方法論記事

巨大核生成を探索するためのin vitroおよびIn vivo法

704 回視聴

⸱

DOI:

10.3791/63286

⸱

2021年11月17日

 ,  , 
1Université de Strasbourg, INSERM, EFS Grand Est, BPPS UMR-S 1255, FMTS, F-67065 Strasbourg, France

この記事について

要約

議論された記事:

1. Pongerard, A., Mallo, L., Gachet, C., Lanza, F., Strassel, C. Leukodepletion は、巨核球の分化と血小板形成を研究するための細胞源として、由来のCD34+細胞をろ過します。視覚化実験ジャーナル:JoVE。(171)、E62499(2021)。

2. Kimmerlin, Q., Tavian, M., Gachet, C., Lanza, F., Brouard, N. マウス巨核球前駆細胞の単離.視覚化実験ジャーナル:JoVE。(171)、E62498(2021)。

3. Boscher, J., Gachet, C., Lanza, F., Léon, C. 3Dメチルセルロースベースのハイドロゲルにおける巨核球培養により、細胞の成熟を改善し、硬さと閉じ込めの影響を研究する。視覚化実験ジャーナル:JoVE。(171)、E62511(2021)。

4. Scandola, C., Lanza, F., Gachet, C., Eckly, A. 透過型電子顕微鏡を用いたマウス巨核生成のin situ探索.視覚化実験ジャーナル:JoVE。(171)E62494(2021)。

5. Guinard, I., Gachet, C., Lanza, F., Léon, C., Eckly, A. マウス新鮮骨髄外植片のプロプレートレット形成ダイナミクス.視覚化実験ジャーナル:JoVE。(171)、E62501(2021)。

6. Bornert, A., Pertuy, F., Gachet, C., Lanza, F., Léon, C. マウス頭蓋骨骨髄における巨核球およびプロプレートレットのin vivo 2光子イメージング.視覚化実験ジャーナル:JoVE。(171)、E62515(2021)

編集記事

血小板は、骨髄 (BM) の巨核球 (MK) に由来する止血に不可欠な小さな無核血球です。造血幹細胞からの分化中に、MKは倍数化と細胞質成熟を含む複雑な分化と成熟のプロセスで巨大細胞に発達します。MKが内皮細胞と接触する発生の最終段階で、MKは成熟段階に達し、前血小板と呼ばれる長い細胞質の伸長を血管に伸ばし、それが断片化して血流中に血小板を生じさせます1,2。MK の成熟と経内皮前血小板形成を調節するメカニズムはまだ完全には理解されていません。このコレクションの目標は、in vitro および in vivo での MK の生物学をよりよく理解することに貢献する補完的な方法をまとめることです。

MKのin vitro増殖と分化は、血小板生合成の根底にあるメカニズムを研究するために広く使用されています。Pongerardらによるプロトコルでは、著者らは、ヒトCD34+造血前駆細胞からMKを区別するための標準化された培養プロトコルについて説明しています。彼らは特に、血液センターで入手可能な白血球フィルターがCD34+細胞採取の優れた供給源であることを強調しています。彼らの記事には、CD34+ 細胞の抽出方法、純度の評価方法、播種密度の重要性に関するいくつかの重要なガイドラインが含まれています。著者らはまた、機能的な血小板を効率的に放出するために、5回連続して校正されたピペッティング法を提案しています。この方法の興味深い用途は、薬理学的化合物を評価する可能性、またはCRISPR-Cas9ゲノム編集法3,4を使用してCD34+細胞を遺伝的に操作する可能性です。マウス研究では、Kimmerlinらは、分子および細胞アッセイと互換性のある十分な数でMK前駆細胞を精製するための細胞選別戦略を提示しています。著者らは、多数の造血前駆細胞を含む骨髄の供給源として腸骨稜を使用すること、および細胞表面マーカーの組み合わせを使用して細胞選別の前に不要な細胞の2段階の磁気枯渇を実行することの利点について議論しています。この方法の主な利点は、高度に精製されたMK前駆細胞を得るために必要な動物の数が減ることであり、これは、たとえば、造血前駆細胞の階層とその分化を研究する研究者にとって興味深いかもしれません。これに関連して、Boscherらは、in vivo環境をよりよく模倣するために、2%メチルセルロースで構成される3D培地で前駆細胞を増殖させる方法を説明しています。実際、これらの著者らは、3Dヒドロゲルで増殖したMKが、液体培地で増殖したMKと比較して、より大きな成熟状態と前駆細胞を形成するより大きな能力を達成することを以前に実証しました5。このプロトコルでは、最適な培地剛性を得るためのメチルセルロースの適切な量、各実験条件で同等であるべき細胞の数、および汚染のリスクなど、重要なステップが強調されています。成熟レベルの機能検証のために、著者らは、培養3日目にゲル培養細胞を液体培地に再懸濁する方法と、免疫染色、フローサイトメトリー、または電子顕微鏡による将来の分析のために細胞を固定する方法を説明しています。透過型電子顕微鏡 (TEM) は、MK の高解像度超微細構造を提供するために最適なイメージング アプローチです。ここで、Scandolaらは、自然なBM環境におけるMKの超微細構造を分析し、細胞密度を定量化し、さまざまな成熟段階をスコアリングするためのプロトコルを共有しています。著者らは、TEMを使用して、MKが正弦波壁と相互作用するときに発生する細胞イベント、例えば内皮を貫通する短い侵襲性ポドソーム様突起を解析しています6。この方法の限界は、これらの未熟細胞の特定の超微細構造的特徴がないため、MK関与の初期段階を分析できないことです。前述のように、このイメージングアプローチには、小さなBMサンプルを使用するという利点があり、1匹のマウスで複数の研究を実行できます。一例として、他の骨髄サンプルは、MKからの前血小板の動的伸長を研究するために、Guinardらによってこのコレクションで提示されている骨髄外植片技術に使用できます。この方法の強みは、BMで発生したMKの使用にあるため、培養中の細胞分化のアーティファクトに起因する潜在的な誤解を回避します。実際、これはMK制限MYH9不活性化のマウスで以前に記録されており、in vitroおよびex vivoで異なる結果が見られました7。著者らはまた、このアプローチの単純で再現性があり、迅速な性質を強調しています。彼らのプロトコルの興味深い点は、ナビゲーションソフトウェアを備えた顕微鏡を使用して、前血小板を伸ばすMKの追跡/定量を容易にする機能です。外植片モデルの補完的な方法は、マウス頭蓋骨内のMKの2光子イメージングです。この技術の独自性は、骨髄中の蛍光標識MKの動的挙動をin vivoで研究し、前血小板の伸長を視覚化できることです。このプロトコルには、低侵襲であり、外科的介入が限られているという利点があるため、前血小板形成に影響を与えることが報告されている炎症反応を回避できます。Bornert et al. 指摘しているように、この方法の1つの制限は、骨の密度のために画像化できる深さが狭いことであり、これも若いマウスの使用を課します。この技術は、遺伝子組み換えマウスに適用して、in vivo血小板形成における目的の遺伝子の役割を研究することができます。たとえば、著者らはこの技術を使用して、前小板の伸長における微小管の役割がin vitro条件とin vivo条件で異なることを実証しました8。

