方法論記事

メラノーマ転移の新規メディエーターの同定のための堅牢な発見プラットフォーム

DOI：

10.3791/63186

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2022年3月8日

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1Department of Pathology, NYU Grossman School of Medicine, 2Interdisciplinary Melanoma Cooperative Group, Perlmutter Cancer Center, 3Department of Radiology, NYU Grossman School of Medicine, 4Preclinical Imaging Core, NYU Grossman School of Medicine, 5Ronald Perelman Department of Dermatology, NYU Grossman School of Medicine

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この記事では、メラノーマ転移の新規候補メディエーターを試験するために使用される技術のワークフローとその作用機序について説明します。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

転移は複雑なプロセスであり、 インビトロ アッセイによって不完全にしかモデル化されない障壁を克服するために細胞を必要とする。メラノーマ転移における新規プレーヤーを同定するための、堅牢で再現性のある in vivo モデルおよび標準化された方法を使用して、体系的なワークフローが確立されました。このアプローチにより、特定の実験段階でのデータ推論が可能になり、転移における遺伝子の役割を正確に特徴付けることができます。モデルは、遺伝子組み換えメラノーマ細胞を心臓内、皮内、または皮下注射を介してマウスに導入し、続いて連続 インビボ イメージングでモニタリングすることによって確立される。予め確立されたエンドポイントに到達すると、原発性腫瘍および/または転移を有する器官が採取され、様々な分析のために処理される。腫瘍細胞を選別し、単一細胞RNAシーケンシングを含むいくつかの「オミックス」プラットフォームのいずれかに供することができる。臓器は、転移の全体的な負担を定量化し、その特定の解剖学的位置をマッピングするために、イメージングおよび免疫組織病理学的分析を受ける。生着、モニタリング、組織採取、処理、および分析のための標準化されたプロトコルを含むこの最適化されたパイプラインは、患者由来の短期培養物および様々な固形がんタイプの確立されたヒトおよびマウス細胞株に採用することができる。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

転移性黒色腫に関連する高い死亡率と、世界中で黒色腫の発生率の増加1(2025年までに推定7.86%増加)が相まって、新しい治療アプローチが求められています。標的発見の進歩は、非常に複雑なプロセスである転移の再現可能なモデルにかかっています。転移性カスケードのステップ全体を通して、メラノーマ細胞は、免疫系の回避および遠隔組織のコロニー形成を達成するために無数の障壁を克服しなければならない2。メラノーマ細胞の回復力と適応性は、その高い遺伝子変異負荷3および神経堤起源を含む多数の要因から生じ、重要な表現型可塑性3,4,5を付与する。各ステップにおいて、転写プログラムは、転移メラノーマ細胞が、免疫系6、細胞外環境7,8、およびそれらが接触する物理的障壁9の細胞アーキテクチャを含む微小環境とのクロストークからの手がかりに基づいて、ある状態から別の状態に切り替えることを可能にする。例えば、メラノーマ細胞は、重要な免疫プライミング腫瘍分泌因子6の発現をダウンレギュレートすることによって免疫監視を逃れる。

研究は、メラノーマ細胞がケモカインおよびサイトカインを分泌して、転移のために遠くの「標的」器官をプライミングする「転移前ニッチ」を記述している10。この新知見は、転移性黒色腫細胞の臓器指向性と、それらが遠隔組織にアクセスするためにとる解剖学的経路について重要な疑問を提起する。血管内投与後、メラノーマ細胞はリンパ管(リンパ性スプレッド)および血管(血行性スプレッド)を介して転移することが知られている2,11。ほとんどの患者は限局性疾患を呈するが、症例のごく一部は遠隔転移性疾患を呈し、リンパ管播種(陰性リンパ節関与)を示さず11、黒色腫の代替転移経路の存在を示唆している。

転移部位に定着すると、メラノーマ細胞はエピジェネティックおよび代謝適応を受ける12,13。新しいコンパートメントにアクセスして侵入するために、メラノーマ細胞はプロテアーゼ14および細胞骨格修飾11,15を採用し、それによって新しい場所を横断し、成長することができる。メラノーマ細胞を標的にすることの難しさは、そのような適応の複雑さと数にある。したがって、フィールドはできるだけ多くのステップと適応を実験的に再現する努力をする必要があります。オルガノイドおよび3D培養物16,17などのインビトロアッセイにおける多数の進歩にもかかわらず、これらのモデルは、インビボ転移カスケードを不完全にしか再現しない。

マウスモデルは、再現性、技術的実現可能性、およびヒト疾患のシミュレーションのバランスをとることによって価値を示してきた。患者由来の異種移植片または短期培養物から免疫不全またはヒト化マウスに血管内、同時および異所性に移植されたメラノーマ細胞は、転移性メラノーマにおける標的発見のバックボーンを表す。しかし、これらのシステムはしばしば転移に対する重要な生物学的制約、すなわち免疫系を欠いている。この制約を有する同系黒色腫転移モデルは、この分野では比較的希少である。これらの系は、免疫担当マウスにおいて開発された、B16−F1018、YUMMファミリーの細胞株19、SM120、D4M3 21、RIM322、またはより最近では、RMS23およびM1(Mel114433)、M3(HCmel1274)、M4(B2905)24メラノーマ細胞株を含む、メラノーマ進行における宿主免疫応答の複雑な役割の調査を容易にする。

ここでは、メラノーマ転移標的同定のためのパイプラインが提示される。メラノーマ患者コホートから生成される「オミック」データセットがますます増えるにつれて、最も臨床的に有望な研究はビッグデータ統合から生じる研究であり、細心の注意を払った機能的および機械的な尋問につながると仮定します25,26,27,28。転移過程における潜在的な標的を研究するためにマウスモデルを使用することにより、生体内特異的事象および組織相互作用を説明することができ、したがって臨床翻訳の確率を高めることができる。転移性負荷を定量化するための複数の方法が概説され、任意の所与の実験の結果に関する補完的なデータを提供する。様々な臓器の腫瘍から単一細胞単離のためのプロトコルは、単一細胞またはバルクRNAシーケンシングに先行する可能性のある転移細胞における遺伝子発現の偏りのない特性評価を支援するために記載されている。

