファイバーを使用してテーブルに固定し、腹側座標から2 mm余分に残します(LAインプラントの場合、ファイバーの最終長は~10 mmです)。止血剤を使用してフェルールを引っ張り、刻み目がついた繊維を均等に壊します。スコアリング時にファイバーを完全に切断しないように注意してください、そうしないとファイバーのコアが損傷します。
  2. 光ファイバーインプラントと互換性のあるパッチケーブルを構築します。カスタム設計のパッチケーブルを購入しました( 材料の表を参照)。あるいは、パッチケーブルは、以前に公開されたプロトコル9に従って構築することができる。
    注意: フェルールファイバーとパッチケーブルファイバーの直径とNAは、神経活動を十分に刺激できない可能性のある過剰な光の損失を防ぐために、カップリング接合部で一致する必要があります。
  3. パッチケーブル/光ファイバーを適切なレーザー光源(473 nm、1 mW出力)に接続し、光センサーで出力を測定し、パッチケーブルと光ファイバーインプラントを介した光出力を測定します。正常に構築されたファイバーは、同心円の光を放出し、光損失は30%以下です。

2.げっ歯類の静脈内カテーテル法、ウイルス送達、および光ファイバー移植

  1. 手術のために動物を準備します。
    1. 施設のガイドラインに基づいて、選択した麻酔薬でラットを完全に麻酔します。1つの選択肢は、塩酸ケタミン(87.5-100 mg / kg、i.m.)および塩酸キシラジン(5 mg / kg、i.m.)です。つま先のピンチ反射がないかどうかを確認することにより、ラットが完全に麻酔されていることを確認します。
      注意: ケタミンは、機関のガイドラインに従って取り扱わなければならない規制物質です。
      注:麻酔薬の筋肉内注射は、腹腔内注射よりも迅速で信頼性の高い麻酔導入をもたらしたため、この研究では使用されています。ラットの呼吸と反応性を継続的に監視し、手術中は熱サポートを提供します。
    2. ラットの背中の広い領域(肩甲骨のすぐ上から背中の中央までの背中の上部)と、右前肢の下の首の領域、および頭皮を剃ります。
    3. ラットを手術領域に置き、目にプラルーブ(人工涙液)を適用します。体重量のカルプロフェン(鎮痛剤)を背中上部の皮膚から皮下(SC)注射し、次に5 mLの乳酸リンゲル溶液s.c.を腰の皮膚から注射します。
    4. 滅菌ガーゼをベタジンで濡らし、円運動を使用して剃毛した手術部位を拭き取ることにより、すべての手術部位を消毒します。その後、70%エタノールでこのプロセスを繰り返します。この交互のサイクルを3回繰り返します。
  2. 以前に公開されたプロトコル4、10に従って静脈内カテーテル移植を行う。
    注:カテーテル移植中の刺激を避けるために、この手術中は外科的ドレープは使用されません。使用前にすべての器具および機器を滅菌してください。滅菌手袋を使用し、滅菌されていない表面に接触した場合は手袋を交換してください。
  3. カテーテル移植の直後に、ラットを定位固定装置フレームに固定してAAV注射を行います。
    1. 局所麻酔薬として2%リドカイン(0.2〜0.3 mL)の皮下(s.c)注射を頭皮に届けます。.
      注:局所麻酔薬は、外科的転帰の変化を避けるために、静脈内カテーテル移植中に使用されません。
    2. 26ゲージのステンレス鋼注射カニューレを、1 μLの濃縮AAV溶液で満たされたハミルトンシリンジに接続します:AAV5-hSyn-tdトマトまたはAAV5-hSyn-oChIEF-tdトマト
      注:oChIEFは、青色光感受性オプシンチャネルロドプシン(ChR2)の変種であり、広範囲の周波数8,11に応答できるため、このプロトコルで説明されている低周波LTD実験だけでなく、高周波LTP実験(ここでは説明しません)。oChIEFコンストラクトは、ロジャー・ツィン博士から寄贈され、デュークウイルスベクターコアによってパッケージングと精製のために処理されました。MGN軸索終末における最適なウイルス発現を可能にするために、注射日からLTD誘導日までの間に少なくとも3〜4週間が必要である。
