ショウジョウバエ胚における脂質含有細胞小器官の細胞骨格依存性トラフィッキングの可視化

Summary

初期のショウジョウバエの胚では、多くの細胞小器官は運動性である。原則として、それらは特定の蛍光プローブを介して生きたまま画像化することができるが、卵殻は胚への直接適用を妨げる。このプロトコルは、マイクロインジェクションを介してそのようなプローブを導入し、次いで粒子画像速度測定を介してバルクオルガネラ運動を分析する方法を記述している。

Abstract

ショウ ジョウバエ の初期胚は、膨大な数の従来型および胚特異的細胞小器官を含む大きな細胞である。胚発生の最初の3時間の間に、これらの細胞小器官は、アクチンベースの細胞質ストリーミングと微小管に沿ったモーター駆動のトラフィッキングによって駆動される劇的な動きを受ける。多数の小型のオルガネラ特異的蛍光プローブ(FP)の開発により、あらゆる遺伝子型における広範囲の異なる脂質含有構造を可視化することが可能になり、遺伝的にコードされた蛍光色素分子を必要とせずにライブイメージングが可能になります。このプロトコルは、ショウ ジョウバエ の胚に重要な色素と分子プローブを注入し、ライブイメージングによる特定の細胞小器官の輸送を監視する方法を示しています。このアプローチは、脂肪滴(LD)を標識し、粒子画像速度測定(PIV)によってそれらのバルク移動に従うことによって実証される。このプロトコルは、リソソーム、ミトコンドリア、卵黄小胞、およびERを含む他の細胞小器官の研究に適した戦略を提供し、微小管に沿った個々のLDの動きを追跡するための戦略を提供する。市販の染料を使用すると、スペクトルの紫/青および遠赤色領域に分離の利点がもたらされます。マイクロインジェクション による 細胞小器官および/または細胞骨格要素の多重共標識により、 ショウジョウバエ のすべての遺伝資源は、蛍光標識されたタンパク質を導入することなく、輸送研究に利用可能である。量子収率が低く、漂白が容易な遺伝的にコードされた蛍光色素とは異なり、利用可能な色素の多くは、高い光子収率で複数のチャネルを迅速かつ同時に捕捉することを可能にする。

Introduction

重要な色素と分子プローブは、特定の細胞構造と細胞小器官を生きた画像にするための強力なツールです。ショウジョウバエの胚では、多くの異なる細胞小器官が細胞骨格駆動の局在1,2,3,4を示すが、卵殻はそれらの多くに不透過性であるため、これらの小分子の適用は困難である。このプロトコルは、細胞小器官の大規模なトラフィッキングを検出するために、マイクロインジェクションを介して生きている胚に蛍光プローブ(FP)を使用する方法を記述している。この手順は、注射液の調製、卵子の採取および胚の調製、マイクロインジェクション、イメージング、および画像解析をカバーする。

細胞小器官の劇的な空間的再配列は、これらの細胞のサイズが大きいため、多くの動物の卵母細胞、卵、および胚で一般的である。 ショウジョウバエ 胚においては、例えば、脂肪滴(LDs)および卵黄小胞が細胞化直前の胚中心に向かって移動^する5。この運動は微小管に依存し、2つの細胞小器官の枯渇した胚の周囲全体に〜40μmの領域を残す。初期の卵割段階では、多くの細胞小器官は、胚表面⁶におけるアクチン−ミオシンベースの収縮によって駆動される細胞質流によって輸送される。多くの種の胚は同様の再配列を示すが、 ショウジョウバエ の胚は、標準的な実験室の「室温」で外部から発達し、比較的透明で、ほとんどの顕微鏡セットアップに収まるほど小さく、強力な遺伝子ツールを使用して操作することができるため、イメージングによってこれらのプロセスに従うのに特に適している。

いくつかの細胞小器官では、これらの構造を特異的に標識する蛍光標識タンパク質が利用可能である。例えば、LSD-2(dPLIN2としても知られる)は、胚においてLDs7を特異的に標的とするタンパク質である。緑色蛍光タンパク質(GFP)とLSD-2⁸との間の融合をコードする誘導性導入遺伝子、または黄色蛍光タンパク質(YFP)が内因性LSD-2遺伝子^9,10のコード領域に挿入される遺伝子トラップのいずれかを運ぶフライ株が利用可能である。しかしながら、このアプローチには限界があり、これらの融合タンパク質は量子収率が低く、漂白しやすい傾向がある。さらに、複数の異なる構造を同時に標識することは困難な場合があります:多くの細胞小器官では、現在利用可能な蛍光タグ(GFPまたはmCherry)は1種類しかないため、2つのオルガネラを同時にイメージングするには新しい導入遺伝子または挿入が必要な場合があります。また、互換性のあるタグが利用可能であっても、それらを単一の株に導入するには、時間のかかるクロスが必要になることがあります。また、例えば、2つのオルガネラマーカー、Gal4ドライバー、および誘導性RNAi構築物がすべて同じ母親に存在しなければならない場合、多くの強力な遺伝資源の使用が不便になる。

原理的には、これらの制限は、重要な色素(例えば、リソソームをマークするLysoTracker)、分子プローブ(例えば、微小管を標識するSiR-チューブリン)、および蛍光標識された生体分子(例えば、脂肪酸代謝をプローブするC12 BODIPY)を含むFPの使用によって克服することができる¹¹。培養細胞での使用から、それらは通常、細胞生物学をプロービングするための強力なツールとして十分に検証されています。FPは汎用性が高く、優れた写真特性を有し、蛍光タンパク質と互換性があります。複数の染料を同時に混合して塗布することができ、多くの場合、スペクトルの紫/青および遠赤色領域への分離と小さなストークスシフトの利点により、チャネルのブリードスルーを防ぎます。小さなストークスシフトにより、複数のイメージングチャンネルを同時にキャプチャでき、一度に複数の細胞小器官を追跡できます。最後に、それらは、他の ショウジョウバエ 種の胚または蛍光標識されたタンパク質が利用できない他の昆虫の細胞小器官の標識にも同様に適用することができる。

