方法論記事

内因性 ショウジョウバエ 一過性受容器電位チャネルの精製

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DOI：

10.3791/63260

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2021年12月28日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Shenzhen Key Laboratory for Neuronal Structural Biology, Biomedical Research Institute, Shenzhen Peking University-The Hong Kong University of Science and Technology Medical Center

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

INADタンパク質複合体の組み立て機構に基づいて、このプロトコールでは、内因性 ショウジョウバエ TRPチャネルを精製するための改変アフィニティー精製プラス競合戦略が開発された。

要約

ショウジョウバエ の光形質導入は、既知の最速のGタンパク質結合シグナル伝達経路の1つである。このカスケードの特異性と効率を確保するために、カルシウム(Ca2+)透過性陽イオンチャネル、一過性受容器電位(TRP)は、足場タンパク質に強固に結合し、不活性化後電位D(INAD)、および眼特異的プロテインキナーゼC(ePKC)およびホスホリパーゼCβ/無受容体電位A(PLCβ/NORPA)との大きなシグナル伝達タンパク質複合体を形成する。しかしながら、 ショウジョウバエ TRPチャネルの生化学的特性は依然として不明である。INADタンパク質複合体の集合機構に基づいて、内因性TRPチャネルを精製するための改変アフィニティー精製+競合戦略が開発された。まず、精製ヒスチジン(His)タグ付きNORPA 863-1095フラグメントをNiビーズに結合させ、 ショウジョウバエ 頭部ホモジネートから内因性INADタンパク質複合体をプルダウンするための餌として使用した。次いで、過剰に精製されたグルタチオンSトランスフェラーゼ(GST)タグ付きTRP 1261〜1275フラグメントをNiビーズに添加し、TRPチャネルと競合させた。最後に、上清中のTRPチャネルを、サイズ排除クロマトグラフィーによって過剰なTRP 1261〜1275ペプチドから分離した。この方法は、 ショウジョウバエ TRPチャネルのゲーティング機構を生化学的および構造的角度の両方から研究することを可能にする。精製 ショウジョウバエ TRPチャネルの電気生理学的特性は、将来的にも測定することができる。

概要

光形質導入は、吸収された光子がニューロンの電気コードに変換されるプロセスです。脊椎動物と無脊椎動物の両方でオプシンと以下のGタンパク質結合シグナル伝達カスケードを独占的に中継する。ショウジョウバエでは、5つのPDZドメインを用いて、足場タンパク質不活性化後電位D(INAD)が、一過性受容器電位(TRP)チャネル、ホスホリパーゼCβ/No受容体電位A(PLCβ/NORPA)、および眼特異的プロテインキナーゼC(ePKC)からなる超分子シグナル伝達複合体を組織する1。この超分子シグナル伝達複合体の形成は、ショウジョウバエの光形質導入機構の正しい細胞内局在化、高効率、および特異性を保証する。この複合体において、光感受性TRPチャネルは、NORPAの下流エフェクターとして作用し、カルシウム流入および光受容体の脱分極を媒介する。以前の研究は、ショウジョウバエTRPチャネルの開放がプロトン、局所脂質環境の破壊、または機械的力によって媒介されることを示した2,3,4。ショウジョウバエTRPチャネルはまた、カルモジュリン5と相互作用し、正および負の両方のフィードバック6,7,8によってカルシウムによって調節される。

これまでのところ、ショウジョウバエTRPおよびTRP様(TRPL)チャネルのゲーティング機構に関する電気生理学的研究は、摘出された膜パッチ、解離した野生型ショウジョウバエ光受容体からの全細胞記録、およびS2、SF9、またはHEK細胞2、9、10、11、12、13におけるヘテロ発現チャネルに基づいていたが、精製チャネルでは基づいていなかった。全長ショウジョウバエTRPチャネルの構造情報も不明のままである。再構成された膜環境における精製タンパク質の電気生理学的特性を研究し、全長ショウジョウバエTRPチャネルの構造情報を得るためには、哺乳動物のTRPチャネル研究で使用される方法論と同様に、精製全長TRPチャネルを得ることは必要な第1ステップである14、15、16、17。

最近、INADタンパク質複合体18、19、20の集合機構に基づいて、ストレプトアビジンビーズ5によってショウジョウバエ頭部ホモジネートからTRPチャネルを精製するためのアフィニティー精製プラス競合戦略が最初に開発された。ストレプトアビジンビーズの低容量で高価なコストを考慮して、Hisタグ付き餌タンパク質と、はるかに高い容量の対応する低コストのNiビーズを使用する改良された精製プロトコルがここで紹介されています。提案手法は,TRPチャネルのゲーティング機構を構造的角度から研究し,精製タンパク質を用いてTRPチャネルの電気生理学的性質を測定するのに役立つ.