      注意:一般に、AAVはバイオセーフティレベル1(BSL-1)生物と見なされており、ヘルパーウイルスを生産に使用しない限り、自己感染のリスクは低くなります。その使用にはIACUCの承認が必要であり、不必要な曝露を制限するために、制度上のガイドラインに従って適切なPPEを常に使用する必要があります。
    3. メスを使用して、頭蓋骨の前部から後部に0.5 mmの切開を行い、上にある組織を取り除き、頭蓋骨の表面を露出させます。
    4. ラットの頭を前軸/後軸に水平にし、脳定位座標をブレグマにゼロにします。
    5. 小さなドリルビットを備えたドレメルツールを使用して、頭蓋骨に3つの小さな穴を開けます。ドライバーを使用して、ステンレス鋼のネジ(M2x4 965-A2)を所定の位置にしっかりと取り付けます。
      注意: 歯科用セメントを適切に結合し、頑丈で長持ちするヘッドキャップを作成するには、ネジが必要です。ネジの位置は、頭蓋骨の前後軸を横切って、AAV注射部位から離して広げる必要があります。
    6. 内側膝状核(MGN)の内側部分について、ラットブレインアトラス(ワトソンとパクシノス)12 からの座標に基づいてAAVを注入するための両側穴を開けます。ブレグマからのミリメートル、AP:-5.4;ML: ±3.0;DV: -6.6.MGNに配置されるまで、注入カニューレをゆっくりと下げます(4 mm / min)。濃縮AAV溶液を0.1 μL/分の速度で注入します。
    7. 注入が完了した後、注射カニューレを5分間そのままにして、カニューレから拡散させてから、カニューレを脳からゆっくりと引き出します。
  4. ウイルス注入の直後に、MGN−LA末端を標的とする光ファイバー4,9を移植し続ける。
    1. ドレメルツールを使用して、外側扁桃体を標的とする光ファイバーインプラント用の両側穴を開けます(単位:ブレグマからのmm、AP:-3.0;ML ±5.1) を参照してください。
    2. 鉗子を使用して光ファイバーインプラントのフェルールをつかみ、固定装置アダプターに固定して、しっかりと固定します。
    3. 繊維の先端がLAの背側部分(DV:-7.9 mm)に収まるまで、2 mm / minの速度でゆっくりと繊維を下げます。
    4. 最初にロックタイトインスタント接着剤の薄層を使用してフェルールを頭蓋骨に固定し、次に歯科用セメントと直径1.25mmのフェルールスリーブとダストカバーでフェルールを覆います。
      注意: フェルールを頭蓋骨に固定するための接着剤の選択は、地域または施設の動物管理および使用委員会によって承認される必要があります。この研究では、複数の接着剤で試行錯誤した後、フェルールを頭蓋骨に確実に固定するためにロックタイトが使用されます。ただし、利用可能な代替案を検討することができます。
  5. 外科的処置の後、ラットを個別に飼い、食物と水への無料アクセスを提供します。施設のガイドラインに沿った術後ケアを提供する。開存性を維持するために、ゲンタマイシン(5 mg / mL)とヘパリン(30 USP / mL)を含む生理食塩水でカテーテルを毎日洗い流してください。手術後少なくとも5日後および行動実験開始の24時間前に、食物はラットを自由摂食体重の~90%に制限する。

3. げっ歯類コカインの自己投与と器械レバーの消滅

注:すべての行動手順は、1つの壁に2つの格納式レバー、各レバーの上に刺激ライト、トーンジェネレーター、ハウスライト、および輸液ポンプを備えた標準的なオペラントコンディショニングチャンバーで行われます。