しかし、これらのFPのほとんどはショウ ジョウバエ の胚の精巧な卵殻を横断することはできません。それは5つの層からなる:機械的損傷を防ぐ3つの外側の絨毛膜層(絨毛膜)と、化学的障壁¹²を作り出すビテリン膜を囲むワックス状の層。簡単のため、ワックス状層とビテリン膜との組み合わせを、以下で「ビテリン膜」と呼ぶことにする。卵殻を迂回するために、このプロトコルは、ショウ ジョウバエ の胚にFPを導入するために確立された胚マイクロインジェクションアプローチを適応させる。このプロトコルは、卵割段階の胚におけるLDの細胞質流をモニターする方法を記載している。それは注射針および採卵ケージの調製、採卵の過程、および絨毛膜の機械的除去を含む。胚をマイクロインジェクションして画像化する方法と、粒子画像速度測定(PIV、⁶から適応)を使用してLDのバルクフローを分析する方法について説明します。胚の生存を確保し、イメージングに最適なシステムを作成するためのトラブルシューティングに関するアドバイスを提供します。また、LDと微小管を同時に画像化したり、リソソーム、ミトコンドリア、卵黄小胞体、小胞体(ER)などの他の細胞小器官の研究に適用したりするために、プロトコルをどのように変更できるかについても議論されています。

Protocol

1. 必要な資料を用意する

注:これらの準備は、数日または数週間前に行うのが最善です。

1. 注射針を用意する。
   注:針は、覆われた容器に無期限に保管することができます。針は、ビテリン膜を突き刺すのに十分な強度でありながら、〜700fLを供給するのに十分なほど細かくなければならない。
   1. ニードルプーラーのキャピラリーホルダーにキャピラリーを置きます。毛細血管をウィングナットで固定します。毛細血管の中心を発熱体に合わせ、2本の対称な針が生成されるようにします。
   2. ニードルプーラーの適切な設定は、製造元の指示に従って選択します。
   3. 解剖スコープを使用して品質管理を実行します。
      メモ: 針先はできるだけ細かくする必要があります。ひび割れ、ギザギザ、または大口径の針先は廃棄されます。
   4. 一度に10本の針(5本の毛細血管分)のバッチを準備します。
   5. シリンダーに巻き上げられた変形可能なパテを、蓋付きの容器の底の中央に置きます。損傷を防ぐために、針先を安全に空気中に吊り下げて水平に保持するように、針をパテに慎重に押し込みます。蓋で覆い、使用時まで保管してください。
2. 採卵プレートを用意する。4°Cで保存してください。
   注:採卵プレートは、産卵を促進するためにフルーツジュースを補充した小さな寒天プレートです。それらを準備する方法は、¹³を含む多くのプロトコルで説明されています。
3. ヘプタン接着剤を準備します。
   注:この接着剤は両面テープから抽出され、胚をカバースリップにしっかりと取り付けるために使用されます。これは、注射およびイメージング中に胚が焦点から外れて浮遊するのを防ぎます。接着剤は数日または数週間前に準備することができます。
   1. 両面テープをゴルフボールよりも大きなサイズにボールアップし、しっかりと密閉された蓋付きの〜50mLのガラス容器の底に置きます。十分な接着剤が存在するようにテープをしっかりとパックします。
   2. ヒュームフードで、ガラス容器にヘプタンを入れてすべてのテープを覆います。使用しないときは容器をしっかりと閉めてください。
      警告: ヘプタンは液体および蒸気として可燃性です。それは目、皮膚、および気道の刺激を引き起こす可能性があります。呼吸蒸気は眠気、めまい、肺の損傷を引き起こす可能性があります。ヘプタンを発火源から遠ざけ、可燃物用の換気の良い場所に保管し、互換性のない物質から遠ざけてください。
   3. ヘプタン接着剤を一晩以上座らせてください。最良の結果を得るには、容器をシェーカーまたは他の攪拌機に一晩置いて、接着剤の溶解に役立ててください。
      注:テープ自体は残りますが、接着剤はヘプタンに溶解されます。ステップ5.1.2では、接着剤をカバースリップに適用します。ヘプタンは蒸発し、接着剤を残します。
   4. ヘプタン接着剤調製物をスライドガラス上に一滴置き、ヘプタンが蒸発した後に粘着性の残留物が残っていることを確認することによって試験する。後で糊残りが見えない場合は、ガラス容器にテープを追加して、前の手順を繰り返します。
      注:一度準備すると、接着剤は数ヶ月または数年使用することができます。
4. 市販品を得た調製物を純粋な無水DMSOで希釈することにより、1mg/mL(3.8mM)BODIPY493/503ストック溶液を調製する。光や水から保護するために、それを覆ったままにしておいてください。-20°Cで無期限に、または4°Cで短期間保管してください。

2.採卵ケージを用意する

注:計画された注射の少なくとも1日前(好ましくは2〜3日前)にこれを行います。

1. 酵母ペーストを調製する。
   注:酵母ペーストは、リンゴジュースプレートにないタンパク質やその他の重要な栄養素を補います。それは産卵と産卵を促進します。
   1. 乾燥パン酵母2〜10gを加え、次いで1mLの水道水を小さなビーカーに加える。ヘラを使って混ぜる。
   2. 水道水を1 mL刻みで、希望の歯磨き粉のような粘稠度に達するまで加え続けます。
   3. 混合物を覆い、4°Cで保存する。
2. 卵収集用のフライケージを設置する。
   注:所望の遺伝子型の雄および雌のハエが必要である:生後2週間未満の10〜50匹の雌および同数の雄。フライケージには、自家製オプション^14,13など、さまざまなオプションがあります。リンゴジュースプレートのサイズがフライケージのサイズと一致することが重要です。
   1. リンゴジュースプレートの上に酵母ペーストの小さな塗抹標本を置きます。寒すぎるとハエが皿に卵を産まないので、それを覆って室温にしてください。
   2. ハエを胚採取ケージに移し、酵母リンゴジュースプレートで密封し、プレートを胚採取ケージに固定する。
   3. 新しく移されたハエがケージに1〜2日間順応するのを許し、プレートを毎日新鮮なものと交換する。翌日までにすべての酵母が食べられた場合は、将来のコレクションのために酵母ペーストの量を増やしてください。
      注:これは、十分に給餌された雌がより多くの卵を産むにつれて、卵収量を増加させるための重要なステップです。