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プロトコル

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注:以下のプロトコルに関連する動物手順は、ニューヨーク大学機関動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認されました。すべての手続きは、国際実験動物ケア評価認定協会(AAALAC)によって承認された施設で行われます。 図1は 、一般的な実験的アプローチを示しています。

1. 患者由来メラノーマ短期培養物(STC)

  1. 1mLの完全RPMI(10%ウシ胎児血清(FBS)、2mM L-グルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム、1x MEM非必須アミノ酸溶液、およびペニシリン(100IU/mL)/ストレプトマイシン(100μg/mL)を添加したRPMI 1640)を含む60mmペトリ皿に組織を置く。
    注:腫瘍細胞の比率を高めるには、必要に応じて、滅菌手術器具を使用して、顕微鏡下で、ペトリ皿内の腫瘍を取り囲む組織を解剖および除去する。
  2. 滅菌したカミソリの刃を使って新鮮な組織を1〜2mmの立方体に細かく切ります。4 mLの完全RPMIおよびピペットを10 mL血清学的ピペットでプレートの内容物を5〜10回上下に加える。
  3. 細胞懸濁液を15mLポリプロピレン円錐管に移し、細胞をスピンダウン(180×g、4°Cで5分間)する。上清を吸引し、細胞ペレットを1mLの新鮮な培地に再懸濁し、懸濁液を25cm2組織培養フラスコに移した。
  4. 組織断片が底に付着するのを助けるために、37°C、5%CO2の組織培養インキュベーターで20°-30°の角度で傾けたフラスコを20 分間セットする。
  5. 培地が組織を覆うようにフラスコを平らに置き、培養の状態を毎日確認する。セルが90〜100%のコンフルエントに達したら細胞を分割します。短期培養物を「低い」継代数に維持する。
    注:STCは細胞単離および培養の約2ヶ月後に確立されますが、実際のタイムラインはサンプルと腫瘍タイプによって異なります。10〜14継代後、細胞株は純度100%に達し、メラノーマ細胞29のみを含む。継代数閾値は、細胞形態の変化、倍加時間、および インビボでの挙動を観察することによって経験的に決定される。親腫瘍の不均一性および他の特徴を維持するために、細胞を1:5を超えて分割しないでください。
  6. STCの樹立時に、そしてその後のステップで説明するように動物に注射される任意の細胞株モデルを用いて、レポーターを用いて細胞を形質導入する。
    注:例えば、蛍光タグ(例えば、赤色蛍光タンパク質(RFP)、緑色蛍光タンパク質(GFP))は、蛍光活性化細胞ソーティング(FACS)による腫瘍細胞の エクスビボ 免疫蛍光イメージングおよびソーティングを可能にする。ルシフェラーゼは、 インビボ 生物発光イメージングを可能にする、実験進行をモニタリングするための有用なツールである(セクション4)。

figure-protocol-1
図1:記載されたワークフローを示す概略図は、患者データ統合からマウスからのインビボデータの生成および分析までである。略語: LOF = 機能の喪失;GOF = 関数のゲイン。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

2. 異種移植移植

注:ここで説明する実験手順は、適応免疫系および自然免疫系が損なわれたマウス、NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ(NSG)マウスで実施される。または、T細胞欠損無胸腺/ヌード(NU/J)マウスのような獲得免疫のみを欠いているマウスにおいて。動物は男性の性別、8〜10週齢です。雌は、腫瘍細胞の心臓内注射時に生殖腺転移の発生率が高いことが多く、生存率を低下させる。

