方法論記事

原発性毛様体ジスキネジアの第一選択診断のための高速ビデオ顕微鏡分析

DOI：

10.3791/63292

⸱

2022年1月19日

 ,  ,  , 
1Allergy Centre, Tampere University Hospital, 2Department of Pediatrics, Turku University Hospital, 3Turku Bioscience Center, University of Turku and Åbo Akademi University

この記事について

サマリー

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高速ビデオ顕微鏡分析は、比較的実行しやすく、高速で、費用対効果が高く、経験豊富な手で、原発性毛様体ジスキネジアの第一選択診断のためのかなり信頼性の高いツールであり、重度の肺疾患の診断および治療に関与するすべてのセンターで利用可能であるべきです。

要約

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原発性毛様体ジスキネジア(PCD)は、常染色体劣性形質に主に遺伝する先天性障害である。この障害は繊毛運動の障害を引き起こし、粘液繊毛クリアランス(MCC)の重度の障害をもたらす。診断されていないか、診断が遅すぎると、気管支拡張症の発症と後の人生での肺への深刻な損傷につながります。PCDを診断するための方法のほとんどは時間がかかり、それらを確立するために広範な経済的資源を必要とする。高速ビデオ顕微鏡分析(HSVMA)は、 生体外で繊毛を鼓動させる生きた呼吸器細胞を視覚化および分析する唯一の診断ツールです。それは速く、費用効果が高く、そして、経験豊富な手で、PCDのための診断ツールとして非常に信頼できる。さらに、透過型電子顕微鏡(TEM)などの古典的な診断手段は、形態学的変化がないため、一部の変異には適用できません。

本稿では、呼吸器上皮細胞の採取プロセス、検体のさらなる調製、およびHSVMAのプロセスについて説明する。また、クリニックがHSVMAを実行するための機器を持っていない場合に、治療のために栄養培地に保管し、調査現場に輸送することによって、ブラシをかけられた細胞を無傷でうまく維持し、殴打する方法についても説明します。また、TEMと診断できないダイニンアーム重鎖11遺伝子(DNAH11)に変異を有する患者からの病理学的拍動パターンを有するビデオも示されている。上気道の感染による決定的でないHSVMAの結果、ならびに赤血球の重ね合わせによるブラッシングの失敗の結果。本稿では、肺疾患患者や希少肺疾患を扱うすべてのユニットに、PCDの日常的な診断の一環としてHSVMAを実行するか、HSVMAを専門とするセンターに検体を送ることを奨励したいと思います。

概要

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原発性毛様体ジスキネジア(PCD)は、まれな遺伝性遺伝性疾患であり、これは、鼓動繊毛の動きに障害を引き起こす。診断されない場合、MCCの重度の障害のために後の人生で重度の肺損傷につながる。過去には、その有病率は1:4,000〜50,000の範囲にあると推定されています。着実に診断を改善し、状態の意識が高まっているため、PCDの有病率に関する最新情報は、PCDがはるかに一般的であり、おそらく1:4,000〜20,000の範囲にある可能性があることを示唆しています1,2。しかし、PCD患者は依然として過小診断または診断が遅すぎます1,3。したがって、先天性座位内および/またはヘテロタキシーまたは周産期鼻漏、新生児呼吸困難、鼻閉塞、および摂食困難のいずれかを有する乳児は、PCDの疑いがあるべきである。後の人生では、慢性中耳炎、再発性肺炎、鼻副鼻腔炎、およびMCC障害による慢性的で典型的な湿った咳は、気管支拡張症および肺機能障害と組み合わせて、成人期まで続くPCDの特徴的な症状である2。

PCDの疑いのある患者は、異なる診断ツールを使用して診断することができる。TEMは、過去に第一線診断のゴールドスタンダードと考えられてきました。しかし、PCD症例の最大30%は異常な超構造1,3,4,5,6を示さず、異なる診断アプローチを必要とする。したがって、ますます多くのセンターと欧州呼吸器学会(ERS)のガイドラインは、第一選択診断として鼻一酸化窒素(nNO)とHSVMAの組み合わせを示唆しています1,7,9,10。HSVMAおよびnNOは、PCD11の患者を特定する際に最も費用対効果の高い選択肢でもあります。しかし、遺伝子検査が診断に含まれていたとしても、現在、100%の確実性8、9、10でPCDを除外できるスタンドアロン検査または検査の組み合わせは存在しないことに留意する必要があります。

利用可能な診断オプションのうち、HSVMAは生きている繊毛被覆呼吸器細胞に焦点を当て、毛様体拍動パターン(CBP)および毛様体拍動頻度(CBF)を評価する唯一の検査です。TEMとは対照的に、HSVMAの結果は通常試験日に迅速に入手可能ですが、TEMの結果は試料が採取されてから数ヶ月後に届くことがあります。HSVMAはすべての年齢層に適用できますが、nNOは高度なコンプライアンスを必要とします。5歳未満でそれを使用する試みは、通常、失敗します 10.経験豊富な手において、HSVMAはPCDをそれぞれ100%および96%で診断するための優れた感度および特異性を有する12。