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プロトコル

1. GSTタグ付きTRPおよびHISタグ付きNORPAフラグメントの精製

  1. GST タグ付き TRP 1261-1275 フラグメントを精製する
    1. CaCl2ヒートショック形質転換法21を用いてpGEX 4T-1 TRP 1261-1275プラスミド10を大腸菌(E.coli)BL21(DE3)細胞に形質転換する。10mLのルリア・ベルターニ(LB)培地に単一コロニーを接種し、37°Cで一晩生育させる。 次いで、37°Cで1LのLB培地に10 mLの播種培養物を増幅する。
    2. 細胞の光学濃度(OD600)が0.5に達した後、細胞を16°Cまで冷却し、0.1mMイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド(IPTG;最終濃度)を加えて標的タンパク質の過剰発現を誘導し、16°Cで18時間インキュベートする。
    3. 過剰発現後、培養細胞のペレット1 Lを3,993 × gで20分間遠心分離し、40 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)緩衝液に再懸濁した。
    4. 再懸濁セルを4°Cで予冷した高圧ホモジナイザーに負荷する。 ホモジナイザーの圧力をゆっくりと800バールまで上げます。入口タップを開き、再懸濁されたセルを非常に狭いスリットを備えたバルブに円形に通過させます。
      注:セルは、大きな圧力降下およびキャビテーションによって引き起こされる高いせん断力によって均質化される。
    5. 5 mLのグルタチオンビーズを重力フローカラムにロードし、50 mLのPBSバッファーでビーズを合計3回洗浄します。
    6. 高圧ホモジナイザーから細胞溶解液を48,384 x gで遠心分離 する。遠心分離した細胞溶解液(40mL)の上清を重力フローカラム内の平衡化グルタチオンビーズに加え、4°Cで30分間インキュベートした。 グルタチオンビーズを10分ごとに再懸濁する。
    7. 30分間のインキュベーション後、カラム出口タップを開き、ビーズとフロースルー画分を分離した。フロースルー分数を破棄します。残りのグルタチオンビーズを50mLのPBS緩衝液で2回すすいでください。
    8. 15mLの溶出バッファーをグルタチオンビーズに加え、30分間インキュベートする。ビーズを10分ごとに再懸濁します。
    9. 30分間のインキュベーション後、GSTタグ付きTRP 1261-1275フラグメントを50mL円錐管で溶出し、50mMトリス(pH7.5、100mM NaCl、1mM EDTA、1mM DTT)バッファーを使用して平衡化されたサイズ排除カラム(調製グレード)に負荷をかけます。
    10. サイズ排除カラムの溶出流速を 3 mL/minに保ちます。溶出したタンパク質を5mL/チューブの割合で回収します。
    11. 280 nmのUV吸収シグナルを分析してサイズ排除カラム内の標的タンパク質のピークを特定し、SDS-PAGEゲル分析(電気泳動パラメータ:スタッキングゲルで150 V、分割ゲルで200 V)で検証します。クーマシーブルーR250でゲルを染色します。
    12. 精製GSTタグ付きTRP 1261-1275フラグメントを、卓上冷蔵遠心分離機中で4°Cで3,000 x g で遠心分離した15 mL限外ろ過スピンカラムを用いて、サイズ排除カラムから1 mLに濃縮する。
    13. 濃縮タンパク質の濃度は、ビール・ランバートの法則を用いて決定する。分光光度計を用いて、280nmにおけるGSTタグ付きTRP 1261-1275フラグメントのUV吸収を測定する。