3.注射当日、注射液を調製し、針に装填する

1. BODIPY 493/503(DMSOでは3.8mM)の原液を注射液として使用します。
2. 針ローディングチップを使用して、1本の針に1μLの注射液をロードします。
   メモ:気泡を閉じ込めることなく、液体を先端まで届けるように努力してください。誤って破損した場合に備えて、装填された針をすばやく交換する準備をしてください。
   1. ローディングチップをマイクロピペットに取り付け、1 μLの注射液をチップに引き込む。手袋を使用して、針を片手で持ち、先端を離して破損のリスクを最小限に抑えます。
   2. ローディングチップを針に慎重に挿入し、針先の近くに押し込みます。針先の近くに液体を分配します。ピペットを取り外した後、液体が先端に流れるまで針を先端に下げて垂直に保持します。
3. ロードされた針を上記のようにパテの入った別の容器に保管します(ステップ1.1.5を参照)。
   注:針は事前に(最大数時間)注射を準備する必要がありますが、1日以上後に使用しないでください。
4. 染料の漂白を防ぐために、針を周囲光から遠ざけてください。針先を傷つけずに保管容器をアルミホイルで覆います。すべてのライトが不明瞭になっていることを確認します。

4. 注射用胚の採取

注:収集のタイミングは、注射を行う必要がある胚のどの段階で行う必要があるかによって異なります。以下のタイミングスキームにより、注射の準備時の胚は0〜90分齢となり、これは卵割段階¹⁵に相当する。

1. 注射の日に、ステップ2.2.1のように、酵母でリンゴジュースプレートを準備します。Nラウンドの注射が計画されている場合は、N + 2プレートを準備します。これらのプレートを室温に保ちます。
   注:注射用の胚を採取するためのNプレートに加えて、1つのプレートが収集前プレートとして必要であり、収集が完了するとケージ内のハエに餌を供給するためのもう1つのプレートが必要である。
2. ケージのプレートを新鮮な酵母プレート(プレコレクションプレート)と交換し、ケージに1〜2時間放置します。
3. ケージのプレートを新しいプレート(収集プレート)と交換してください。事前収集プレートは、所望よりも古い胚を含むため、廃棄する。その後、ハエが1.5時間卵を産むのを許します。
   注:よく給餌されたハエは通常、卵が受精した直後に卵を産むので、1.5時間の収集時間は、収集の終わりに、プレート上の胚のほとんどが0〜90分齢である、すなわち、切断段階にあることを保証する。前日から新鮮な酵母を与えられていない雌のハエは、産卵前に不確定な時間受精卵を保持する傾向があります。したがって、収集前プレートには、収集開始前に受精した胚があり、したがって60分より古く、時にははるかに古い胚がある。
4. ケージのプレートを新鮮な酵母プレートと交換します。迷子のハエが卵を産まないように収集プレートを覆う。

5. マイクロインジェクション用の胚を準備する

1. 必要な材料を組み立てます。
   1. 両面テープをスライドガラスに貼り付けます。指でテープに触れると粘着性が低下するため、テープに触れないでください。
      注:このスライドは、画像ではなく、絨毛膜を除去するために使用します。
   2. トランスファーピペットまたはマイクロピペット (p200 または p1000) を使用して、長方形のカバースリップ (60 x 25 mm) のほぼ中央にヘプタン接着剤の小さな滴 (200 μL 以下) を置きます。ヘプタンが蒸発するのを許します(これは1分もかかりません)。
      注:このカバースリップは、注射およびイメージングのために胚をマウントするために使用されます。寸法は、共焦点顕微鏡の調整可能な金属ホルダーに収まるように選択されます。
   3. 乾燥チャンバと、乾燥ビーズを含む密閉チャンバ(例えば、タッパーウェアサンドイッチボックス)とを組み立てる。水和していない乾燥ビーズのみを使用してください。
      注:胚が注射液を摂取するようにするには、胚をわずかに乾燥させて内圧を下げる必要があります。これは、脱絨毛された空気暴露胚を含むカバースリップを乾燥チャンバに入れることによって行われる。
2. 機械的に絨毛膜を除去する。
   1. 適切に老化した胚板をハロカーボンオイル27の薄層で覆い、卵殻を透明にする。
      注:胚は数十秒以内に半透明になります¹⁵。この工程が効率的に行われない場合、リンゴジュースプレートが濡れすぎている可能性があり、使用前に乾燥させる必要があります。
   2. 胚の段階を確認するために、トランスイルミネーション(すなわち、プレートを通って接眼レンズに入る光)で解剖スコープの下でプレートを見る。
   3. 卵割段階の胚を選択する。
      注:切断段階の胚は完全に不透明です。その後の胚盤葉段階は、不透明な中心¹⁵の周囲全域の透明な細胞質のバンドによって認識することができる。さまざまな胚期を認識する方法に関する良い紹介は、発生生物学会が管理するウェブサイト(参考文献¹⁶で与えられています)で入手できます。
   4. 細かいピンセットを使用して、その背側付属器によって所望の段階の胚をつかみ、両面テープで覆われた準備されたスライドガラス上に移す。胚をテープの上に置きます。オイルの移動を最小限に抑えます。
   5. できるだけ穏やかに、ピンセットの先端の側面で胚を優しくなでることによって、テープの表面を横切って胚を転がす。鋭いピンセットの先端で胚を直接突かないでください。
      注:加えられた力が小さすぎると、胚は転がりません。高すぎると破裂します。適切な中間力を見つけるには経験が必要であり、したがって、このステップは事前に実践されるべきです。
   6. 絨毛膜がテープに一過性に付着して亀裂が入るまで胚を転がし続けます。
   7. 絨毛膜がひび割れたら、絨毛膜がテープにくっついたままなので、胚(まだビテリン膜の内側)を絨毛膜から分離するために転がり続けます。
   8. 胚からの背側付属器の喪失を観察することによって、絨毛膜が完全に除去されていることを確認する。
   9. 胚をテープよりも接着性の低い絨毛膜の上にロールバックします。胚をピンセットで優しくこすり、ピンセットに付着させて転写します。
   10. ヘプタン接着剤で胚をカバースリップに移し、接着剤と接触させると、通常はピンセットから剥離する。
   11. カバースリップ上の胚の向きを調整します。
       1. 胚の側面を接着剤に埋め込む。
          注:接着剤に埋め込まれた胚の表面は、画像化されるものです。側面を埋め込むのが最も簡単ですが、これは個人的な好みや答えるべき生物学的質問に応じて調整できます。
       2. 胚の長軸をカバースリップの長軸に垂直に向ける。
       3. 胚が好ましい向きにならない場合は、ピンセットをきれいにして、胚を接着剤から剥離する油を取り除きます。次に、胚を所定の位置に静かに転がしてみます。
   12. 上記の方法で注射用の所望の数の胚を準備する。
       注:絨毛膜を除去してから時間が経つにつれて、周囲の空気が胚を乾燥させ始めるため、ステップ5.3の効果は、異なる時間に脱絨毛されたカバースリップ上の胚にとって不均一になる。典型的には、1〜3個の胚が最も管理しやすい。
3. 胚を乾燥させる。
   1. 胚の入ったカバースリップを準備された乾燥室に入れ、密封する。
   2. 胚を5〜12分間乾燥させる。
      メモ:このステップのタイミングは周囲温度と湿度に依存するため、経験的に決定する必要があります。
   3. カバースリップをチャンバーから取り外し、その上にハロカーボンオイル700を一滴置き、胚を完全に覆い、さらなる乾燥を防ぎます。
   4. 解剖スコープで胚を検査し、適切な乾燥を判断します。
   5. 胚がわずかに縮んでいるが収縮していない場合は、マイクロインジェクションに進みます(ステップ6)。
   6. 胚が十分に乾燥していないか、または過度に乾燥されていない場合は、ステップ5.2に戻り、ハロカーボンオイル700を除去することができないため、新しい胚のバッチを準備します。胚が過度に乾燥された場合は、次のバッチの胚の乾燥時間を3分短縮する。乾燥が不十分な場合は、乾燥時間を 3 分長くします。