異常な MK の発生と血小板産生は血小板減少症または血小板増加症を引き起こし、それぞれ出血または血栓症のリスクを高める可能性があります。血小板生合成を支配する分子メカニズムを解明する継続的な努力は、血小板減少症と血小板増加症の治療のための新しい戦略を開発する能力を高めるでしょう。輸血研究の分野では、これらの取り組みは、選択された状況で輸血の代替手段として培養血小板を生産するための基礎を築きます9。

開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

この作業は、ARMESA(Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique)、欧州連合(European Regional Development Fund)(ERDF)を通じて欧州連合(European Regional Development Fund)を通じて、またH.d.S.にANR-17-CE14-Megaplatprod、C.L.にANR-18-CE14-PlatForMechanicsの支援を受けました。

参考文献

  1. Boscher, J., et al. Blood platelet formation at a glance. Journal of Cell Science. 133 (20), 244731(2020).
  2. Machlus, K. R., Italiano, J. E. The incredible journey: From megakaryocyte development to platelet formation. The Journal of Cell Biology. 201 (6), 785-796 (2013).
  3. Strassel, C., et al. Aryl hydrocarbon receptor-dependent enrichment of a megakaryocytic precursor with a high potential to produce proplatelets. Blood. 127 (18), 2231-2240 (2016).
  4. Montenont, E., et al. CRISPR-edited megakaryocytes for rapid screening of platelet gene functions. Blood Advances. 5 (9), 2362-2374 (2021).
  5. Aguilar, A., et al. Importance of environmental stiffness for megakaryocyte differentiation and proplatelet formation. Blood. 128 (16), 2022-2032 (2016).
  6. Eckly, A., et al. Megakaryocytes use in vivo podosome-like structures working collectively to penetrate the endothelial barrier of bone marrow sinusoids. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 18 (11), 2987-3001 (2020).
  7. Eckly, A., et al. Proplatelet formation deficit and megakaryocyte death contribute to thrombocytopenia in Myh9 knockout mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (10), 2243-2251 (2010).
  8. Bornert, A., et al. Cytoskeletal-based mechanisms differently regulate in vivo and in vitro proplatelet formation. Haematologica. 106 (5), 1368-1380 (2021).
  9. Strassel, C., Gachet, C., Lanza, F. On the way to in vitro platelet production. Transfusion Clinique et Biologique. 25 (3), 220-227 (2018).

再版と許可

さらに記事を探す

Megakaryocyte DifferentiationPlatelet FormationCD34+ CellsMouse Megakaryocyte Progenitors3D Methylcellulose-based HydrogelCell MaturationMurine MegakaryopoiesisTransmission Electron MicroscopyProplatelet Formation DynamicsTwo-photon ImagingBone Marrow Explants
お問い合わせ
図書館に推薦する

プライバシー

利用規約

ポリシー

著作権 © 2026 MyJoVE Corporation. 無断転載を禁じます。