  1. 皮下注射および皮内注射の場合は、1xダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)に懸濁した細胞の一部と、解凍した細胞外マトリックス基質(EMS)1部とを混合して1:1細胞懸濁液を調製し、4°Cで氷上に保持する。 血管内(心臓内、頸動脈内、後眼窩、尾静脈、または脾臓)注射の場合、DPBSのみに細胞を懸濁させる。
    注:皮内注射の適切な容量は、できるだけ低く抑える必要があります(30 μL)。皮下注射の場合、注射量は最大150μL、血管内注射では最大250μL(動物の体重に基づく)までです。注射された量およびスリップチップ内の死量および針のそれを説明するために使用されるシリンジに基づいて、注射液の10〜30%の余分な量を最終的な細胞懸濁液に加える(例えば、30G、25mm針の100μLの死容量を有する1mLツベルクリンジ)。
  2. 使用中の細胞株の挙動および インビボでの腫瘍進行のタイムラインを特徴付けるためにパイロットを実施する。皮内注射の場合は、まず1,000~50,000細胞/30 μLを注射します。皮下注射の場合は、まず10,000個から2個×106 個/150 μLまで注射します。血管内(心臓内、頸動脈内、眼窩後、脾臓)注射の場合は、まず50,000細胞/150 μLを注射します。
    注:血管内注射は、循環器系に空気を導入するか、または小血管を閉塞する過剰な数の細胞を使用することによって、動物を塞栓事象の素因とする。凝集を避けるために細胞懸濁液をよく混合する。細胞懸濁液を装填する前にシリンジをプライミングする。シリンジ内の気泡を取り除きます。細胞懸濁液/注射器を、装填および注入時間まで氷上に保管する。
  3. 吸入による麻酔を投与する。酸素レベルレギュレーターを1~2 L/minに設定します。誘導のために2.5-5%、維持のために1.5-3%に設定されたイソフルラン気化器で誘導チャンバーに動物を置きます。
    注:麻酔導入期に動物の呼吸と心拍数を監視します。動物を放置 しないでください 。同時に複数の動物を監視し ないでください 。麻酔 の量を動物の 体重に合わせる。
  4. 動物を誘導室から鼻錐形に移動します。処置中の角膜乾燥を防ぐために、動物の目に滅菌ワセリン眼軟膏を塗布する。
  5. まっすぐなカミソリの刃を30°の角度で傾けて処置部位を剃ります。70%イソプロピルアルコール綿棒で処置領域の皮膚をきれいにする。さらなるステップの前に、ペダル反射による麻酔の十分なレベルを評価する。
  6. 皮内注射の場合は、バイオセーフティキャビネット内で手順全体を実行して、無菌状態を維持します。
    1. 手順2.3-2.5で説明されているように動物を麻酔して剃ります。
    2. 針刺しの軌道に対して皮膚を後方につかんで引っ込めます。鋭角に保持された長さ6mmの31Gインスリン注射針を使用して、ベベルを上に向けて皮膚を優しく穿刺する。
    3. 針の先端で圧力解放を感じてください。皮内区画内にとどまり、皮膚の深さ全体を表皮下腔に通過しないように静かに進めてください。 重要:皮下腔に滑り込んだ場合は、針を外し、注射領域を変更して針を再挿入します。ドーム状の疣贅が観察されるまで、細胞懸濁液の全容量(30μL)をゆっくりと注入する。
      注: 注入量が少ないと、スキン層の解剖が少なくなり、アーキテクチャの歪みが少なくなります。
    4. 針を入れたままにして、5まで数えます。
      注:EMSは体温で粘性になり、針の穿刺傷を通る逆流を避けるのに役立ちます。
    5. 針を外し、動物を暖かいパッドのケージに一欄して回復させます。意識を取り戻した後、胸骨と歩行可能なときに動物をビバリウムケージに戻します。
      注:このプロトコルに記載されているすべての手順の間、動物を継続的に監視してください。動物を放置したり、複数の動物を同時に監視したり しないでください 。
    6. 腫瘍の成長、体重減少、および全体的な健康状態の進行を、動物が体重を減らし始めた後、動物が体重を減らし始めた後、獣医スタッフと共同で毎日毎日監視します。これらのモニタリングセッション中:動物の体重を量り、体重減少を監視するためのチャートをプロットし、腫瘍潰瘍化、神経学的、自発運動、および/または行動徴候(嗜眠、グルーミングの欠如、食物または水分摂取量の減少)の徴候をチェックする。
      注:進行した疾患(20%以上の体重減少、<2の体調スコア、極端に低下した活動レベル、麻痺、または発作)の徴候を観察した直後に動物を安楽死させる。施設のIACUCによって承認された安楽死方法を使用する(例えば、自動卓上CO2チャンバーを使用して動物をCO2に15分間曝露し、続いて子宮頸部脱臼、断頭、または胸郭を切開することによって両側に誘導された気胸のいずれかの二次的安楽死方法)。
    7. ノギスで測定を行い、腫瘍の長さ(L)と幅(W)の寸法を使用して、次の式で体積(V)を計算します。
      figure-protocol-2
  7. 皮下注射の場合:
    1. バイオセーフティキャビネット内で手順全体を実行して、無菌状態を維持する26,27.
    2. 手順2.3-2.5で説明されているように動物を麻酔して剃ります。
    3. 28G〜31Gのインスリン注射針(長さ6mm)を鋭角に保持して、斜めを上に向けて皮膚を優しく穿刺する。表皮、真皮、および下皮を通過しながら、針の先端で圧力解放を 2回 感じてください。
      注:針の先端に圧力解放が2回目に感じられたときは、皮下コンパートメントに到達したことを示します。
    4. 細胞懸濁液の全容量(30〜150μL)を、細長い楕円状の疱疹が観察されるまでゆっくりと注入する。針を入れたままにして、5まで数えます。容量が大きい場合(50 μL以上)は10にカウントします。
      注:EMSは体温で粘性になり、針の穿刺傷を通る逆流を避けるのに役立ちます。
    5. 針を外し、動物を暖かいパッドのケージに一欄して回復させます。意識を取り戻した後、胸骨と歩行可能なときに動物をビバリウムケージに戻します。
      メモ:手続き後のモニタリング中は、合併症(低呼吸数、出血、回復の遅さ)の兆候がないか観察し、適切に対処してください。改善が観察されない場合は、ステップ2.6.6の注に記載されている人道的安楽死手順に進みます。
    6. 腫瘍の成長、体重減少、および全体的な健康状態について、ステップ2.6.6-2.6.7で説明されているように動物を監視する。
  8. 心臓内注射の場合:
    1. バイオセーフティキャビネット内で手順全体を実行して、無菌状態26,30を維持します。
    2. 手順2.3-2.4で説明されているように動物を麻酔します。
    3. 動物を超音波装置の加熱されたプラットフォームに移し、低アレルギー性テープで鼻錐に固定する。
    4. 30°の角度で傾けたまっすぐなカミソリの刃で胸部を剃ります。イソプロピルアルコールの3つのアプリケーションと交互に10%ポビドン - ヨウ素の3つのアプリケーションで手順領域の皮膚をきれいにする。
    5. さらなるステップの前に、ペダル反射による麻酔の十分なレベルを評価する。手順部位に超音波ゲルを塗布する。
    6. 超音波プローブで心臓窓をキャプチャします。超音波プローブを動物の左側に胸郭の中央に配置し、水平窓を撮像して左心室の断面図(短軸)を得た。プローブの長軸が上を向いていることを確認し、プローブを50°の角度で固定し、加熱されたプラットフォームを20°の角度で固定します。プローブとサポートフレームを所定の位置にロックします。
    7. バイオセーフティキャビネット内で作業しながら、30G、25mmの針を備えたツベルクリン1mLシリンジで細胞懸濁液を引き出します。シリンジ内の気泡を取り除きます。