6. マイクロインジェクション胚

メモ:マイクロインジェクションのセットアップに、倒立顕微鏡、注射針を保持して位置決めするためのマイクロマニピュレータ、および制御されたボリュームを供給するための市販のマイクロインジェクタが含まれていることを確認してください。

1. マイクロインジェクタの電源を入れ、お好みの設定を入力します。
   メモ:このプロトコルでは、リニアモーション出力と高速設定を使用することをお勧めしますが、他の多くのプロトコルでも動作します。オペレーターは、個人的な好みを決定する必要があります。
2. マイクロマニピュレータに針をロードします。胚を含むカバースリップを装填中に針が損傷するのを防ぐために、針を邪魔にならないように安全な位置に動かしてください。
3. カバースリップをステージの上に置き、胚を上にして針に向かって置きます。次に、針を注射用の位置に慎重に戻し、先端をステージのかなり上に戻します。
4. 4x 対物レンズをライト パスに配置します。顕微鏡のフォーカスノブを使用して、胚に焦点を合わせます。
   注:これは注入に使用される焦点面であり、今後は最小限に抑えられます。
5. ステージコントロールを使用して、胚を視野の中心に水平に移動します。
   1. 胚から離れてパンし、針を下げる準備をして、視野の端に保ちます。針が正しい位置に下がっていることを確認するために、同じ焦点面にとどまります。
6. 針先を正しい焦点面に下ろし、胚と一緒に視野に見えるようにします。
   1. マイクロマニピュレータコントロールを使用し、上から(まだ接眼レンズを通していない)見て、針先をゆっくりとオイルに落とし、目標が指す領域を目指します。オイルは非常に粘性があるので、針を傷つけないようにゆっくりと進んでください。
   2. 針が接眼レンズを通して見えるようになったら、針先が焦点が合って視野の中心になるまで、マイクロマニピュレータコントロールを使用し続けます。
   3. ステージを動かすことで、胚を視野の中心に戻します。ステージコントロール、マイクロマニピュレータコントロール、フォーカスノブを使用して、胚と針先が互いに焦点を合わせている間に位置を微調整します。できるだけカバースリップの近くで注射を行うようにしてください。
7. 針の品質管理を行います。
   1. 針が機能していることを確認するために、注射液の一部を胚を囲むハロカーボンオイル700に分配し、オイル中の気泡として見える。
   2. 針から何も流れていない場合は、インジェクターの圧力を徐々に上げます。これでうまくいかない場合は、新しい針を入手してください。
8. 胚を注入する。
   注:許容可能な注入量は〜0.06〜1 pLの範囲です。下限は、胚に入ることを可視化できるものによって設定される。上限は、注射が胚に及ぼす外傷によって設定される。
   1. これは最も侵襲的ではないので、胚の側面縁に沿って注入する。
   2. ステージコントロールを使用して、胚が胚を優しく穿刺して入るまで、胚を針先に向かって動かします。
   3. 同時に、注射液の流れを開始し、胚への液体の移入が成功したことを示す針先の部位に一過性の透明な斑点が現れるのを観察する。
   4. 胚を監視する。胚が針に抵抗し、侵入時に破裂(細胞質が噴き出す)場合は、ステップ5に戻り、乾燥時間を増やします。胚がカバースリップに対して平らで、注射中にフロッピーに見える場合は、ステップ5に戻り、乾燥時間を短縮します。
   5. 胚に色素が入っていない場合は、手順6.7のように色素が針から自由に流れることを確認します。染料が流れない場合は、針を交換してください。色素が流れたら、新しい胚を注入し、針が胚を穿刺する直前に色素の放出を開始します。
      注:同じ胚の反復注射は、以前の創傷/注射部位を破裂させるため、推奨されません。
9. すべての胚が注入されるまで繰り返す。

7. 画像胚

注:このプロトコルは、レーザー走査型共焦点顕微鏡を利用しています。

1. 共焦点顕微鏡の金属ホルダーにカバースリップを入れて、胚がカバースリップを通して下から直接画像化されるようにする。カバースリップの上には、オイルのみがあり、他の障壁はありません。
2. 品質管理ステップとして、まず共焦点顕微鏡上の落射蛍光機能を用いて、40倍の対物レンズを用いた画像。続行する前に、蛍光色素分子が胚に見えることを確認してください。
3. 所望のイメージング面が注射部位と異なる場合、色素が標的領域に拡散するのに十分な時間を与える。
   注: BOPIPY 493/503 の場合、この時間は通常 30 ~ 60 分の範囲です。拡散時間は色素に大きく依存するため、他の色素は注射部位の最適化や待ち時間が必要な場合があります。
4. 異なるスケールでのイメージングには、異なる対物レンズを使用します。40倍の対物レンズを使用してすべての胚を画像化し、63倍の対物レンズを使用して、より小さなスケールのサブセクションを画像化します。
5. 細胞化前の同期段階のライブイメージングでは、まず、画像サイズが512 x 512ピクセル、ライン平均が3、フレームレートが毎秒0.1フレーム(つまり、10秒ごとに1フレーム取得)の条件を使用します。使用する顕微鏡の能力に応じて条件を調整します。
   注:これらの条件により、BOPIPY 493/503から約500以上の画像を取得し、ほとんどの動きをキャプチャできます。

