本プロトコールは、FVBマウスにおいて後肢壊疽を誘導するための一酸化窒素合成酵素阻害剤の投与と大腿動脈動脈および静脈電気凝固を組み合わせた末梢動脈疾患のユニークで臨床的に関連するモデルを記載する。心臓内DiI灌流は、その後、足蹠血管系の高解像度、3次元イメージングに使用されます。
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この記事について
サマリー
要約
末梢動脈疾患(PAD)は、アテローム性動脈硬化性危険因子への慢性曝露に起因する罹患率の重要な原因である。その最も重篤な形態、慢性四肢を脅かす虚血(CLTI)に罹患している患者は、慢性疼痛、痛みのない限られた歩行距離、および治癒しない創傷を含む日常生活に対する実質的な障害に直面する。PADを研究するために様々な動物において前臨床モデルが開発されてきたが、マウス後肢虚血は依然として最も広く使用されている。これらのモデルにおける虚血性侮辱に対する応答には、使用されるマウス系統、ならびに動脈破壊の部位、数、および手段に応じて有意な変動があり得る。このプロトコルは、CLTIの組織喪失に似たフレンドウイルスB(FVB)マウスにおいて足蹠壊疽を確実に誘導するために、大腿動脈および静脈電気凝固を一酸化窒素合成酵素(NOS)阻害剤の投与と組み合わせるユニークな方法を記載している。レーザードップラー灌流イメージング(LDPI)などの再灌流を評価する従来の手段が依然として推奨されているが、親油性色素1,1'-ジオクタデシル-3,3,3',3'-テトラメチルインドカルボシアニン過塩素酸塩(DiI)の心臓内灌流は、血管系を標識するために使用される。その後のホールマウント共焦点レーザー走査顕微鏡は、後肢虚血モデルにおける再灌流を評価する従来の手段を補完する足蹠血管網の高解像度、3次元(3D)再構成を可能にする。
概要
末梢動脈疾患(PAD)は、アテローム性動脈硬化症による四肢への血流の減少を特徴とし、米国では650万人、世界では2億人が罹患しています1。PAD患者は四肢機能と生活の質の低下を経験し、最も重篤な形態のPADであるCLTI患者は切断および死亡のリスクが高く、5年間の死亡率は50%に近づいています2。臨床現場では、足首上腕指数(ABI)<0.9の患者はPADを有すると考えられ、ABI<0.4の患者はCLTI3を有するとして安静痛または組織喪失のいずれかに関連する。症状は、毎日の活動、虚血に対する筋肉の耐性、解剖学的変異、および側副発達の違いに応じて、同様のABIを有する患者間で変化する4。数字および四肢壊疽は、CLTIをもたらすすべての血管閉塞性疾患の中で最も重篤な症状である。それは軟部組織をミイラ化する乾燥壊死の一形態である。アテローム性動脈硬化性PADに加えて、糖尿病、バージャー病やレイノー現象などの血管炎、または末期腎疾患の設定におけるカルシフィラキシーの患者でも観察することができます5,6。
PAD/CLTIの病因を研究し、潜在的な治療法の有効性をテストするために、い....
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プロトコル
プロトコールに記載されているすべての動物実験は、マイアミ大学施設動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認されました。生後8〜12週の雄および雌の両方のFVBマウスを研究に使用した。
1. L-NAME溶液の調製
- 層流フード内の滅菌条件下で、L-NAME粉末1g( 原料表参照)を20mLの滅菌水に溶解してL-NAME原液を調製し、50mg/mLの溶液を作る。ストック溶液を300~500μLのアリコートに入れ、-20°Cで最大3ヶ月間保存します。
- 有効なL-NAME溶液を作るには、L-NAMEストック溶液のアリコートを解凍し、滅菌条件下でPBS(1:4)で希釈して、最終10mg/mL濃度を得る。
- PBS(pH7.4)を調製するために、8gのNaCl、0.2gのKCl、1.44gのNa2HPO4、および0.23gのNaH2PO4を800mLの蒸留水に溶解する。HClでpHを7.4に調整し、全量1,000mLに水を加え、0.22μmのボトルトップフィルターでろ過します。
注:4 μL/gのL-NAME作動溶液の腹腔内(IP)注射は、L-NAMEの所望の40mg / kg用量と同等である。L-NAME作業溶液は、使用中に氷上に保持する必要があります, そして....