      注:細胞が処理および注入されている間、単一細胞懸濁液を作成し、維持することが重要です。気泡を除去することは、空気塞栓症を回避するための重要なステップである。十分にプライミングされた注射針システムは、実験群における回避可能な死を防ぐであろう。注射するよりも多くのボリュームをシリンジに常に引き込む。余分な容量は、細胞懸濁液の一部を1.5mLチューブに戻すことによって空気を除去するのに役立ちます。
    8. シリンジを定位インジェクターにロックします。超音波ガイダンスの下で、針を胸壁を通って心臓の左心室に進める。細胞懸濁液の全容量(100〜250μL)をゆっくりと注入する。
    9. 針を外し、動物を暖かいパッドのケージに一欄して回復させます。意識を取り戻した後、胸骨と歩行可能なときに動物をビバリウムケージに戻します。ステップ2.6.6で説明したように、腫瘍の成長、体重減少、および全体的な健康状態について動物を監視します。
  9. 頸動脈内注射の場合:
    1. 無菌状態30を維持するために、適切に消毒された表面上で手順全体を実行します。
    2. ケタミン(100mg / kg)およびキシラジン(10mg / kg)カクテルで、インスリン注射器、28G針による腹腔内注射によって動物を麻酔する。処置中の角膜乾燥を防ぐために、動物の目に滅菌ワセリン眼軟膏を塗布する。
    3. まっすぐなカミソリの刃を30°の角度で傾けて手順領域を剃ります。さらなるステップの前に、ペダル反射による麻酔の十分なレベルを評価する。
    4. 動物を温暖化パッド上の実体顕微鏡の下に置きます。イソプロピルアルコールの3つのアプリケーションと交互に10%ポビドン - ヨウ素の3つのアプリケーションで手順領域の皮膚をきれいにする。
    5. 滅菌個人用保護具(PPE)と滅菌手袋を着用してください。動物の体の上に滅菌ドレープを敷くことによって滅菌フィールドを準備する。
      注:滅菌ドレープに切開部のサイズと位置に適した穴がない場合は、ドレープを半分に折り、メッツェンバウムハサミを使用して滅菌ドレープの中央にある適切なサイズの穴を切ります。
    6. メスまたはアイリスハサミを使用して、首の半分から胸骨までの皮膚を切開します。2つの微小手術鉗子を用いて、正中線平面上の2つの顎下唾液腺を鈍く解剖する。必要に応じて、止血のために電気焼灼を使用してください。
    7. 総頚動脈(CCA)を取り囲む筋膜をマヌブリウムから分岐部に向かって解剖し、内側に続けて外頸動脈の後壁を解放する。注射する前に外頸動脈(ECA)を一時的にクリップします。
      注:CCAの周囲を解剖するときは、迷走神経(動脈の外側にある)を損傷しないように注意する必要があります。
    8. 細胞懸濁液を33G、15mm針で1mLシリンジにロードする。
    9. CCA の下に 2 つの 7-0 合字を渡し、2 つの合字のそれぞれに対して緩いインストゥルメント ノットを実行します。5 mm、10 Gの圧力容器クリップを使用し、ECAを一時的にクリップします。近位合字を結ぶ。次に、遠位合字をゆるやかに結びます(CCAの分岐部の隣)。遠位ループを後で使用して、注射後の出血を制御します。
    10. 33 G、15 mmの針が付いたシリンジを使用して、針のベベルを上向きに鋭角にしてCCAを静かに穿刺します。細胞懸濁液の全容量(50〜150μL)をゆっくりと注入する。
    11. 遠位ループを鉗子で把持し、針を外しながら持ち上げてCCAの内腔を塞ぎ、出血を止めます。シリンジを#7ジュエラー鉗子と交換し、遠位ループを結びます。
    12. 遠位合字に別の器具の結び目を投げ、ECAから容器クリップを取り外します。出血のために手術野を制御し、閉鎖前に出血血管を焼灼する。9mmのホチキス止め装置を使用して動物の皮膚を閉じ、動物を暖かいパッドの上に置き、回復させます。
      注:術後7〜10日でホッチキスを取り除いてください。
    13. 鎮痛薬 - ブプレノルフィン(0.3mg / mL)を0.1mg / kgの濃度で術後72時間、12時間ごとに皮下に投与する。
      注:あるいは、72時間ごとに1回投与する必要がある徐放性鎮痛薬の使用を検討してください。
    14. 意識を取り戻した後、胸骨と歩行可能なときに動物をビバリウムケージに戻します。手術部位の感染や痛み、一般的な健康状態、合併症の兆候がないか、術後に毎日動物を監視します。
      注:生存手術からうまく回復しない動物には、追加の鎮痛剤が投与され、手術後72時間以内に完全に回復しない場合、人道的に安楽死させられます。
    15. ステップ2.6.6で説明したように、腫瘍の成長、体重減少、および全体的な健康状態について動物を監視します。
  10. 眼窩後注射の場合:
    注:このテクニックは、オペレーターがこのテクニックで訓練され、熟練している場合、および強い科学的正当性がある場合に、尾静脈注射の代替として使用します。この経路を介して送達される細胞懸濁液は、後眼窩空間における腫瘍増殖を誘導することができる。したがって、この手法を選択する際には、リスクと利点を慎重に考慮する必要があります。例えば、吻合を介した眼窩後静脈洞と脳内静脈との直接循環接続を利用するには、脳腫瘍形成が他の注射経路を使用して失敗した場合にこの方法を選択する。
    1. バイオセーフティキャビネット内で手順全体を実行して、無菌状態を維持します。滅菌PPEと手袋を着用してください。
    2. 手順2.3-2.4で説明されているように動物を麻酔します。
      注:この手順では、注射を妨げるため、滅菌ワセリン眼科軟膏を動物の目に塗布しないでください。局所麻酔薬のみを適用する。
    3. 細胞懸濁液をインスリン注射器に28〜31G、6mmの針でロードする。
    4. 動物を臆病な姿勢にして、目が突き出るまでまぶたを引っ込めます。局所麻酔薬1滴を処置を受けている側の眼に塗布する。
    5. 目と内側のエピカンサスの間に30〜45°の角度で針を挿入し、ベベルを下に向けて挿入します。細胞懸濁液(10-150 μL)をゆっくりと注入する。
      注:動きが遅いほど、眼の損傷や注射液の逆流を防ぐことができます。
    6. 2.7.5-2.7.6 で説明されている手順を実行します。
  11. 脾臓注射の場合:
    1. バイオセーフティキャビネット内で手順全体を実行して、無菌状態31を維持する。滅菌PPEと滅菌手袋を着用してください。
    2. 手順2.3-2.5で説明されているように動物を麻酔して剃ります。
    3. 動物を右横横臥位に置きます。イソプロピルアルコールの3つのアプリケーションと交互に10%ポビドン - ヨウ素の3つのアプリケーションで手順領域の皮膚をきれいにし、ステップ2.9.5で説明されているように手術野を準備します。
    4. メッツェンバウムはさみまたはメスを使用して、腹壁の左脇腹に1cmの切開を行い、続いて腹膜に切開する。
      注:脾臓は、皮膚切開を行った後、半透明の腹壁を通して見られます。腹膜切開をこの部位で正確に行う。
    5. 切開部を通して脾臓および脾臓丘疹を露出させる。長さ6mmの28〜31Gインスリン注射針を使用して、針の斜めを上向きに鋭角にして脾臓を静かに穿刺する。
      注:穿刺傷が出血した場合は、出血と逆流を制限するために部位を焼灼してください。
    6. 細胞懸濁液の全容量(50〜100μL)をゆっくりと注入する。針を外します。脾臓に小さなガーゼを置き、鉗子で圧力をかけます。細かい蚊の鉗子を使ってガーゼの間に脾臓を軽く締め付け、15分間待ちます。
    7. 脾臓丘疹を3-0または4-0の絹縫合糸で結び、必要に応じて血管を焼灼することによって脾臓摘出術を行う。5-0ポリジオキサノン(PDS)またはポリグリコール酸吸収性縫合糸で腹膜を閉じる。
    8. ステップ 2.7.5-2.7.6 で説明されているステップを実行します。
      注:出血合併症を呈する動物、または手術後72時間完全に回復していない動物は、人道的に安楽死させるべきです。マウスの幸福は常に優先事項であることを忘れないでください。