8. 最初にフィジーを使用して画像の時系列を準備し、次にPIV分析のためにPythonを使用してLDフローを分析します

1. 画像取得を最適化します。
   1. 適切な段階で所望の色素の注射を行う。日々の変動が無視できる程度になるまで、この手順を繰り返します。
   2. 倍率、ズーム、解像度、フレームレートなどの画像取得設定を最適化します。
      メモ:高品質の画像(解像度+ライン平均化)と集録速度(フレームレート)の間にはトレードオフがあります。
2. フィジーでデータを準備します。
   1. 分析する高品質の時系列を取得します。
   2. 時系列の1つのフレームを開き、FIJIでマスクを生成します。画像を複製します。イメージの Type を 8 ビットに変換します。
   3. ポリゴンまたはフリーハンド選択ツールを使用して胚の境界を定義します。「外側を消去」を使用して、選択範囲の外側のピクセル値を 0 に設定します。選択範囲内をクリアしてから反転すると、選択範囲内のピクセルの値が最大値 (255) に設定されます。
   4. 選択を解除し、[ ヒストグラム] コマンドを使用して、0 と 255 のピクセル値のみが存在することを確認します。
   5. この新しいイメージマスクを特定の時系列に保存します。
   6. 対象の時系列を開きます。関心のある時間を最もよく捉える10フレーム、例えば皮質収縮の開始時の核サイクル9を選択します。目的の 10 フレームを複製し、サブスタックを形成します。
   7. 画像 へのスタック 機能を使って、PIVで分析する10個の画像を生成します。
   8. 個々のファイルを順序 (SeriesX_1、SeriesX_2、SeriesX_3など) で保存します。
3. PIV分析には、用意されたサンプルPythonスクリプト(補足データ)またはユーザーが生成したカスタムスクリプトを使用して、準備されたマスクと個々のフレームを使用します。
   注: 提供されているスクリプトは OpenPIV¹⁷ の Python アプリケーションに基づいています。距離をピクセル単位で出力し、ピクセル幅とフレームレートを使用して変換して速度や速度を生成します。
4. 追加の胚について前の手順を完了し、出力値をコンパイルして、複製を生成します。

Results

注射後、染料は針先が挿入された部位にのみ局在化する。色素は、その拡散特性に応じて注射部位から離れて拡散する。 図1 は、BODIPY 493/503の注入、注入直後(パネル A)および24分後(パネル B)を示す。24分後、色素は胚の長軸のほぼ中点に到達した。

オルガネラの運動性の分析は、色素注入およびタイムラプスイメージングによって達成することができる。図2では、胚をBODIPY 493/503(図2A)およびLysoTracker Red(図2B)と共注入し、それぞれ488および596nmでのレーザー励起を用いて画像化した。次いで、この胚をタイムラプス画像化した(30秒間に1フレーム、5分間解析)。その後、時系列はPIV分析を通して実行され、その出力は図2A,Bの合理化によって示されています。流線は個々の粒子の軌道を表していないが、細胞質の流れは細胞質のその領域内のすべての粒子を分析することから推測されることに注意してください。PIV解析では、2つの独立した細胞構造(LDと酸性細胞小器官)の標識を通して、細胞質が胚の内部に流れ込んでいる胚の中央領域に両方の標識が収束する同様の流れが見つかりました⁶。

現在利用可能なFPは、他の多くの細胞小器官および細胞構造の標識を可能にする。 図3 は、ERトラッカーグリーン による ERの標識を示しています。ERトラッカーは、核エンベロープの優れた分解能を提供し、主要な細胞周期段階の視覚化を可能にします。ERトラッカーグリーンは、488nm励起を使用して画像化されています。

ミトコンドリアの標識は、テストされたほとんどの染料が最初に入るミトコンドリアに閉じ込められているように見えるため、トリッキーです。一方、色素毒性の徴候は検出されず、細胞化および外胚葉核サイクル15を介して標識されたミトコンドリアに従うことが可能となった。 図4 は、Mitoview 633(励起波長633nm)による注射後数時間後の外胚葉系細胞を示す。

BODIPY、Lysotracker、およびLipidSpotは堅牢で、512 x 512、ライン平均3、1/sから0.1/sのフレームレートで約500以上の画像を取得するために使用できます。

胚芽細胞段階から始まり、LDは極細管に沿って双方向に移動し、反対極性モーターのキネシン-1および細胞質ダイニン⁵によって駆動される。この動きは、BODIPY 493/503とSiR-Tubulin の両方 を注入することによってLDと微小管を共標識することによって視覚化することができます(図5)。LDは頻繁に移動方向を反転させるため(キネシン-1と細胞質ダイニンを切り替えるため)、取得中のフレームレートが高いほど、LD運動性の重要な詳細をよりよく捉えることができます。

自己蛍光性卵黄小胞のライブイメージングは、いかなる形態の色素注入もなしに可能です(図6)。しかし、自家蛍光は薄暗く、励起レーザーは光毒性である。したがって、自己蛍光性卵黄のライブイメージングは、色素注入に対して低いシグナル対ノイズ比を有する。