  1. FR1強化スケジュールの下で、ラットを毎日1時間のコカイン(2 mg / mL)自己投与トレーニングセッションにさらします。.
    1. ラットを毎日オペラントチャンバーに入れ、ラットがレバープレスできるようにします。指定された「アクティブレバー」(左右のレバーで相殺)を押すと、コカイン注入(1.0 mg / kg /注入)と、複合光とトーンのキューが10秒間表示されます。指定された「非アクティブレバー」を押しても、プログラムされた効果はありません。
    2. ラットが3日間連続して少なくとも8回の注入/日を獲得するまで、少なくとも10日間自己投与実験を続けます。.20日目までに取得基準に達しなかった場合、研究から除外されます。
  2. 獲得基準が正常に満たされた後、ラットを6〜10dの1時間の機器絶滅セッションにかけます。
    1. ラットをオペラントチャンバーに入れ、ラットが自由にレバープレスできるようにします。ただし、アクティブレバーと非アクティブレバーの両方での応答は、プログラムされた結果にはなりません。
    2. ラットに、2日間連続で平均<25回のレバープレスが発生するまで、毎日器具の絶滅を続けてもらいます。

4. 株式会社の 生体内 光遺伝学的誘導

注:光遺伝学的阻害実験は、器械的絶滅の最終日から24時間後に行われます。

  1. カバーを外した清潔で標準的なげっ歯類のハウジングケージの上に吊り下げられたロータリージョイントを介して、パッチコードを473nmの青色レーザーダイオードに接続します。この設定により、げっ歯類は光遺伝学的刺激中にケージの周りを自由に動き回ることができます。
  2. 取扱説明書に従ってレーザーダイオードの電源を入れ、パルス発生器に接続します。設定を調整します, 電源を入れたときにラットが1Hzで900 2ミリ秒の光パルスを受信するようにします.
    注意: レーザーの操作中は常に適切な目の保護具を使用する必要があります。
  3. 光センサーを使用して、パッチコードを通して光強度を測定します。パッチケーブルからの光出力が~5-7mWになるようにレーザーの強度を調整します。
  4. ラットを清潔なハウジングケージに入れます。ダストカバーとフェルールスリーブを取り外し、フェルールを露出させます。パッチコードを光ファイバーインプラントに両側に接続します。ラットがLTD誘導の前に3分間環境を探索できるようにします。
  5. パルス発生器をオンにして、光遺伝学的刺激を開始します。
    注:可能性は低いですが、ラットが刺激に対して何らかの副作用を経験した場合、実験は直ちに終了し、ラットは施設のガイドラインに基づいて適切に安楽死されます。
  6. LTD誘導後、ラットをケージに3分間入れてから、ホームケージに戻します。
  7. 対照実験では、AAV5-tdTomato対照ウイルスを発現するラットに同じ刺激手順を使用します。偽の実験では、AAV5-oChIEFウイルスを発現するラットの光ファイバーにパッチコードを取り付けますが、15分間のセッションでは刺激は提供されません。

5.手がかり誘発性コカインシークに対する光遺伝学的刺激の効果をテストする

  1. in vivo光遺伝学的刺激の24時間後、ラットをオペラントコンディショニングチャンバーに戻します。ラットは、コカイン探索行動を評価するために、1時間の標準的な合図誘発性復職セッションを受けます。
    注:キュー誘発性回復中、アクティブレバーでの応答により、コカイン関連のキューが10秒間表示されますが、コカインの注入は行われません。
  2. 最初の検査の少なくとも1週間後に2回目の復職検査を行い、光遺伝学的LTD誘導がコカイン探索の長期的な抑制をもたらすかどうかを判断します。