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結果
このプロトコールは、感受性FVBマウスにおいて、一酸化窒素合成酵素阻害剤であるL−NAME投与による大腿動脈および静脈凝固の組み合わせを用いて、マウス足蹠における虚血および組織喪失を誘導する信頼できる手段を詳述する。 図1 は、マウス後肢血管系の解剖学的構造を詳述し、大腿動脈および静脈凝固の部位(黄色X)、側回旋大腿動脈(LCFA)のちょうど近位およびサフェノ膝窩接合部の近位を示す。LCFAを特定する必要があり、この構造のそれぞれの凝固部位は、すべての外科的処置を通して一貫して保たれる。記載されているように、外科的処置の2時間前および術後1〜3日目に、マウスにL-NAMEの40mg / kg IPも投与し、酸化ストレスの組織レベルの上昇を維持した。 図2 は、手術後1週間でこのモデルから予想される組織喪失の変動を示しており、各画像の右下隅にFaber scores9 が記録されています。
DiI灌流をFVBマウスにお.......
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ディスカッション
マウス後肢虚血は、PADおよびCLTIにおける新生血管新生を研究するために最も広く使用されている前臨床モデルであるが、虚血の重症度および回復には、使用される特定のマウス系統および動脈破壊の部位、数、および方法に応じて有意な変動がある。L-NAMEの大腿動脈結紮とIP投与の組み合わせは、FVBマウスにおいて後肢壊疽を確実に誘導することができる11。同じ治療は、C57BL/6マウスにおいて組織喪失を伴わない後肢虚血をもたらすが、BALB/cマウスでは、大腿動脈結紮のみによって足または脚の自己切断を誘発することができる。このように、虚血侮辱に対する中間応答を有するFVBマウスにおけるL-NAME同時投与による大腿動脈凝固の上述の技術は、CLTIにつながる疾患の最も重篤な症状に見られるものと同様の足蹠壊疽のユニークで再現可能なモデルを提供する。このモデルで観察された組織喪失の程度は、少数の虚血性爪から複数の壊疽桁までさまざまであり得るが、足または脚の自己切断に進行することはめったになく、これは四肢の再灌流および機能の縦断的評価を可能にする。壊疽の発症が急速で、通常1週間未満で四肢自動切断が起こるB.......
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開示事項
著者らは、開示する利益相反はありません。
謝辞
この研究は、国立衛生研究所[R01HL149452およびVITAからZ-J LおよびOC Vへの助成金(NHLBl-CSB-HV-2017-01-JS)]によって支援されました。我々はまた、マイアミ大学医学部の麻痺を治すためのマイアミプロジェクトの顕微鏡およびイメージング施設が、画像解析および処理ソフトウェアへのアクセスを提供してくれたことに感謝する。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| バインダークリップ(小) | 事務用品店 | ||
| ブプレノルフィン(徐放性) | |||
| バタフライニードル(25G、ルアーロック付き) | VWR | 10148-584 | |
| 共焦点レーザー走査顕微鏡 | カ | TCS SP5 | |
| DiI(1,1'-ジオクタデシル-3,3,3',3'-テトラメチルインドカルボシアニン過塩素酸塩) | Invitrogen | D282 | |
| 電気焼灼装置 | Gemini Cautery System | 5917 | |
| Ethanol (100%) | VWR | 89370-084 | |
| Fiji (ImageJ) ソフトウェア | NIH | バージョン 2.1.0 を使用しました。無料でダウンロードでき、ライセンスは必要ありません。 | |
| フォーム生検パッド | フィッシャーサイエンティフィック | 22-038-221 | |
| ホルマリン(中性緩衝液、10%) | VWR | 89370-094 | |
| FVBマウス | ジャクソン研究所 | 001800 | |
| グルコース | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| HCl (1 M) | Sigma-Aldrich | 13-1700 | |
| イマリスソフトウェア | オックスフォード・インスツルメンツ | バージョン9.6.0を使用しました。 | |
| イソフルラン | Pivetal | NDC 46066-755-04 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| ケタミン | |||
| L-NAME(Nω-Nitro-L-アルギニンメチルエステル塩酸塩) | Sigma-Aldrich | N5751 | |
| レーザードップラー灌流イメージ | ャーMoorLDI | moorLDI2-HIR | 使用moorLDI V5ソフトウェア。 |
| 顕微鏡スライド (25 x 75 x 1 mm) | VWR | 48311-703 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S8282 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8263 | |
| 針(27G) | BD | 305109 | |
| ポビドンヨードスワブスティック(10%) | Medline | MDS093901ZZ | |
| 手術器具 | Roboz Surgical | Fine鉗子、ニードルドライバー、スプリングハサミ、止血剤をお勧めします。 | |
| 縫合糸(5-0吸収性) | DemeTECH | G275017B0P | |
| シリンジ(10mL) | BD | 305482 | |
| 三方活栓 | Cole-Parmer | 19406-49 | |
| 血管分析プラグイン無料 | ダウンロード、ライセンスは必要ありません。参考文献:Elfarnawany(2015)を参照してください。 | ||
| キシラジン |
参考文献
- Virani, S. S., et al. Heart disease and stroke statistics-2020 update: A report from the American Heart Association. Circulation. 141 (9), 139(2020).
- Duff, S., Mafilios, M. S., Bhounsule, P., Hasegawa, J. T. The burden of ....
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