図1:胚を介したBODIPY 493/503の拡散。 色素を側縁に沿って前端(右上)に向かって注入し、この注入部位から胚内に拡散させ、LDsを標識する。(B)約24分/2核サイクル後、色素は胚の中点を越えて拡散した。スケールバー:100μm。1024 x 1024 フレーム (行平均 4) は 30 秒ごとに取得されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:LDおよび酸性細胞小器官の粒子画像速度測定(PIV) 胚にBODIPY 493/503とLysoTracker Redの両方を注射した。(A) BODIPYチャネル。(B) リソトラッカーレッドチャンネル。(A',B') A と Bに示すものを含む10の連続したフレームから生成された2つのチャンネルのPIV分析によって生成された合理化図。 A 'はLDsの流れに対応し、 B' は酸性細胞小器官の流れに対応する。 A 'と B' はどちらも、胚の内容物が視野から胚の中心に流出している中心の左側の合流点を示すことに注意してください。また、BODIPYは、異なる染料が異なる拡散特性を有するため、LysoTrackerよりも拡散していることに注意してください。スケールバー:100μm。1024 x 1024 フレーム (行平均 4) は 30 秒ごとに取得されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:ERトラッカーは合胞体核分裂にラベルを付けます。 合胞体芽球胚葉胚をERトラッカーでマイクロインジェクションし、その表面の一部を経時的に画像化した。(A)原子力分割中のスピンドルアセンブリ。(B)同じ分割中の核エンベロープの棄却。(C) その後の相間。(D)次の分裂の開始は、セントロソーム外観(矢印でマークされた円形のERフリー領域の発生)によって示される。徐々に染料の漂白に注意してください。励起波長:488nm。 A:初期フレーム、 B:3分経過、 C:10分経過、 D:13分経過。1024 x 1024 フレーム (行平均 4) は 30 秒ごとに取得されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:ミトコンドリアのMitoview 633標識。 胚を合胞胚葉期にMitoview 633で注入し、細胞化後4時間後に画像化した。画像は、生殖帯伸長中の胚の神経外胚葉系細胞を示す。スケールバー:5μm。1024 x 1024 フレーム (行平均 4) は 30 秒ごとに取得されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図5:LDsと微小管の共標識細胞化胚に、BODIPY 493/503(黄色のA,B,C)およびSiRチューブリン(マゼンタA',B',C')の混合物を注入した。A''、B''、C'' はマージされたチャンネルを表示します。パネル A、A'、および A'' は初期フレームを示し、パネル B、B'、および B'' は 5 秒後のフレームを示し、パネル C、C' および C' ' は 10 秒後のフレームを示します。スケールバー:5μm。512 x 512 フレーム (行平均 3) が 2.5 秒ごとに取得されました。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図6:合胞切断段階中の卵黄小胞自己蛍光のイメージング。(B)8分後、(C)16分後。励起波長:405nm。胚を生き続けるために低い励起強度が用いられた。スケールバー:100μm。1024 x 1024 フレーム (行平均 4) は 30 秒ごとに取得されました。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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Discussion

ショウジョウバエの胚は、細胞生物学および生物生物学における基本的な問題を研究するための強力で便利なモデルです。その比較的単純さ、強力な遺伝学、および小型サイズは、細胞プロセスと発生の両方をイメージングするための優れたシステムです。ここでは、標準的なマイクロインジェクションプロトコルが、胚におけるFP使用を可能にするように適合されている。このアプローチにより、遺伝的にコードされた蛍光色素を必要とせずに特定の細胞構造の蛍光イメージングが可能になり、多くの遺伝的背景がイメージングに開かれます。複数の色素と戦略的に選択された蛍光タグ付きタンパク質を組み合わせることで、可視光の全スペクトルにまたがるマルチチャンネルライブイメージングを開くことができます。

プロトコルの重要な手順:
このプロトコルは、BODIPY 493/503 を使用して LD にラベルを付けます。このアプローチは、他の細胞構造をマークするために容易に適合させることができる。その後の画像解析では、最も重要な要因の1つは、信号対雑音比、すなわち背景信号と比較した色素の輝度です。図2、図3、図4、図5に示すように、リソソーム(LysoTracker Red、1mM)、ならびにミトコンドリア(Mitoview 633、200μM)、ER(ERトラッカーグリーン、10μM)、および微小管(SiRチューブリン、DMSOで200nM)の画像化に成功している。また、卵黄小胞は自己蛍光を発し、UV励起時に青色光を放つ(励起波長として405nmを用いた画像(図6))。他の色素については、培養細胞を生きた染色に必要な色素濃度の100~1,000倍にすることを目指してください。これは、細胞培養培地に希釈されるであろう原液の濃度に類似している。このプロトコルは100 fLの注射を要求し、ショウジョウバエの胚は体積¹⁸で約9 nLであるため、これらの色素濃度は平均して細胞培養培地に存在するものの1/100未満の内部胚濃度になります。一時的に、局所濃度は注射部位でより高くなり、これはよく拡散しないFP(すなわち、ミトコンドリア色素およびSiR-チューブリン)に最も関連している。これらのFPについては、推奨される高濃度から開始します。予期せぬ死が観察された場合は、生存と信号強度の間の許容可能な妥協に達するまで、連続して2倍に希釈する。

複数の染料を共注入する場合、両方の染料が同じ溶媒中にあるか、または溶媒と染料の両方が混合物と適合性である必要があります(〜10%を超えるアルコール濃度は推奨されません)。

針の品質は、先端ができるだけ細かくする必要があるため、この手順の成功に不可欠です。さもなければ、注射創傷からの損傷は、その後の胚の発生を損なう可能性がある。市販のニードルプーラーは異なるため、メーカーの提案に従い、所望の形状が達成されるまで複数の引っ張りパラメータを試すことが重要です。品質管理ステップ1.1.3を実行することは、ひびの入った、ギザギザの、または大きな穴の針先を扱うと、成功した注射がより困難または不可能になるため、重要です。

胚は、注射中に追加の量の液体を追加できるように部分的に乾燥させる必要がある。胚が過少乾燥されている場合、針は容易には入らず、針が貫通するか、または溶液が注入されるにつれて細胞質が噴出する。胚が過剰に乾燥すると、胚は収縮して見え、適切に発達しません。正確な乾燥時間は、空気湿度などの局所条件に依存し、日々変化する可能性があります。セッションごとに経験的に決定する必要があります。

微量注射後に生存する胚の能力は、針の品質、適切な乾燥、および注射量を1pL未満(理想的には100fL)に制限することに決定的に依存する。これらのパラメータが最適化されている限り、記載された色素が推奨濃度で注入された場合、有意な毒性は明らかではない。胚が乾燥および注入ステップを生き延びる場合、それらは典型的には、高レベルで細胞化欠陥を引き起こした微小管およびERプローブ(各々のストック濃度の100fL注射)である例外である、生殖帯延長に成功する。試験では、DMSO、水、および2つの混合物を推奨量で注射した場合、生殖帯伸長による胚生存率が約75%以上であった場合、明らかな発達上の欠陥は見つからなかった。1 pLを超える注入量は欠陥を引き起こし、〜4 pLの体積で注入された胚は1時間未満で発達した。したがって、注入量を低く抑える必要があり、色素濃度を高くする必要があります。