6. ウイルス発現および光ファイバー配置の組織学的検証のための染色、蛍光、およびイメージング

  1. 1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)と4%パラホルムアルデヒド(PFA)を作ります。両方の溶液を氷上に保管します。総容量は、研究のラットの数によって異なります(ラットあたり~100mLのPBSと200mLのPFAが使用されます)。
    注意: PFAは有毒な化学物質であり、発がん性物質として知られています。吸入や皮膚との接触を避けるために適切な注意を払ってください。その使用と廃棄は、適切なPPEとケミカルフローフードの使用を含む制度上のガイドラインに従う必要があります。
  2. 蠕動ポンプを20 mL/minの流量でセットアップします。ポンプのチューブに1x PBSを充填します。チューブの端に鈍い20ゲージの針を取り付けます。
  3. ラットにペントバルビタールナトリウム(100 mg / kg、i.p.)を深く麻酔します。.先に進む前に、つま先のつまみに対する反応の欠如によって麻酔の深さを確認してください。
    注:灌流は最終処置であるため、ペントバルビタールナトリウムが使用されます。
  4. 外科用ハサミを使用して、横隔膜の下のラットの腹腔を切り開きます。胸郭を横方向の縁に沿って吻側に切り、ラットの心臓を露出させます。止血剤を使用して、胸郭の吻側部分を心臓から離して固定します。心臓を囲む上にある脂肪組織を切り取ります。
  5. 鈍い針を左心室から大動脈に挿入します。右心房に小さな穴を開けて、心臓に戻るときに溶液を排出します。
  6. 各ラットに1x PBSを5分間、続いて4%PFA、pH 7.4で10分間灌流します。
  7. ラットを斬首し、脳を抽出し、4%PFAに24時間後置します。次に、脳を30%スクロース溶液に2〜3 d移します。
  8. クライオスタットを使用して50μmで脳を切片化します。
  9. LAまたはMGNを含むすべてのスライスをスライドガラスとカバーガラスに取り付けます。
  10. 放射蛍光顕微鏡を使用した画像スライスを使用して、MGNにおけるAAV-oChIEF-tdTomatoの発現とLAへの投影、およびLA上の光ファイバーの配置を検証しました。

7.電気生理学実験のための灌流および急性脳スライスの準備

注:電気生理学的実験は、 in vivo LTDの成功を検証するために、動物のサブセットに対して実行されます。

  1. 表1〜34、13に列挙した試薬を用いて電気生理学溶液を調製する。HClですべての溶液のpHを7.4に調整し、浸透圧を300-310 mOsm / kgH 2Oに調整します。 実験前に溶液を新鮮にし、4°Cで最大1週間保存します。使用中は常にすべての溶液をカルボゲン(95%O 2/5%CO2)で飽和させてください。
  2. 地域または施設の動物の世話と使用のガイドラインに従ってイソフルランを使用して、密閉された安楽死チャンバーでラットを深く麻酔します。. 動物がつま先のピンチ反射によって完全に麻酔をかけられていることを確認します。
  3. 小さなビーカーに50mLの氷冷切断液を入れます。蠕動ポンプのチューブに溶液を充填し、流量を20 mL/minに調整します。チューブの端に鈍い20ゲージの針を取り付けます。
  4. 腹腔を開き(手順6.4および6.5を参照)、ラットに切断液を簡単に灌流します(最大1〜2分)。
  5. 灌流後、直ちにラットを斬首する。脳を取り出し、4°Cの切断溶液で満たされた小さなビーカーに30秒〜1分間入れます。
  6. へらで脳を移し、すぐにビブラトームのチャンバーに固定します。細かい鉗子を使用してピアを取り外します。チャンバーに4°Cの切断液を満たし、速度0.37 mm/秒、周波数70 Hzで扁桃体の急性冠状スライス(厚さ250 μm)を調製します。
  7. スライスが得られたら、それぞれを切断溶液で満たされた保持チャンバーに入れ、37°Cで10〜12分間インキュベートします。LAを含むスライスは、動物あたり約5〜7個得ることができる。
  8. スライスを室温(RT)保持溶液のビーカーに移し、実験前に>30分間回復させます。
    注意: スライスは通常、保持溶液に4〜6時間保持されている間、健康なままです。AAVの蛍光性により、スライスは低照度状態に保たれます。