    14. タンパク質配列をProtparamプログラム(https://web.expasy.org/protparam/)にインポートして、280nmにおける吸光係数を得る。典型的には、GSTタグ付きTRP 1261-1275の1 L培養物は、1 mLの600 μMのタンパク質(6 x 10-7 mol)を生じる。必要な材料については、 表 1 を参照してください。
  2. 彼のタグ付きNORPA 863-1095フラグメントの精製
    1. CaCl2ヒートショック形質転換法21を用いてpETM.3C NORPA 863-1095プラスミド20を大腸菌BL21(DE3)細胞に形質転換する。10mLのLB培地にシングルコロニーを接種し、37°Cで一晩生育させる。 その後、37°Cで1 LのLB培地で10 mLの播種培養物を増幅する。
    2. 細胞のOD600が0.5に達したら、細胞を16 °Cまで冷却し、0.1mM IPTG(最終濃度)を加えて標的タンパク質の過剰発現を誘導し、16°Cで18時間インキュベートする。
    3. 過剰発現後、培養細胞のペレット1 Lを3,993 x gで20分間遠心分離し、40 mLの結合バッファーに再懸濁した。次に、ステップ1.1.4で説明したように、再懸濁した細胞を4°Cの高圧ホモジナイザーで溶解する。
    4. 5 mLのNiビーズを重力フローカラムにロードし、50 mLの結合バッファーで3回洗浄します。
    5. 高圧ホモジナイザーから細胞溶解液を48,384 x gで遠心分離 する。遠心分離した細胞溶解液の上清を重力フローカラムで平衡化したNiビーズに加え、4°Cで30分間インキュベートする。 Niビーズを10分ごとに再懸濁します。
    6. 30分間のインキュベーション後、カラム出口タップを開き、ビーズとフロースルー画分を分離した。フロースルー画分を捨て、残りのNiビーズを50mLの洗浄バッファーで2回洗浄します。
    7. Niビーズに15mLの溶出バッファーを加え、30分間インキュベートする。Niビーズを10分ごとに再懸濁します。
    8. 30分間のインキュベーション後、溶出したHisタグ付きNORPA 863-1095フラグメントを50mL円錐管に集め、サイズ排除カラム(調製グレード)にロードし、50mM Tris(pH 7.5、100 mM NaCl、1 mM EDTA、1 mM DTT)を用いて平衡化します。
    9. サイズ排除カラムの溶出流速を 3 mL/minに保ちます。溶出したタンパク質を5mL/チューブの割合で回収します。
    10. 280 nmのUV吸収シグナルを分析してサイズ排除カラム内の標的タンパク質のピークを特定し、SDS-PAGEゲル分析(電気泳動パラメータ:スタッキングゲルで150 V、分割ゲルで200 V)で検証します。クマシーブルーR250を使用してゲルを染色します。
    11. 精製されたHisタグ付きNORPA 863-1095フラグメントを、卓上冷蔵遠心分離機で4°Cで3,000 x g で遠心分離した15 mL限外ろ過スピンカラムを使用して、サイズ排除カラムから1 mLに濃縮します。
    12. 濃縮タンパク質の濃度は、ビール・ランバートの法則を用いて決定する。分光光度計を用いて、280nmにおけるHisタグ付きNORPA 863-1095フラグメントのUV吸収を測定する。
    13. タンパク質配列をProtparamプログラム(https://web.expasy.org/protparam/)にインポートして、280nmにおける吸光係数を得る。典型的には、Hisタグ付きNORPA 863-1095フラグメントの1 L培養物は、1 mLの600 μMのタンパク質(6 x 10-7 mol)を生じる。必要な材料については、 表 2 を参照してください。

