Method Article

メラノーマ転移の新規メディエーターの同定のための堅牢な発見プラットフォーム

DOI:

10.3791/63186

⸱

March 8th, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, NYU Grossman School of Medicine, 2Interdisciplinary Melanoma Cooperative Group, Perlmutter Cancer Center, 3Department of Radiology, NYU Grossman School of Medicine, 4Preclinical Imaging Core, NYU Grossman School of Medicine, 5Ronald Perelman Department of Dermatology, NYU Grossman School of Medicine

In This Article

Summary

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この記事では、メラノーマ転移の新規候補メディエーターを試験するために使用される技術のワークフローとその作用機序について説明します。

Abstract

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転移は複雑なプロセスであり、 インビトロ アッセイによって不完全にしかモデル化されない障壁を克服するために細胞を必要とする。メラノーマ転移における新規プレーヤーを同定するための、堅牢で再現性のある in vivo モデルおよび標準化された方法を使用して、体系的なワークフローが確立されました。このアプローチにより、特定の実験段階でのデータ推論が可能になり、転移における遺伝子の役割を正確に特徴付けることができます。モデルは、遺伝子組み換えメラノーマ細胞を心臓内、皮内、または皮下注射を介してマウスに導入し、続いて連続 インビボ イメージングでモニタリングすることによって確立される。予め確立されたエンドポイントに到達すると、原発性腫瘍および/または転移を有する器官が採取され、様々な分析のために処理される。腫瘍細胞を選別し、単一細胞RNAシーケンシングを含むいくつかの「オミックス」プラットフォームのいずれかに供することができる。臓器は、転移の全体的な負担を定量化し、その特定の解剖学的位置をマッピングするために、イメージングおよび免疫組織病理学的分析を受ける。生着、モニタリング、組織採取、処理、および分析のための標準化されたプロトコルを含むこの最適化されたパイプラインは、患者由来の短期培養物および様々な固形がんタイプの確立されたヒトおよびマウス細胞株に採用することができる。

Introduction

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転移性黒色腫に関連する高い死亡率と、世界中で黒色腫の発生率の増加1(2025年までに推定7.86%増加)が相まって、新しい治療アプローチが求められています。標的発見の進歩は、非常に複雑なプロセスである転移の再現可能なモデルにかかっています。転移性カスケードのステップ全体を通して、メラノーマ細胞は、免疫系の回避および遠隔組織のコロニー形成を達成するために無数の障壁を克服しなければならない2。メラノーマ細胞の回復力と適応性は、その高い遺伝子変異負荷3および神経堤起源を含む多数の要因から生じ、重要な表現型可塑性3,4,5を付与する。各ステップにおいて、転写プログラムは、転移メラノーマ細胞が、免疫系6、細胞外環境7,8、およびそれらが接触する物理的障壁9の細胞アーキテクチャを含む微小環境とのクロストークからの手がかりに基づいて、ある状態から別の状態に切り替えることを可能にする。例えば、メラノーマ細胞は、....

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Protocol

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注:以下のプロトコルに関連する動物手順は、ニューヨーク大学機関動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認されました。すべての手続きは、国際実験動物ケア評価認定協会(AAALAC)によって承認された施設で行われます。 図1は 、一般的な実験的アプローチを示しています。

1. 患者由来メラノーマ短期培養物(STC)

  1. 1mLの完全RPMI(10%ウシ胎児血清(FBS)、2mM L-グルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム、1x MEM非必須アミノ酸溶液、およびペニシリン(100IU/mL)/ストレプトマイシン(100μg/mL)を添加したRPMI 1640)を含む60mmペトリ皿に組織を置く。
    注:腫瘍細胞の比率を高めるには、必要に応じて、滅菌手術器具を使用して、顕微鏡下で、ペトリ皿内の腫瘍を取り囲む組織を解剖および除去する。
  2. 滅菌したカミソリの刃を使って新鮮な組織を1〜2mmの立方体に細かく切ります。4 mLの完全RPMIおよびピペットを10 mL血清学的ピペットでプレートの内容物を5〜10回上下に加える。
  3. 細胞懸濁液を15mLポリプロピレン円錐管に移し、細胞をスピンダウン(180×g、4°Cで5分間)する。上清を吸引し、細胞ペレットを1mLの新鮮な培地に再懸濁し、懸濁液を25cm2組織培養フラスコ....