8. 生体外 電気生理学的記録

  1. 表4〜5に列挙した試薬を用いて細胞内溶液を調製する。
    注:細胞内溶液は実験の前に作成する必要があり、-80°Cで長期(3〜12か月)または-20°Cで短期(1〜2か月)保存できます。 溶液は7.3にpH調整されています(Csベースの細胞内溶液の場合はCsOH、Kベースの細胞内溶液の場合はKOHを使用)。290-300 mOsm / kgH 2Oの最終浸透圧に調整します。
  2. ジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解した500 mMピクロトキシンストック溶液を調製します。
    注:ピクロトキシンストックは分注され、-20°Cで保存されます。 使用当日、アリコートを解凍し、最終濃度100μMになるまで記録溶液に添加する。
    注意:ピクロトキシンはGABAA 受容体の非競合的アンタゴニストであるため、ピクロトキシンの注入には刺激効果があります。経口摂取または皮膚吸収により重度の毒性を示します。.ピクロトキシンを扱うときは、常に適切なPPEを使用する必要があります。
  3. 電気生理学実験用に設計された正立顕微鏡にスライスを移します。
  4. 実験中は、31〜33°Cに加熱された記録溶液でスライスを連続的に浴灌流する。
  5. 4倍の対物レンズを使用してLAを拡大します。40倍の水浸レンズで形態によって主要なニューロンを特定します。
  6. Csベースの細胞内溶液(電圧クランプ実験用)またはKベースの細胞内溶液(電流クランプ実験用)のいずれかを充填したガラスピペット(3〜5MΩ)を使用して、全細胞パッチクランプ記録を取得します。
  7. 蛍光下でAAVに感染したMGN軸索投影を特定します(RFPフィルターを使用)。パルス発生器に接続された青色光(473 nm)DPSSレーザーを使用して投影を刺激します。
    注意: レーザー露光を制限するために、コリメートされたレーザー光は顕微鏡の蛍光ポートに結合され、対物レンズを通してスライスに集束されます。
    注:電圧クランプモードでは、興奮性シナプス後電流(EPSC)は0.1Hzで光学的に誘発されます。 AAVに感染したMGNニューロンからの入力を受け取るニューロンは、信頼性の高いEPSCを示します。
  8. ex vivo LTDを誘導するには、現在のクランプモードで、興奮性シナプス後電位(EPSP)の安定したベースラインを少なくとも10分間記録します。.次に、周波数1Hz(合計時間=15分)で473nmの光の900個の2msパルスを供給します。次に、EPSPを0.1Hzで≥60分間連続的に記録します。

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結果

実験の順序を概説するタイムラインを 図1に示します。行動実験を通して、コカイン注入の数とアクティブレバーで行われた反応の数は、コカイン探索行動の強度の尺度として機能します。コカインの自己投与の最初の数日間は、積極的な反応の数は、2週目に安定する前に、各獲得日にわたって徐々に増加するはずです。逆に、非アクティブなレバー応答は、実験全体を通して低いままである必要があります(図2A)。器械消滅の初日には、コカインの予期せぬ欠如がコカイン探索行動のエスカレーションをもたらすため、通常、アクティブなレバー反応の数が増加します。ただし、ラットが新しい偶発事象を学習するにつれて、この応答はその後のセッションで徐々に減少し、6〜10 d以内のアクティブなレバー応答の数が少なく安定した数になります(図2B)。実験の自己投与段階または機器絶滅段階のいずれかで指定された取得基準に達しなかったラットは研究から削除され、データは最終分析に含まれません。

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ディスカッション

上述したように、適切な実験結果を達成するために重要ないくつかの重要なステップがある。このプロトコルは、コカインの自己投与を適切に獲得した動物にのみ有効である可能性が高く、これまでのところ、上記で概説したパラメーターを使用してのみテストされています。コカインの投与量、強化のスケジュール、およびキューパラメータは、行動の結果にほとんど影響を与えずに変更できる可能性がありますが、これは直接テストされていませんが、二次的な強化スケジュールが扁桃体非依存性のコカインシークにつながる可能性があることを除いて、これは直接テストされていません14。.プロトコル全体を通して、光ファイバーの適切な構造と機能を検証することが、光刺激の成功を確実にするのに役立ついくつかのポイントがあります。ヘッドキャップからの損失を防ぐためにフェルールを適切にスコアリングし、光ファイバーを研磨し、インプラントを介した光出力の損失が30%を超えないことをテストする必要があります9。さらに、レーザー刺激パラメータは重要な考慮事項です。レーザーは比較的低出力(5〜7 mW)で操作する必要...