2. ショウジョウバエ の頭の調製

  1. CO2麻酔法22、23を用いて50mL円錐形遠心分離チューブに成虫のハエを集める。直ちに液体窒素で10分間凍結し、-80°Cの冷凍庫に保管してください。
  2. 十分な数のハエを集めた後、凍った50mLの円錐形のチューブを手で激しく振って、ハエの足、頭、翼、体を分離します。混合物を3つの順次積み重ねられた予め冷却されたステンレス鋼篩(それぞれ20/30/40メッシュサイズ)に移し、ふるいを振盪する。
  3. 次に、ヘッドは40メッシュのふるいを通れないので、ブラシを使ってフライヘッドを40メッシュのふるいから掃き取り、50mLの円錐形チューブに移し、-80°Cで保管します。
  4. ハエとその頭を連続的に集め、実験に必要な必要量(0.5g)に達するまで-80°Cの冷凍庫に保管します。典型的には、0.5gの頭部を集めるために、50mLの円錐形チューブに35mLのハエが必要である。必要な材料については、 表 3 を参照してください。

ショウ ジョウバエ TRPチャネル精製

  1. 合計0.5gのヘッドを計量し、予め冷却された乳鉢乳棒を使用して液体窒素中で完全に均質化する。ホモジナイズしたヘッドを10x v/w溶解バッファー(5mL)に溶解し、シェーカー中で4°Cで20分間インキュベートした後、20,817 x g で4°Cで20分間遠心分離します。
  2. スピンダウン上清(「20817 g S」、 図4)を回収し、さらに100,000 x g で4°Cで60分間遠心分離します。 スピンダウン上清(「100,000 g S」、 図4)を次のプルダウンアッセイに使用します。
  3. 重力フローカラムに1 mLのNiビーズを加え、4°Cで10 mLの二重蒸留H2O(ddH2O)で合計3回ビーズを洗浄します。ビーズを10カラム容量の溶解バッファーで4°Cで3回平衡化します。
  4. 500 μL の精製 His-タグ付き NORPA 863-1095 タンパク質 (3 x 10-7 mol) を Ni カラムに加え、4 °Cで 30 分間インキュベートします。 ビーズを10分ごとに再懸濁します。
  5. カラム出口タップを開き、ビーズとフロースルー画分を分離します。SDS-PAGE分析のフロースルー分率を取ります(NORPA F、 図4)。このセクションでは、餌タンパク質をNiビーズに固定化します。
  6. Niビーズを4°Cで10カラム容量の溶解バッファー(10mL)で洗浄し、洗浄画分をSDS-PAGE分析のために保持する(Wash 1、 図4A)。上記の手順を繰り返し、SDS-PAGE分析用のサンプルを保管してください(洗浄2、 図4A)。このセクションでは、Niビーズ上の過剰な餌タンパク質が除去される。
  7. 100,000 x g遠心分離後のショウジョウバエ頭ホモジネートの上清を4°CのNiカラムに加え、そこでHisタグ付きNORPA 863-1095フラグメントが固定化された。
  8. 上清をNiビーズと共に4°Cで30分間インキュベートする。ビーズを10分ごとに再懸濁します。次いで、カラム出口タップを開き、ビーズとフロースルー画分を分離する。
  9. SDS-PAGE分析のために上清を採取する(ドロ頭溶解F、 図4A)。このセクションでは、頭部ホモジネート中のINADタンパク質複合体(INAD/TRP/ePKC)が、Niビーズ上の固定化NORPA 863-1095フラグメントによって捕捉される。
  10. Ni ビーズを 4 °C で 10 カラム容量の溶解バッファー (10 mL) で洗浄し、SDS-PAGE 分析のために上清を重力沈殿から守ります (Wash 3、 図 4A)。上記の手順を繰り返し、SDS-PAGE分析のために上清を回収する(洗浄4、 図4A)。このセクションでは、Niビーズ上の未結合タンパク質を除去します。
  11. GST タグ付き TRP 1261-1275 タンパク質 (3 x 10-7 mol) の 600 μM を 500 μL の Ni ビーズに加え、4 °C で 20 分間 インキュベートします。 ビーズを10分ごとに再懸濁します。
  12. 溶出画分を重力カラム(TRP E1、 図4B)から回収し、これは内因性 ショウジョウバエ TRPチャネルを含む。以上の工程を繰り返し、溶出画分を回収する(TRP E2、 図4B)。このステップでは、GSTタグ付きTRP 1261-1275フラグメントを競合物質として使用することにより、Niビーズ上の捕捉されたINADタンパク質複合体(INAD/TRP/ePKC)からTRPチャネルが溶出されます。
  13. Niビーズを10カラム容量の結合バッファー(10mL; 表1)4°Cで、SDS-PAGE分析のために洗浄画分を回収した(洗浄5、 図4B)。
  14. 500 μLの溶出バッファー(表1)をNiビーズに加え、4°Cで20分間インキュベートします。 重力フローカラムから溶出画分を回収する(NORPA E1、 図4B)。以上の工程を繰り返し、溶出画分を回収した(NORPA E2、 図4B)。
  15. 溶出バッファーを使用して、INAD/ePKC タンパク質複合体を伴った His-タグ付き NORPA 863-1095 フラグメントを溶出します。次に、Niビーズを500μLの結合バッファーに再懸濁する。
  16. 再懸濁Niビーズを取り出し、SDS-PAGE(クーマシーブルーR250で染色)を実行し、溶出の効率を分析し、溶出バッファーが機能するかどうかを評価します(ビーズ、 図4B)。必要な材料については、 表 4 を参照してください。