3. 段階的生存手術(SSS)

  1. ステップ2.2からの実験的結論に基づいて、生存手術までの適切な時間を決定する。細胞株および実験仮説に応じて、腫瘍切除のためのより早い時点(腫瘍体積= 150mm3)またはそれより後の時点(腫瘍体積= 500mm3)を選択する26。
    注:腫瘍体積限界は、腫瘍量が動物の幸福に有害であり、合併症の素因となるほど十分に高い場合、1,500mm3である。
  2. 手順2.3-2.5で説明されているように動物を麻酔して剃ります。
    注:手順全体はバイオセーフティキャビネット内で実行されます。
  3. イソプロピルアルコールの3つのアプリケーションと交互に10%ポビドン - ヨウ素の3つのアプリケーションで手順領域の皮膚をきれいにし、ステップ2.9.5で説明されているように手術野を準備します。
  4. アイリスハサミまたはメスを使用して皮膚を切開し、腫瘍の端から5〜7mmの切除マージンを維持する。
    注:切除のマージンは、腫瘍が局所的に広がる能力に依存する。攻撃的な腫瘍の場合は、切除マージンを増やしながら、創傷閉鎖を行うのに十分な皮膚が残っていることを確認してください。
  5. 皮内腫瘍の場合、周囲皮膚とともに腫瘍を切除する。
  6. 皮下腫瘍の場合は、皮膚下の腫瘍を解剖して除去する。
    注:腫瘍が腹膜および/または皮膚に浸潤した場合は、腫瘍と 一括 して切除し、5-0/4-0 PDSまたはポリグリコール酸吸収性縫合糸で腹膜を閉じる。
  7. 9mmのホチキス止め装置で傷口を閉じます。
    注:術後7〜10日でホッチキスを取り除いてください。鎮痛薬を投与し、動物を暖かいパッドの上に置き、回復させる。鎮痛薬を術後72時間、ステップ2.9.13に従って12時間に1回投与し続ける。出血合併症のある動物や、手術後に完全意識を取り戻していない動物は、人道的に安楽死させられるべきです。
  8. 動物をケージに入れ、暖かいパッドに集めて回復させます。意識を取り戻した後、胸骨と歩行可能なときに動物をビバリウムケージに戻します。
  9. 手術後の動物の局所再発、体重減少、神経学的、運動力、および/または行動徴候(嗜眠、グルーミングの欠如、食物または水分摂取量の少なさ)および全体的な健康状態について、引き続き監視する。

インビボイメージング(図2A)