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開示事項

開示するものは何もありません。

謝辞

著者らは、USPHS助成金K01DA031745(MMT)、R01DA042029(MMT)、DA035805(YHH)、F31DA039646(MTR)、T32031111(MTR)、およびペンシルベニア州保健省からの支援に感謝したいと思います。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.9% 生理食塩水フィッシャー サイエンティフィNC0291799
A.M.P.I. 刺激アイソレーターIso-Flex
AAV5.hSyn.oChIEF.tdTomatoDuke ウイルス ベクター コア (Roger Tsien 経由)#268Lin et al., 2009;Nabavi et al., 2014
AAV5.hSyn.tdTomato (Control)Duke Viral Vector Core ControlSee Lin et al., 2009;Nabavi et al., 2014
Artificial Tears (Opthalmic Ointment)Covetrus70349
ATP マグネシウム 塩Fisher ScientificA9187
BetadineButler Schein38250
塩化カルシウムFisher ScientificC1016
塩化セシウムFisher Scientific289329
セシウム水酸化物フィッシャー・サイエンティフィック516988
セシウム・メタンスルホン酸フィッシャー・サイエンティフィックC1426
コカイン HClNIDA ドラッグ・サプライ・センター9041-001
クライオスタットライカCM1950
D-グルコースSigma-AldrichG8270
DMSOフィッシャー・サイエンティフィックBP231-1
デュアルチャネル温度コントローラーワーナーインスツルメンツTC-344C
EGTAフィッシャーサイエンティフィックE3889
エタノールピッツバーグ大学 化学 ストックルーム200C5000
フェルール ダストキャップトールラボCAPL1.25 mm フェルール用白色プラスチックダストキャップ
フェルール嵌合スリーブドーリックレンズF210-3011Sleeve_BR_1.25、ブロンズ、1.25 mm ID
フェルール精密繊維製品MM-FER2007C-2300Ø1.25 mmマルチモードLC / PCセラミックフェルール、およびOslash;230 &MU;m穴サイズ
光ファイバートールラボFP200URT200 μmコアマルチモードファイバー(0.5 NA)
光ファイバーロータリージョイントPrizmatix(Amazonから注文)直径18 mm、ファイバーファイバーストリッピングツール用FC-FCコネクタ
Thor LabsT12S21
DAPI付きフルオロシールドSigma-AldrichF6057
GentamicinHenry Schein6913
GTP ナトリウムソルトフィッシャーサイエンティフィックG8877
ハミルトン シリンジハミルトン8008510 μLボリューム、26ゲージ、2インチ、ポイントスタイル3
ガンAlliedElectronics972-6966250 V、750-800 °F
熱硬化型エポキシ精密繊維製品PFP-353ND-8OZ
ヘパリンヘンリー・シャイン55737
HEPESシグマ・アルドリッチH3375
塩酸フィッシャー・サイエンティフィ・219405490イ
ソフルランヘンリー・シャイン29405