ショウ ジョウバエ TRPチャネルのサイズ排除カラム精製

  1. タンパク質精製システムにサイズ排除カラム(分析グレード)を設置します。カラムをカラムバッファー (50 mM Tris-HCl pH 7.5、150 mM NaCl、2 mM DTT、0.75 mM DDM) で平衡化し、0.45 μm フィルターでろ過します。
  2. ステップ3.14からのTRP E1およびE2画分を4mL限外濾過スピンカラムを用いて濃縮し、冷蔵遠心分離機中で4°Cで3,000 x g で遠心分離した。
  3. カラムバッファーでサンプルループをリンスし、サンプルをサンプルループにロードします。サンプルをサイズ排除カラムに注入し、適切な流速(0.5 mL/min)でタンパク質を溶出します。
  4. 280nmでの吸収により標的タンパク質のピークを同定し、SDS-PAGEゲルをランさせて精製された内因性 ショウジョウバエ TRPチャネルを検出した(図5)。必要な材料については、 表 5 を参照してください。

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結果

この記事では、内因性の ショウジョウバエ TRPチャネルを精製するためのタンパク質精製方法が実証されています(図1)。

まず、組換えタンパク質の発現および精製を適用して、餌および競合タンパク質を得る。次いで、GSTタグ付きTRP 1261-1275フラグメントをLB培地中の 大腸菌 BL21(DE3)細胞で発現させ、グルタチオンビーズおよびサイズ排除カラムを用いて精製した(図2)。サンプルを、クーマシーブルーR250染色によるSDS−PAGE分析を用いて検証した。SDS-PAGEサンプル調製プロセスでは、30μLのタンパク質サンプルを10μLの4xローディング色素と混合し、100°Cで10分間煮沸します。次いで、15μLのゆでサンプルを各ウェルに個別にロードする。Hisタグ付きNORPA 863-1095フラグメントは、LB培地中の 大腸菌 BL21(DE3)細胞でも同様に発現し、Niビーズおよびサイズ排除カラ...

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ディスカッション

5つのPDZドメインを含むINADは、ショウジョウバエの光形質導入機構の中核をなす組織者です。以前の研究では、INAD PDZ3がTRPチャネルC末端尾部に絶妙な特異性(KD=0.3μM)で結合することを示していました18。INAD PDZ45タンデムは、非常に高い結合親和性(KD=30nM)を有するNORPA 863−1095断片と相互作用する。これらの知見は、アフィニティー精製と競合戦略を設計するための強固な生化学的基盤を提供し、ノルパCC-PBMフラグメントをプルダウンベイトとして使用することを可能にし、TRP C末端尾部(フラグメント1261-1275)は競合試薬として機能する。したがって、この方法の最初の臨界点は、INAD複合体の集合機構を理解し、十分なNORPAおよびTRP断片を得ることである。同時に、TRPチャネルは膜から抽出して溶液中で安定化する必要がある膜タンパク質であるため、洗剤の使用はこの方法の第2の臨界点である。TRPチャネル24,25...