  1. D-ルシフェリン基質(150mg/kg)を1mLインスリン注射器、28G針による腹腔内注射により動物に投与する。
    注:腫瘍細胞は、ルシフェラーゼcDNAで安定に形質導入されなければならない。
  2. ステップ2.3〜2.4に記載されているように麻酔を誘導し、D-ルシフェリン基質注射の6分後に投与する。
  3. 生物発光イメージング(BLI)スキャナ(in vivo イメージングシステム)26を用いてイメージングを行う。
  4. 動物をイメージングチャンバー内およびノーズコーン内に移動します。イメージングシステムの容量に応じて、最大5匹の動物を同時に画像化します。
  5. 初期化を押して計測器を起動します。露出時間設定を自動(1~120秒)に設定します。
  6. 必要に応じて、空白の画像をキャプチャして背景を減算します。「取得」をクリックし、 取得 シーケンスの完了後に画像を保存します。
  7. 動物をケージに戻し、ケージにベース表面積の50%を温めパッドの上に置き、麻酔から回復させます。意識を取り戻した後、胸骨と歩行可能なときに動物をビバリウムケージに戻します。
  8. 画像を撮影したのと同じ in vivo イメージングソフトウェアでデータ解析を行う場合は、画像が保存されているフォルダに移動し、実験に関連するすべてのマウスの画像を一度に開きます。
    メモ: 一度に 1 つの画像を分析しても、グループ間で正規化することはできません。
  9. 単位を放射輝度 (カウントではない) に設定します。個人を示すチェックボックスがオフになっていることを確認します。これは、グループ間でのシグナルの正規化を妨げるためです。
  10. 関心領域 (ROI) 描画ツールを使用して、脳領域の円形 ROI と身体の長方形の ROI を描画します。耳と鼻は不特定の発光を発する傾向があるため、脳ROIから耳と鼻を除外するように注意してください。このプロセスでのバイアスを最小限に抑えるために、発光信号が重なることなく、マウスの写真にのみROIを描画します。
  11. [ROIの測定]を選択して信号を定量化し、データをスプレッドシートにエクスポートします。対象となる身体領域の総発光フラックス(p/sec/cm2/sr)をプロットして、グループ間の差を分析します。
    注:脳指向性における群間の差を具体的に評価するには、各マウスの脳信号と身体信号の比を計算する。これは、全体的な腫瘍量におけるマウス間変動および実験群間のルシフェラーゼ発現レベルの差について対照する。

5. 生体外 磁気共鳴イメージング

  1. 安楽死直後に エクスビボ MRIを行う。あるいは、目的の器官を採取し、ホルマリンで最大72時間固定し、後の時点でイメージングを行う。
  2. NMRコンソールとゼロボイルオフ、水平ボアマグネットまたは同様の機器を備えた7テスラ(7-T)(300MHz)マイクロMRIシステムで画像を取得します。
    メモ:性能の正しいトレードオフを備えたアクティブシールド勾配コイルインサートの必要性は非常に重要です。少なくとも 50 mm の動的球面体積 (DSV) の勾配直線性を提供して、幾何学的歪みなしで同時に検査されるサンプルのセットをカバーする必要があります。勾配強度(440~750mT/mの範囲)とデューティサイクルの組み合わせにより、3 x 30 A~3 x 87Aの範囲の最大同時DC電流が可能になり、適切なイメージング性能が得られます。使用されるグラジエントコイルインサート( 材料表を参照)は、660mT/m、130μsの立ち上がり時間、3 x 87A、DSV = 80mmの性能を実現します。
  3. 市販の送受信円偏波マウス全身無線周波コイル(OD = 59 mm、ID = 38mm、L = 40 mm)でスキャンを実行し、 1 H陽子Larmor周波数を300.16 MHzにチューニングします。
    注:このrfプローブは、8-12時間にわたる一晩のスキャン中に、サブミリメートル等方性分解能(<150μm)の3Dデータセットの取得を可能にします。
  4. 複数の配列30を用いて腫瘍量を検出する。
    注:再集束エコー(RARE)配列によるT2強調ラピッドイメージングによって検出された超強烈なシグナルは、腫瘍周囲の浮腫を認識する。
  5. 次の取得パラメータで3D RAREシーケンスを実行します:[120 μm]3等 方性分解能;取得時間5時間27分。繰り返し時間 (TR) = 500 ミリ秒;エコー間隔 (ES) = 12.7 分;ターボ係数TFx = 12;実効エコー時間(TEeff) = 76.2 ミリ秒;帯域幅 (BW) = 75 KHz;行列サイズ = 2843;視野 (FOV) = [4.0 mm]3;平均数 (Nav) = 6。
  6. 次のパラメータを使用して転移を検出します。
    1. シグナルを明るくする色素沈着転移の場合、次のパラメータを持つT1強調3Dグラジエントエコーシーケンスを使用します:[120μm]3 等方性分解能;取得時間2時間、41分。TR = 20 ミリ秒;エコー時間 (TE) = 4.0 ミリ秒;フリップ角(FA) = 18°;BW = 75 KHz;行列サイズ = 2843;視野 = [34.0 ミリメートル]3;ナビゲーション = 6。
    2. 色素沈着および/または出血性転移の場合、T2*加重マルチグラジエントエコー(MGE)シーケンス(3D MGE、[120μm]3等方性分解能;取得時間3 時間35分;TR = 40 ミリ秒;TE = 3.6 ミリ秒;ES = 3.2 ミリ秒;4エコー;FA = 20°;BW = 100 kHz;行列サイズ = 2843;視野 = (34.0 ミリメートル)3;ナビゲーション = 4。
  7. 腫瘍量を定量するために3つの配列すべてを使用する。
  8. 解析中に同定された腫瘍領域を組織学的切片と相互参照して、精度を確保します。セクション 7 および 8 を参照してください。