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Results

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以下の図は、記載されたワークフローがメラノーマ転移の新規ドライバーの同定にどのように適用されたかを示す。 図2 は、 in vivo メラノーマ転移におけるフコシルトランスフェラーゼFUT8のサイレンシングの効果が研究された公表された研究の結果をまとめたものである26。簡単に言えば、ヒト患者のグリコミックデータ(レクチンアレイによって得られた)およびトランスクリプトームプロファイリングの分析は、原発性黒色腫から転移性黒色腫への進行に関連するα−1,6−フコースのレベルの増加を明らかにし、対応するフコシルトランスフェラーゼ(FUT8)の増加と一致した。

FUT8 shRNAまたは対応する非標的コントロール(shNTC)を担持するレンチウイルスで形質導入された113/6-4Lメラノーマ細胞を、上述のように、超音波誘導心臓内注射によって免疫不全マウス(NSG)に導入した(セクション2.9)。マウスを、 in vivo BLIによる転移性播種につい.......

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Discussion

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このテクニカルレポートの目的は、メラノーマ転移における潜在的なアクターの調査のための標準化されたトップツーボトムのワークフローを提供することです。 in vivo 実験はコストと時間がかかる可能性があるため、効率を最大化し、得られる情報の価値を高める戦略が最優先事項です。

同じ実験内で調査結果をクロスバリデーションするために、全体を通して補完的なアプローチを使用することが不可欠です。例えば、NuMA免疫組織化学染色およびBLIはいずれも包括的ではないため、転移性負荷を定量する相補的な方法である。BLIは、 インビボでの腫瘍進行を追跡する非常に貴重で非侵襲的な方法ですが、これらのデータは本質的に低分解能です。NuMA染色は、固定臓器における転移性負荷の詳細な分析を可能にする。しかし、組織全体の厚さを網羅した切片化は実用的ではありません。そのため、各臓器のサンプルのみを染色することができます。実際、著者らの経験では、BLIの結果は、組織病理学的解析で明らかな腫瘍量に必ずしも正比例するわけではない。これは、部分的には、経頭蓋減衰