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開示事項

著者らには開示するものは何もありません。

謝辞

この研究は、中国国家自然科学財団(第31870746号)、深セン基礎研究費補助金(JCYJ20200109140414636)、および中国広東省自然科学財団(第2021A1515010796号)の支援を受けてW. L.私たちは、この原稿の準備中に言語的支援をしてくれたLetPub(www.letpub.com)に感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Bacterial strains
BL21(DE3) Competent CellsNovagen69450タンパク質の過剰発現
Experiment models
D.melanogaster: W1118Bloomington Drosophila Stock CenterBDSC:3605ショウジョウバエヘッド準備
Material
20/30/40メッシュステンレス鋼ふるいJiufeng金属メッシュ会社GB / T6003.1ショウジョウバエヘッド準備
30%アクリルアミド-N、N′-メチレンビスアクリルアミド(29:1)LableadA3291SDS-PAGEゲル調製
硫酸アンモニウムInvitrogenHC2005SDS-PAGEゲル調製
カクテルプロテアーゼ阻害剤Roche05892953001プロテアーゼ阻害剤
Coomassie brilliant blue R-250Sangon BiotechA100472-0025SDS-PAGEゲル染色
DL-Dithiothreitol (DTT)Sangon BiotechA620058-0100サイズ排除カラムバッファー調製
エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩(EDTA)Sangon BiotechA500838-0500サイズ排除カラムバッファー調製
GlycineSangon BiotechA610235-0005SDS-PAGEバッファー
調製 グルタチオンセファロース4 Fast FlowビーズCytiva17513202アフィニティークロマトグラフィー
イミダゾールSangon BiotechA500529-0001溶出バッファーNiカラム
イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)Sangon BiotechA600168-0025過剰発現の誘導
LBブロスパウダーSangon BiotechA507002-0250E.coli.細胞培養
L-グルタチオン還元型(GSH)Sigma-aldrichG4251-100Gグルタチオンビーズ
用溶出緩衝液調製Ni-セファロースエクセルビーズCytiva17371202アフィニティークロマトグラフィー
N-ドデシルβ-D-マルトシド (DDM)Sangon BiotechA610424-001タンパク質精製用洗剤
N,N,N',N'-テトラメチルエチレンジアミン (TEMED)Sigma-aldrichT9281-100MLSDS-PAGE ゲル調製
PBSSangon BiotechE607008-0500E.coli.細胞用ホモジナイズバッファー
PMSFLableadP0754-25Gプロテアーゼ阻害剤
染色済みタンパク質マーカーThermo Scientific26619/26616染色済みタンパク質ラダー
サイズ排除カラム(調製グレード)Cytiva28989336HiLoad 26/60 Superdex 200 PG カラム
サイズ排除カラム(分析グレード)Cytiva29091596Superose 6 Increase 10/300 GL カラム
塩化ナトリウムSangon BiotechA501218-0001タンパク質精製バッファー調製
ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)Sangon BiotechA500228-0001SDS-PAGE ゲル/バッファー調製
Tris baseSigma-aldrichT1503-10KGタンパク質精製バッファー調製
限外ろ過スピンカラムミリポアUFC901096/801096タンパク質濃度
<ストロング>機器
分析天びんデンバーAPX-60メタジ ショウジョウバエ ヘッド
15mLおよび50mLコニカル遠心チューブ用卓上高速冷蔵遠心分離機エッペンドルフ5810Rタンパク質濃度
卓上高速冷蔵遠心分離機 1.5mL 遠心分離チューブEppendorf5417R均質化後のショウジョウバエヘッド溶解液の遠心分離
空の重力フローカラム (内径=1.0cm)バイオ・ラッド738-0015TRP タンパク質精製
空の重力フローカラム (内径=2.5cm)バイオ・ラッド738-0017E.coli.
Gelドキュメンテーションシステムからバイオ・ラッドユニバーサルフードII ゲルドックXRシステムSDS-PAGEイメージング
高速冷蔵遠心分離機ベックマン・コールターアバンティJ-26 XP <em>E.coli.細胞/細胞溶解液の遠心分離
高圧ホモジナイザーUNION-BIOTECHUH-05E.coli.細胞の均質化
液体窒素タンクTaylor-WhartonCX-100Drosophila head preparation
タンパク質精製システムCytivaAKTA 精製器タンパク質精製
冷蔵庫 (-80°C;C)サーモ900GPem>ショウジョウバエ ヘッド調製
分光光度計MAPADAUV-1200OD600 E.coli.細胞の測定
分光光度計サーモサイエンティフィックNanoDrop 2000cタンパク質濃度の測定
超遠心分離機ベックマン・コールターオプティマ XPN-100 超遠心分離機超遠心分離
株 過の調製タンパク質のベイトおよび競合他社のタンパク質精製 <

参考文献

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