6. 単一細胞またはバルクRNAシーケンシングのための組織プロセシング

  1. 施設のIACUCによって承認された方法を使用して動物を安楽死させる。ステップ 2.6.6 の注で説明されている手順の 1 つを参照してください。
  2. 目的の臓器を解剖し、氷上のハンクスバランスソルト溶液(HBSS)を含むプレートの別々のウェルに入れます。迅速に作業し、細胞生存率を最大化するために、常に氷の上に組織を維持します。
    注: 次の手順は、脳の処理に固有のものです。必要に応じて、コラゲナーゼの種類を特定の組織に合わせて調整します。
  3. 各ウェルに3mLのHBSSを含む6ウェルプレートを調製する。
  4. 解剖を視覚化し、さらにガイドするには、蛍光顕微鏡を使用して標識された領域を特定します。
  5. 蛍光領域を解剖し、組織断片を6ウェルプレート(個々の転移病巣を分析する場合は1ウェルあたり1断片、同じ器官内の複数の転移を分析する場合は1つの器官からの複数の断片)に配置する。滅菌カミソリの刃を使用して、組織をできるだけ小さな断片に細かく刻みます(サンプルごとにこのステップに1〜2分以上費やす必要はありません)。
    注:腫瘍の処理時間を制限することは、細胞生存率を維持するのに役立ちます。
  6. 各ウェルの内容物を吸引し、15mLの円錐管に移す。
    注: 1,000 μL のピペットチップの先端を切断して、より大きなフラグメントの移送を容易にします。
  7. 1 mL の HBSS をウェルに追加し、残りの組織断片/細胞が 4 mL の最終容量を含む 15 mL チューブに移されることを確認します。各チューブに50 μLのコラゲナーゼタイプI(40 mg/mL)および12.5 μLのDNase I(2,000 units/mL)を加える。
  8. 円錐管を37°Cで45分間加熱した水浴中に置く。円錐形のチューブを5分ごとに簡単に渦巻きます。
  9. 70μmのストレーナーをHBSSでプリウェットします。滅菌された微量遠心管の蓋付き端部またはシリンジプランジャーのプラスチック部分を使用し、70μmのストレーナーを介して組織ホモジネートを新しい50mL円錐管に粉砕する。
    メモ: HBSS または FACS バッファでストレーナーをプリウェットすると、ひずみがしやすくなります。
  10. ストレーナーを1 mLのHBSSで洗ってください。40μmのストレーナーをHBSSでプリウェットします。各サンプルを40μmのストレーナーを通して新しい50mL円錐管に再度ろ過します。40 μm のストレーナーに FBS 1 mL を加えて洗浄します。円錐形のチューブを常に氷の上に置いてください。
  11. 円錐形のチューブを氷冷DPBSで50mLまで満たします。セルをスピンダウンします(180× g を4°Cで10分間)。上清を捨て、細胞ペレットを失わないように注意する。
    注: 脳サンプルの場合、細胞を2.5mLの38%密度分離溶液(HBSSで希釈し、室温(RT)で保存)に再懸濁する。5 mL FACS チューブに移します。800 × gで20分間スピンします。1,000 μLのピペットチップの先端を切り取り、上部の脂肪層を除去します。チューブの壁に脂肪を残さないでください。脂肪が残っている場合は、もう一度スピンダウンしてプロセスを繰り返します。これは 重要な ステップです。残りの液相を除去します(ペレットは半透明で視覚化しにくい)。
  12. 細胞を1 mLの赤血球(RBC)溶解バッファーに再懸濁し、RTで60秒間インキュベートします。
  13. 細胞を180 × g



  7. &E

figure-protocol-3
&E染色画像の例は&E染色画像&E









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結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

以下の図は、記載されたワークフローがメラノーマ転移の新規ドライバーの同定にどのように適用されたかを示す。 図2 は、 in vivo メラノーマ転移におけるフコシルトランスフェラーゼFUT8のサイレンシングの効果が研究された公表された研究の結果をまとめたものである26。簡単に言えば、ヒト患者のグリコミックデータ(レクチンアレイによって得られた)およびトランスクリプトームプロファイリングの分析は、原発性黒色腫から転移性黒色腫への進行に関連するα−1,6−フコースのレベルの増加を明らかにし、対応するフコシルトランスフェラーゼ(FUT8)の増加と一致した。

FUT8 shRNAまたは対応する非標的コントロール(shNTC)を担持するレンチウイルスで形質導入された113/6-4Lメラノーマ細胞を、上述のように、超音波誘導心臓内注射によって免疫不全マウス(NSG)に導入した(セクション2.9)。マウスを、 in vivo BLIによる転移性播種につい...

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ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このテクニカルレポートの目的は、メラノーマ転移における潜在的なアクターの調査のための標準化されたトップツーボトムのワークフローを提供することです。 in vivo 実験はコストと時間がかかる可能性があるため、効率を最大化し、得られる情報の価値を高める戦略が最優先事項です。

同じ実験内で調査結果をクロスバリデーションするために、全体を通して補完的なアプローチを使用することが不可欠です。例えば、NuMA免疫組織化学染色およびBLIはいずれも包括的ではないため、転移性負荷を定量する相補的な方法である。BLIは、 インビボでの腫瘍進行を追跡する非常に貴重で非侵襲的な方法ですが、これらのデータは本質的に低分解能です。NuMA染色は、固定臓器における転移性負荷の詳細な分析を可能にする。しかし、組織全体の厚さを網羅した切片化は実用的ではありません。そのため、各臓器のサンプルのみを染色することができます。実際、著者らの経験では、BLIの結果は、組織病理学的解析で明らかな腫瘍量に必ずしも正比例するわけではない。これは、部分的には、経頭蓋減衰