一般に、胚の側縁に沿った注射は、それらが最も少ない損傷をもたらすので推奨される。しかしながら、注射部位は、使用されるFPの拡散特性に応じて調整する必要があるかもしれない。BODIPY 493/503およびLysoTrackerは、Lipid Spot 610(LDをマークする別の色素)よりも胚全体に速く拡散するが、SiR-TubulinおよびMitoview 633は胚全体に完全に拡散することがない(注射後7時間という遅い画像化)。したがって、関心のある部位またはその近傍への注射が必要であり得る。前部または後部に注射する場合は、特に細い針が推奨される。

画像取得は、小さな細胞小器官およびすべての細胞骨格成分を光学的に切断および分解するために共焦点顕微鏡法に依存しています。多くの画像の解析を必要とする技術(STORMやPALMなど)は、胚の内容物が動いていて、蛍光色素が光スイッチング用に最適化されていないため、機能しません。落射蛍光顕微鏡は、ほとんどの細胞小器官およびより小さな細胞構造を決定するための横方向および軸方向の分解能を欠いている。これらの理由から、共焦点顕微鏡を使用するか、ライトシート技術を採用することを強くお勧めします。

画像解析の再現性は、一貫性のある画像データに大きく依存します。成功の最大のチャンスのためには、注入技術の最適化と画像取得が必要です。目的の色素、注入部位、胚の年齢、注入量、および取得設定がすべて一貫している技術を確立して実践すると、画像解析のための最も堅牢なデータが生成されます。

メソッドの変更とトラブルシューティング
このプロトコルは、粒子画像速度測定を用いて卵割段階の胚におけるLDsのバルクフローを分析するための方法を実証する。同じアプローチを、他の細胞小器官、他の発達段階、および他の分析方法にも使用することができる。例えば、 図2 は、BODIPY 493/503とLysoTracker Redを共注入することによって可視化された、胚発生の合胞期に流れるLDおよび酸性細胞小器官の分析を示す。受精後7時間までの胚におけるLD運動のさらなる成功裏のイメージングが達成された。これらの胚は注射創傷を保持するが、数時間発達することができる。

このプロトコルを使用して収集されたデータは、粒子画像速度測定に使用されてきましたが、他の多くの解析技術が利用可能です。たとえば、ImageJ、Imaris、または手動トラッキングに見られるようなパーティクルトラッキングプログラムを使用して、移動する構造物の速度と方向を取得できます。このような追跡ソフトウェアのほとんどは、平面細胞培養システムからのデータで動作するように構築されており、 ショウジョウバエ の胚のような3D構造に必ずしもうまく適応するとは限らないことに注意してください。さらに、最高品質の粒子追跡データを生成するには、複数のZ平面を画像化する必要があります。これは、画像スタックの取得時間が〜2秒未満の場合に実現可能であるはずです。このベンチマークは、回転ディスクコンフォカル、格子光シート、および最近のレーザースキャン共焦点システムで到達可能である必要があります。しかし、LD、ミトコンドリア、リソソームなどの豊富な細胞小器官に対する粒子追跡の実現可能性は、視野内の正のシグナルの量が現在の追跡方法には高すぎるため、低い。核や卵黄小胞のようなあまり豊富でない構造の追跡が可能であるかもしれない。フロー分析用のPIVは、両方の細胞小器官が自由に動くため、切断段階のLDと酸性細胞小器官に適しています。核、ER、ミトコンドリアなどの細胞小器官は他の細胞構造に縛られているため、自由には動かず、自由運動を想定したソフトウェア解析には適していません。研究者は、目的のオルガネラに最も適した技術を選択する必要があります。

合胞体および細胞芽球の段階では、LDs(および他のいくつかの細胞小器官)は放射状に配向した微小管⁵に沿って移動する。したがって、単一の微小管が長距離にわたって焦点を合わせている断面図( 図5など)を見つけることができ、2Dでの粒子追跡が可能になります。これらの光学面は胚の奥深くにあるため、全体的な信号強度が低下し、信号対雑音比が低下します。

トラッキング解析では、できるだけ早くイメージングすることで、動きの重要な詳細、ひいては運動性機械の重要な詳細を明らかにすることができます。例えば、脂肪滴運動は、遅い運動 - 短い運動(〜200nm/s;平均移動距離〜100nm)および速い - 長い運動(〜450nm/s;平均移動距離〜1,000nm)の2つの運動状態の混合物である¹⁹;したがって、画像が毎秒、またはそれほど頻繁に撮影されない場合、スローショート状態は検出不能になります。しかし、頻繁なイメージングは、蛍光色素分子の漂白および光毒性も誘発する。したがって、イメージング条件は、対処する正確な質問に応じて調整する必要があります。

方法の制限事項
所望される色素に応じて、この方法は、注射溶液の色素溶解度と毒性との間の適合性によって制限され得る。イソプロパノールやエタノールなどのアルコールは、粘度が低いため針内での取り扱いが難しく、細胞成分を損傷して胚を殺すように見えます。

この方法は、注射用の胚を準備するのに30分以上かかるため、胚発生の初期段階を視覚化するのにも適していません。室温では、胚の初期細胞周期はそれぞれわずか〜10分の長さである。したがって、ステップ5.2.3で新たに受精卵を摘んだとしても、最初の数個の細胞周期は、胚がイメージングの準備が整うまでにすでに完了しています。

UV/ブルー範囲の光による照明は、より長い波長の場合よりもかなり光毒性が高い。このような条件下で(例えば、自己蛍光性卵黄小胞に従うこと; 図6)では、イメージング時間を制限するか(時系列の短縮につながる)、またはより低いレーザー出力を使用する(その結果、信号対雑音比が低下する)必要があります。

細胞化後、特定の場所に注入された色素は、多くの細胞膜を横断しなければならないため、拡散が悪くなる傾向があります。これは、後の発達段階における観察領域を制限する。

既存/代替方法に対する本手法の意義
初期胚におけるLDおよび他の脂質含有細胞小器官の動きは、遺伝的にコードされた蛍光色素、標識フリー技術、およびFPの導入によって視覚化することができる。後者は、ビテリン膜¹² の透過処理またはここで論じるマイクロインジェクションアプローチによって達成することができる。