ケタミン HClヘンリー・シャイン55853タミンは規制物質であり、施設のガイドラインに従って取り扱われるべき
Lactated Ringer'sヘンリー・シャイン9846
レーザー、ドライバー、レーザーとファイバーのカプラーOEM レーザー システムBL-473-00100-CWM-SD-xx-LED-0100 mW、473-nm、ダイオード励起固体レーザー (1 つのオプション)
L-グルタチオンフィッシャー サイエンティフィックG4251
リドカインバトラー シャイン14583
光センサートール研究所PM100Dデジタルディスプレイ付きコンパクトエネルギーメーターコンソール
ロックタイトインスタント接着剤グレインジャー5E207
硫酸マグネシウムSigma-Aldrich203726
微小電極増幅器/データ収集分子デバイスMULTICLAMP700B/Digidata 1440A
マイクロインジェクターポンプハーバード装置70-4501デュアルシリンジ
マイクロマニピュレーターサッター機器MPC-200/ROE-200
顕微鏡オリンパスBX51WI電気生理用正立顕微鏡
オリンパスBX61VSエピ蛍光スライド走査顕微鏡
N-メチル-D-グルカミンシグマ・アルドリッチM2004
オルソジェット歯科用セメント・液体ラングデンタル1504BLK黒
オルソジェット歯科用セメント、粉末ラング歯科1530BLKコンテンポラリー パウダー、黒
パラホルムアルデヒドシグマ アルドリッチP6148
パッチ ケーブルトール ラボFP200ERTマルチモード、FT030 チューブ
ピクロトキシンフィッシャー サイエンティフィ
研磨ディスクトール ラボD50FC
研磨パッドThor LabsNRS9139" x 13"
研磨紙Thor LabsLFG5P5 μmグリット
研磨紙ールラボLFG3P3 μmグリット
研磨紙ールラボLFG1P1 μMグリット
研磨紙Thor LabsLFG03P0.3 μm grit
塩化カリウムSigma-AldrichP9333
水酸化カリウムFisher ScientificP5958
メタンスルホン酸カリウムFisher Scientific83000
QX-314-ClAlomone LabsQ-150
Rimadyl (Carprofen)Henry Schein24751
自己投与チャンバー/ソフトウェアMed AssociatesMED-NP5L-D1
重炭酸ナトリウムSigma-AldrichS5761
塩化ナトリウムSigma-AldrichS7653
水酸化ナトリウムSigma-Aldrich1064980500
L-アスコルビン酸ナトリウムSigma-AldrichA7631
ペントバルビタールナトリウムHenry Schein24352
リン酸ナトリウムSigma-AldrichS9638
スホクレアチンナトリウムフィッシャーサイエンティフィックP7936
ビン酸ナトリウムSigma-AldrichP2256
ステンレス鋼小ネジWWグレインジャー 6GB25M2-0.40mm 小ネジ、パン、フィリップス、A2 ステンレス鋼、プレーン、3 mm
フェルール用定位固定装置アダプターThor LabsXCL
定位固定装置フレームStoelting51603
ショ糖Sigma-AldrichS8501
縫合糸ファイン サイエンス ツール18020-50絹糸;サイズ:5/0、直径:0.12 mm
TEA-ChlorideFisher ScientificT2265
チオ尿素Sigma-AldrichT8656
Vetbond 組織接着剤Covetrus001505
VibratomeLeicaVT1200S
XylazineButler Schein33198
ック ヒートックケです ック AC131210010 トトホピル