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Disclosures

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著者は宣言する利益相反を持っていません。

Acknowledgements

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我々は、NYU Langone Healthの先端研究技術部門(DART)、特に、Perlmutter Cancer Center Support Grant NIH/NCI 5P30CA016087によって部分的に支援されている実験病理学研究所、ゲノム技術センター、サイトメトリーおよび細胞選別研究所、前臨床イメージングコアに感謝する。我々は、IRBが承認したプロトコール(ユニバーサル・コンセント研究#s16-00122および学際的メラノーマ協同組合グループ研究#10362)を通じて得られた患者由来のメラノーマ短期培養物+ (10-230BMおよび12-273BM)へのアクセスを提供してくれたNYU学際的メラノーマ協同組合グループ(PI:Dr. Iman Osman)に感謝する。113/6-4Lおよび131/4-5B1メラノーマ細胞株*を提供してくれたロバート・カーベル博士(トロント大学)と、WM 4265-2、WM 4257s-1、WM 4257-2メラノーマ短期培養**を提供してくれたMeenhard Heryn博士(Wistar Institute)に感謝します。E.H.は、NIH/NCI R01CA243446、P01CA206980、米国癌協会-メラノーマ研究同盟チームサイエンス賞、およびNIHメラノーマSPORE(NCI P50 CA225450;パイ:I.O.)。 図 1 は、 Biorender.com を使用して作成されました。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
#15 スケーペルブレード WPI500242外科手術用
#3 スケープ ハンドルWPI500236外科手術用
1 mL ツベルクリン シリンジ、スリップ チップ BD309626注射剤
10 mL シリンジ、スリップチップ BD301029灌流
10% ホルマリン ナトリウム緩衝EK インダストリー4499-20L灌流/組織固定用
15 mL コニカルコーニング 430052細胞培養
15 mL 円錐形ポリプロピレン遠心分離管ファルコン352196細胞培養
200 プルーフ エタノールDeacon Labs04-355-223組織学
22G – 22mm 針BD305156灌流
4-0 ビクリル縫合糸EthiconJ464G縫合糸
4% カーソンリン酸緩衝液パラホルムアルデヒド EMS15733-10灌流/組織固定用
40µmCorning431750組織処理
5-0 吸収性縫合糸 Ethicon6542000クロー
50 mL コニカル コーニング 430828細胞培養
50mL 円錐形ポリプロピレン遠心分離管Falcon352070細胞培養
7-0 シルク縫合糸 FST18020-70紮糸70
µmCorning431751ティッシュプロセッシング
アンチフェード封入剤  Vector LabsH-1000-10鉗
子を塗布する免疫蛍光近似器、10cm WPI14189顕微手術用
AvanceBruker3 HDNMR Console 
バイオスペック7030 ブルカー7030マイクロMRI
BSABioregA941NuMA染色
カストロビエホ縫合鉗子、ストレートチップ5.5mm結束プラットフォーム、11cm WPIWP5025501顕微手術用
Coplin Staining JarBel-Art F44208-1000組織学
DAPISigma-AldrichD9542-1MG免疫蛍光
dCas9-KRABAddgene110820遺伝子操作
DNase INEBM0303L組織処理
DPBSコーニング21-030-CM組織処理
超シャープ コーティングされていない片刃GEM62-0167ティッシュプロセッシング
細胞外マトリックス基質 コーニング354234成長因子の減少を考慮します(代替案として 
FBSCytivaSH30910.03細胞培養
Fiji Image JFiji Image JSoftwareImmunofluorescence
Goat anti-rabbit HRP conjugated multimer サーモフィッシャーA16104NuMA 染色
ヤギ血清GibcoPCN5000免疫蛍光
HBSSコーニング21-020-CV組織処理
ヘマトキシリン リチャード・アラン・サイエンティフィック 7231組織学
イルミナIII PerkinElmerCLS136334BLIイン
スリン注射器28G-8mm針BD329424注射
インスリン注射器31G-6mm針 BD326730注射
虹彩鉗子、10.2cm、フルカーブ、鋸歯状WPI504478灌流および外科的処置用
イソフルラン USPCovetrus11695067772麻酔
宝石商 #7 鉗子 チタン 11 cm 0.07 x 0.01 mm チップWPIWP6570顕微手術用
ケタミン HCl 100mg/mLマイラン インディアナ州1049007麻酔
lentiCRISPRv2Addgene98290遺伝子操作
Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin, DyLight 649InvitrogenL32472血管内皮細胞マーカー
MEM 非必須アミノ酸 X 100Corning25-025-CI細胞培養
Metzenbaum はさみWPI503269外科用手順
インジェクションユニットKOPF5000心臓内注射NaCl
ッシャーS25877 NuMA染色
針 30G x 25mmBD305128心臓内注射
針 33G x 15mmハミルトン7747-01頸動脈内注射
針ホルダー、Castroviejo、14cm、ロック付き、1.2mm 鋸歯状顎WPI14137-G顕微手術
用 NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ マウスクソン研究所005557マウス モデル
NU/J マウスクソン研究所002019マウス
モデル 核 有糸分裂装置 タンパク質 ポリクローナルウサギ 抗ヒト Abcam97585NuMA 染色ペ
ニシリン-ストレプトマイシン 10000U/mLGibco15140122細胞培養
PercollGE0891-01密度分離溶液 
PI クラシック サージカル グローブカーディナル ヘルス2D72PT75X手術
pLKO Tet-OnAddgene21915遺伝子操作
ポビドン - ヨウ素 10% 溶液MedlineMDS093943手術
プロパラカインは 0.5%Akorn PharmaAX0501眼科局所麻酔薬
Puralube ワセリン 眼科軟膏Dechra83592麻酔
カミソリブレードダブルエッジブレード EMS72000ービングとバイブロトーム脳スライシング 
リフレックス9mm EZクリップ ブレインツリーEZC- KIT創傷閉鎖
RPMI 1640 コーニング10-040-CM細胞培養
ハサミ、スプリング 10.5cm Str、8mm ブレードWPI501235顕微手術用
半自動振動ブレード ミクロトームライカVT1200ブレインスライス 免疫蛍光
シングルチャンネル麻酔気化器 システムケントサイエンティフィックVetFlo-1210S 麻酔
Smartbox 卓上チャンバー システムと排気ブロワーEZ システムTT4000CO2 安楽死
滅菌 穴あき使い捨てドレープMedlineNON21002手術
滅菌 非強化オーロラ 手術用ガウン セットインスリーブ付きMedlineDYNJP2715手術
T25 フラスココーニング 430639細胞培養
トリスコーニング46-031-CMNuMA染色トリ
トンX-100グマアルドリッチX100-500ML免疫蛍光
トラウトマンタイイング鉗子、10cm、湾曲したGパターン、0.52mmチップタイイングプラットフォームWPIWP505210マイクロサージェキューション手順用
血管クリップ10G圧力5x0.8mmジョーズ、5 / pkgWPI15911For顕微手術
VisiopharmVisiopharmNuMA染色定量ソフトウェア
キシラシン 100mg/mLAkorn Pharma59399-111-50麻酔
キシレンフィッシャーX3P-1GAL組織学
ズ ジャー 結、マイクロフィ ジャ ジャシェシ

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sung, H., et al. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN Estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).
  2. Adler, N. R., Haydon, A., McLean, C. A., Kelly, J. W., Mar, V. J.

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