遺伝的にコードされた蛍光色素は、そのレベルが通常、胚から胚まで再現性の高い汎用性の高いマーカーです。ただし、FPよりも量子収率が低く、漂白が容易です。通常、それらは1つまたは2つのタグ付きバージョン(GFPまたはmCherryなど)でのみ利用可能であり、同時に画像化できる構造の選択が制限されます。一方、FPはしばしば多種多様に存在します。例えば、UV/ブルースペクトルのオートドットから遠赤色スペクトルのリピドックスおよびリピッドスポット610までの発光スペクトルで、さまざまな脂肪滴特異的色素が利用可能です。FPsはまた、関心のある任意の株に直接適用することができ、したがって、例えば、目的の変異株に所望の細胞小器官マーカーを導入するための株構築を必要としない。この利点は、複数の構造に同時にラベルを付ける場合に特に顕著です。これは、複数の世代にまたがる時間のかかるクロスの代わりに、関連する染料を混合し、同時に導入することによって、1日で達成することができる。最後に、細胞プロセスを薬理学的阻害でプローブする場合、薬物と色素を一緒に導入することができます。

ラベルフリー法は、特定の細胞構造を検出するための非常に強力なアプローチです。例えば、LDsは、第三高調波発生顕微鏡²⁰ またはフェムト秒刺激ラマンロス顕微鏡²¹によって初期胚において特異的に検出され得る。FPと同様に、これらのアプローチはあらゆる遺伝的背景に適用することができ、漂白を引き起こさないため、より高速な画像取得を可能にする可能性があります。しかし、それらは通常、特定の細胞小器官に限定されているため、それ自体ではマルチプレックスイメージングをサポートしていません。彼らはまた、特殊な顕微鏡を必要とします。

胚に小分子を導入するための2つの一般的な戦略があります。1つは、ここで採用されているマイクロインジェクションアプローチです。もう一つは、ビテリン膜を透過処理するための化学的(テルペン)処理である。後者のアプローチ¹² は、マイクロインジェクションよりも関与が少ないが、胚から胚へのより可変性もある。さらに、透過処理後、ビテリン膜によって提供される保護が損なわれ、適切な胚が外部培地にアクセスできるため、生存を維持することがより困難になる。マイクロインジェクションは、透過処理よりも胚発生を頓挫させる可能性がはるかに低い。しかし、多くの胚を同時に監視する必要がある場合、例えば薬物スクリーニングの目的で透過処理が推奨される。細胞構造の動きを追跡し、画像解析に適した再現性のある画像系列を得るためには、マイクロインジェクションが最適な方法です。

特定の研究分野におけるこの方法の重要性と潜在的な応用
ショウジョウバエの胚は、多くの細胞生物学的および発生過程を研究するための重要なモデルシステムである^1,5,6。細胞小器官に蛍光タンパク質のタグ付けは、初期胚がどのように発達するか、様々な細胞小器官がどのように輸送するか、およびそのような輸送が発生的および遺伝的にどのように調節されるかの理解に大きく貢献した。しかし、漂白剤に対するそれらの傾向と、複数の細胞小器官が異なる色でラベル付けされた株を生成するという課題は、このアプローチの適用を制限する。マイクロインジェクションによって導入されたFPの使用は、これらの課題の多くを解決し、蛍光標識されたタンパク質と組み合わせることさえできる。この技術は、任意の遺伝的背景における複数の細胞小器官、細胞構造、および細胞骨格成分のイメージングを可能にする。その結果、いくつかの遺伝子型をライブイメージングを介して比較することができ、複数の細胞小器官のトラフィッキングに対する突然変異の影響を決定することが可能になる。

このプロトコルは、 ショウジョウバエのメラノガスターの胚に対するFP注射アプローチを実証するが、原則として、このアプローチは、ショウ ジョウバエの他の種、クリケット²²、およびアブラムシ²³を含む、マイクロインジェクション技術が確立されている昆虫の卵に適用される。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
AUTODO	abcepta	SM1000a	脂質液滴をバイオレット/ブルーに染色
BODIPY 493/503	ThermoFisher	D3922	脂質液滴をグリーンに染色
乾燥剤ビーズ –乾燥剤-無水表示ドライライト	W.A. ハモンド ドライエライト カンパニー	21001
解剖顕微鏡 SteREO DiscoveryV20 透過照明ベース付き	ツァイス	4350030000000000
両面テープ-永久両面テープ	スコッチ (3M)	-	多くのベンダーが販売
ER-トラッカー グリーン (BODIPY FL Glibenclamide)	サーモフィッシャー	E34251	ER/核膜
Femptotip II	Eppendorf	H129354N	すぐに使える
ガラス毛細管 -ガラス Thinw w/fil 1.0mm 4インチ	ワールド精密機器	TW100F-4	引っ張る必要があります
ガラスカバースリップ	-		-対物レンズに適した屈折率を購入してください
ガラススライド -ダブルフロスト顕微鏡スライド 事前にクリーニング	FisherBrand	12-550-343
ハロカーボンオイル 27	Sigma-Aldrich	H8773-100ML
ハロカーボンオイル 700	Sigma-Aldrich	H8898-50ML
ヘプタン より環境に優しい代替品 無水、99%	Sigma-Aldrich	246654-1L	ヘプタンは、米国のOSHA
共焦点顕微鏡	ライカ	Sp5	異なるタイプの共焦点顕微鏡が機能します。
LipidSpot 610	Biotium	#70069	遠赤色の脂質液滴を染色
LysoTracker Red	ThermoFisher	L7528	赤のリソソームを染色
MitoView 633	Biotium	#70055	ミトコンドリアを染色
ニードルローディングピペットチップ - 20uL マイクロローダーチップ	Eppendorf	# 5242956.003
P-1000, Next Generation Micropipette Puller	Sutter Instruments	P-1000	使用される設定は、熱-470、プル-70、速度-60、遅延-90、圧力-200、1x1でのランプ-479です。それらは、加熱の強度と長さ、引っ張る力のタイミング、および力が直線的に加えられるかどうかを指します。これらの条件を利用して、1つの毛細管から先端に微細な開口部を持つ2本の使用可能な針が生成されます。
SiR-Tubulin	Cytosketon Inc	CY-SC014	スピロクローム製;Cytoskeleton Inc.は北米の販売代理店です。微小管を遠赤色のTransferMan
	Eppendorf	で染色する 5178 NK
ViaFluor 405	Biotium	#70064	微小管を紫/青で染色