参考文献

  1. Connors, N. J., Hoffman, R. S. Experimental treatments for cocaine toxicity: A difficult transition to the bedside. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 347 (2), 251-257 (2013).
  2. Makani, R., Pradhan, B., Shah, U., Parikh, T. Role of repetitive transcranial magnetic stimulation (rTMS) in treatment of addiction and related disorders: A systematic review. Current Drug Abuse Reviews. 10 (1), 31-43 (2017).
  3. Shaham, Y., Shalev, U., Lu, L., De Wit, H., Stewart, J. The reinstatement model of drug relapse: History, methodology and major findings. Psychopharmacology. 168 (1-2), 3-20 (2003).
  4. Rich, M. T., Huang, Y. H., Torregrossa, M. M. Plasticity at Thalamo-amygdala Synapses Regulates Cocaine-Cue Memory Formation and Extinction. Cell Reports. 26 (4), 1010-1020 (2019).
  5. Rich, M. T., Huang, Y. H., Torregrossa, M. M. Calcineurin promotes neuroplastic changes in the amygdala associated with weakened cocaine-cue memories. Journal of Neuroscience. 40 (6), 1344-1354 (2020).
  6. Deisseroth, K. Optogenetics 10 years of microbial opsins in neuroscience. Nature Neuroscience. 18 (9), 1213-1225 (2015).
  7. Gradinaru, V., et al. Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics. Cell. 141 (1), 154-165 (2010).
  8. Nabavi, S., Fox, R., Proulx, C. D., Lin, J. Y., Tsien, R. Y., Malinow, R. Engineering a memory with LTD and LTP. Nature. 511 (7509), 348-352 (2014).
  9. Sparta, D. R., Stamatakis, A. M., Phillips, J. L., Hovelsø, N., Van Zessen, R., Stuber, G. D. Construction of implantable optical fibers for long-term optogenetic manipulation of neural circuits. Nature Protocols. 7 (1), 12-23 (2012).
  10. Stripling, J. S. A simple intravenous catheter for use with a cranial pedestal in the rat. Pharmacology, Biochemistry and Behavior. 15 (5), 823-825 (1981).
  11. Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics. Biophysical Journal. 96 (5), 1803-1814 (2009).
  12. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates Hard Cover Edition. , 466(2013).
  13. Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: Application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Methods in Molecular Biology. 1183, 221-242 (2014).
  14. Bender, B. N., Torregrossa, M. M. Dorsolateral striatum dopamine-dependent cocaine seeking is resistant to pavlovian cue extinction in male and female rats. Neuropharmacology. 182, (2021).
  15. Milton, A. L., Everitt, B. J. The persistence of maladaptive memory: Addiction, drug memories and anti-relapse treatments. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 36 (4), 1119-1139 (2012).
  16. Torregrossa, M. M., Taylor, J. R. Learning to forget: Manipulating extinction and reconsolidation processes to treat addiction. Psychopharmacology. 226 (4), 659-672 (2013).
  17. Kalivas, P. W., Volkow, N. D. The Neural Basis of Addiciton: A Pathology of Motivation and Choice. American Journal of Psychiatry. 162 (8), 1403-1413 (2005).
  18. Stefanik, M. T., et al. Optogenetic inhibition of cocaine seeking in rats. Addiction Biology. 18 (1), 50-53 (2013).
  19. Arguello, A. A., et al. Role of a Lateral Orbital Frontal Cortex-Basolateral Amygdala Circuit in Cue-Induced Cocaine-Seeking Behavior. Neuropsychopharmacology. 42 (3), 727-735 (2017).
  20. Cruz, A. M., Spencer, H. F., Kim, T. H., Jhou, T. C., Smith, R. J. Prelimbic cortical projections to rostromedial tegmental nucleus play a suppressive role in cue-induced reinstatement of cocaine seeking. Neuropsychopharmacology. 46 (8), 1399-1406 (2021).
  21. Cruz, F. C., Javier Rubio, F., Hope, B. T. Using c-fos to study neuronal ensembles in corticostriatal circuitry of addiction. Brain Research. 1628, 157-173 (2015).
  22. Rubio, F. J., et al. Context-Induced Reinstatement of Methamphetamine Seeking Is Associated with Unique Molecular Alterations in Fos-Expressing Dorsolateral Striatum Neurons. Journal of Neuroscience. 35 (14), 5625-5639 (2015).
  23. Siuda, E. R., et al. Spatiotemporal Control of Opioid Signaling and Behavior. Neuron. 86 (4), 923-935 (2015).
  24. McCracken, C. B., Grace, A. A. High-frequency deep brain stimulation of the nucleus accumbens region suppresses neuronal activity and selectively modulates afferent drive in rat orbitofrontal cortex in vivo. Journal of Neuroscience. 27 (46), 12601-12610 (2007).
  25. Zhang, H., Bramham, C. R. Bidirectional Dysregulation of AMPA Receptor-Mediated Synaptic Transmission and Plasticity in Brain Disorders. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 12 (26), (2020).

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