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は宣言する利益相反を持っていません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我々は、NYU Langone Healthの先端研究技術部門(DART)、特に、Perlmutter Cancer Center Support Grant NIH/NCI 5P30CA016087によって部分的に支援されている実験病理学研究所、ゲノム技術センター、サイトメトリーおよび細胞選別研究所、前臨床イメージングコアに感謝する。我々は、IRBが承認したプロトコール(ユニバーサル・コンセント研究#s16-00122および学際的メラノーマ協同組合グループ研究#10362)を通じて得られた患者由来のメラノーマ短期培養物+ (10-230BMおよび12-273BM)へのアクセスを提供してくれたNYU学際的メラノーマ協同組合グループ(PI:Dr. Iman Osman)に感謝する。113/6-4Lおよび131/4-5B1メラノーマ細胞株*を提供してくれたロバート・カーベル博士(トロント大学)と、WM 4265-2、WM 4257s-1、WM 4257-2メラノーマ短期培養**を提供してくれたMeenhard Heryn博士(Wistar Institute)に感謝します。E.H.は、NIH/NCI R01CA243446、P01CA206980、米国癌協会-メラノーマ研究同盟チームサイエンス賞、およびNIHメラノーマSPORE(NCI P50 CA225450;パイ:I.O.)。 図 1 は、 Biorender.com を使用して作成されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
#15 スケーペルブレード WPI500242外科手術用
#3 スケープ ハンドルWPI500236外科手術用
1 mL ツベルクリン シリンジ、スリップ チップ BD309626注射剤
10 mL シリンジ、スリップチップ BD301029灌流
10% ホルマリン ナトリウム緩衝EK インダストリー4499-20L灌流/組織固定用
15 mL コニカルコーニング 430052細胞培養
15 mL 円錐形ポリプロピレン遠心分離管ファルコン352196細胞培養
200 プルーフ エタノールDeacon Labs04-355-223組織学
22G – 22mm 針BD305156灌流
4-0 ビクリル縫合糸EthiconJ464G縫合糸
4% カーソンリン酸緩衝液パラホルムアルデヒド EMS15733-10灌流/組織固定用
40µmCorning431750組織処理
5-0 吸収性縫合糸 Ethicon6542000クロー
50 mL コニカル コーニング 430828細胞培養
50mL 円錐形ポリプロピレン遠心分離管Falcon352070細胞培養
7-0 シルク縫合糸 FST18020-70紮糸70
µmCorning431751ティッシュプロセッシング
アンチフェード封入剤  Vector LabsH-1000-10鉗
子を塗布する免疫蛍光近似器、10cm WPI14189顕微手術用
AvanceBruker3 HDNMR Console 
バイオスペック7030 ブルカー7030マイクロMRI
BSABioregA941NuMA染色
カストロビエホ縫合鉗子、ストレートチップ5.5mm結束プラットフォーム、11cm WPIWP5025501顕微手術用
Coplin Staining JarBel-Art F44208-1000組織学
DAPISigma-AldrichD9542-1MG免疫蛍光
dCas9-KRABAddgene110820遺伝子操作
DNase INEBM0303L組織処理
DPBSコーニング21-030-CM組織処理
超シャープ コーティングされていない片刃GEM62-0167ティッシュプロセッシング
細胞外マトリックス基質 コーニング354234成長因子の減少を考慮します(代替案として 
FBSCytivaSH30910.03細胞培養
Fiji Image JFiji Image JSoftwareImmunofluorescence
Goat anti-rabbit HRP conjugated multimer サーモフィッシャーA16104NuMA 染色
ヤギ血清GibcoPCN5000免疫蛍光
HBSSコーニング21-020-CV組織処理
ヘマトキシリン リチャード・アラン・サイエンティフィック 7231組織学
イルミナIII PerkinElmerCLS136334BLIイン
スリン注射器28G-8mm針BD329424注射
インスリン注射器31G-6mm針 BD326730注射
虹彩鉗子、10.2cm、フルカーブ、鋸歯状WPI504478灌流および外科的処置用
イソフルラン USPCovetrus11695067772麻酔
宝石商 #7 鉗子 チタン 11 cm 0.07 x 0.01 mm チップWPIWP6570顕微手術用
ケタミン HCl 100mg/mLマイラン インディアナ州1049007麻酔
lentiCRISPRv2Addgene98290遺伝子操作
Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin, DyLight 649InvitrogenL32472血管内皮細胞マーカー
MEM 非必須アミノ酸 X 100Corning25-025-CI細胞培養
Metzenbaum はさみWPI503269外科用手順
インジェクションユニットKOPF5000心臓内注射NaCl
ッシャーS25877 NuMA染色
針 30G x 25mmBD305128心臓内注射
針 33G x 15mmハミルトン7747-01頸動脈内注射
針ホルダー、Castroviejo、14cm、ロック付き、1.2mm 鋸歯状顎WPI14137-G顕微手術
用 NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ マウスクソン研究所005557マウス モデル
NU/J マウスクソン研究所002019マウス
モデル 核 有糸分裂装置 タンパク質 ポリクローナルウサギ 抗ヒト Abcam97585NuMA 染色ペ
ニシリン-ストレプトマイシン 10000U/mLGibco15140122細胞培養
PercollGE0891-01密度分離溶液 
PI クラシック サージカル グローブカーディナル ヘルス2D72PT75X手術
pLKO Tet-OnAddgene21915遺伝子操作
ポビドン - ヨウ素 10% 溶液MedlineMDS093943手術
プロパラカインは 0.5%Akorn PharmaAX0501眼科局所麻酔薬
Puralube ワセリン 眼科軟膏Dechra83592麻酔
カミソリブレードダブルエッジブレード EMS72000ービングとバイブロトーム脳スライシング 
リフレックス9mm EZクリップ ブレインツリーEZC- KIT創傷閉鎖
RPMI 1640 コーニング10-040-CM細胞培養
ハサミ、スプリング 10.5cm Str、8mm ブレードWPI501235顕微手術用
半自動振動ブレード ミクロトームライカVT1200ブレインスライス 免疫蛍光
シングルチャンネル麻酔気化器 システムケントサイエンティフィックVetFlo-1210S 麻酔
Smartbox 卓上チャンバー システムと排気ブロワーEZ システムTT4000CO2 安楽死
滅菌 穴あき使い捨てドレープMedlineNON21002手術
滅菌 非強化オーロラ 手術用ガウン セットインスリーブ付きMedlineDYNJP2715手術
T25 フラスココーニング 430639細胞培養
トリスコーニング46-031-CMNuMA染色トリ
トンX-100グマアルドリッチX100-500ML免疫蛍光
トラウトマンタイイング鉗子、10cm、湾曲したGパターン、0.52mmチップタイイングプラットフォームWPIWP505210マイクロサージェキューション手順用
血管クリップ10G圧力5x0.8mmジョーズ、5 / pkgWPI15911For顕微手術
VisiopharmVisiopharmNuMA染色定量ソフトウェア
キシラシン 100mg/mLAkorn Pharma59399-111-50麻酔
キシレンフィッシャーX3P-1GAL組織学
ズ ジャー 結、マイクロフィ ジャ ジャシェシ

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