この論文では、鼻の下甲介から繊毛被覆呼吸器細胞を採取すること、採取した細胞を調査部位に輸送するための細胞栄養培地中での保存、CBFおよびCBPを決定するための顕微鏡ビデオ分析のプロセスなど、HSVMAを実行するための段階的な手順を説明する。さらに、正常なCBPとCBFを異常な繊毛機能と比較した患者からのビデオクリップがいくつか示されています(ビデオ3、ビデオ4、ビデオ5、ビデオ6、ビデオ7、およびビデオ8)。

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プロトコル

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倫理声明:

この研究は地元の倫理委員会(69/2017)によって承認され、ヘルシンキの宣言に準拠して実施されました。

1. 呼吸器上皮細胞の採取・輸送

  1. ブラッシング
    1. ブラッシングの前に、繊毛機能を妨害するバイオフィルムを根絶するために、患者に経口アモキシシリン - クラブラン酸の2週間コースを投与する。抗生物質が処置の2日前に終了していることを確認してください。
    2. ブラシをかけた上皮細胞ストリップ上の粘液のオーバーレイを減らすために、患者に鼻を徹底的に吹き飛ばすように頼む。両親に,幼い子供が鼻を吹くのを手伝ってもらいます。
    3. ブラッシングには、0.6mmサイズの歯間ブラシを使用してください( 材料表参照)。患者の頭を片手で固定したままにし、もう片方の手で両方の鼻孔の下甲介をブラッシングして、十分な上皮細胞ストリップを集める。
      注:通常、歯間ブラシを下溝材の下に深く挿入すると、わずかな抵抗が発生します。鼻ブラッシングは、約2秒間素早く回してピッキングすることによって行われます。より長く激しいブラッシングは、そうでなければ重度の上皮損傷および連続した鼻出血を引き起こす可能性がある。
    4. 気管支鏡検査がPCDの疑い以外の理由で計画されている場合は、気管支鏡検査中にカリーナまたは気管支上皮をブラッシングするか、生検によってサンプルを採取する13。
    5. 回収した細胞ストリップを、細胞栄養価の高いダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)を含む1.5mLの微量遠心チューブに落とします。
      注:上皮細胞ストリップは、通常、ブラシをチューブ壁に投げたり回したりすることで、ブラシをより簡単に落とします。
    6. 微量遠心チューブの蓋を閉め、チューブを光源に押し付けます。チューブを振って、回収された細胞ストリップとコングロマリットを発見します。
  2. 試料の輸送
    1. マイクロ遠心チューブをしっかりと閉じたポリスチレン製の箱に入れ、チューブの蓋が正しく閉じられ、チューブがボックス内に固定されていることを確認します。
    2. コールドパックを追加します。ただし、試料の凍結は避けてください。
      注:調査前に試料を保存するための最適温度は約4〜8°C(39.2〜46.4°F)です。
    3. 保存されたサンプルが次の 24 時間の間に分析されることを確認します。
      注:これらの実験では、ブラッシングとHSVMAの間の平均時間は3時間であった。

2. 高速ビデオ顕微鏡分析(HSVMA)

  1. サンプルのビデオ顕微鏡
    1. サンプルを含む微量遠心チューブを受け取った後、それらを37°C(98.6°F)まで温めて、 最適なインビボ様環境を模倣します。
    2. 顕微鏡に加熱ユニットが装備されている場合は、チューブをフードの下に置き、そこで温めます。あるいは、インキュベーターを使用してサンプルを温めます。
    3. PC上でカメラとビデオユニットのソフトウェアを起動します。
    4. ピペットを使用して、少量のサンプルを採取し、キュベットまたはガラス底の皿に2滴を入れます( 材料表を参照)。キュベットまたは皿を蓋で覆い、顕微鏡の下に置きます。
    5. サンプルの評価には、低温光源と高速(200フレーム/秒以上)で記録できるビデオカメラを備えた差動干渉顕微鏡を使用してください。倍率100倍の油浸レンズを使用し、光学系の表面に液浸油を1滴入れます。
      注:下からレンズが近づいている顕微鏡をお勧めします。
    6. 顕微鏡レンズで皿の底に近づき、赤血球がなく粘液含有量の低い細胞集塊を探します。代表的な関心領域(ROI)を見つけたら、最大の繊毛の動きで繊毛を打つ1つの特定のグループに焦点を当て、ビデオシーケンスを記録します。繊毛を横向きに、そして上から叩いて細胞を記録します。その後、別の代表的な細胞群を検索し、記録を繰り返します。
      注:繊毛被覆細胞は1,000倍の倍率で調査する必要があり、繊毛の鼓動は200/秒以上(このプロトコルでは256/秒)のフレームレートで設定されたデジタル高速ビデオ(DHSV)カメラで記録する必要があります。録画されたビデオクリップから取得したデータはハードドライブに多くのスペースを必要とするため、外付けSSDハードドライブをお勧めします。
  2. ビデオシーケンスの分析
    1. CBF と CBP を決定するには、ビデオクリップをフレームごとに再生します。
    2. CBF を決定するには、フレームレートを 15 フレーム/秒のスローモーションに設定し、10 ビート連続でカウントします。
    3. 10ビートの1サイクルで通過するフレーム数を記録し、その結果をEq(1)に挿入します。記録されたすべての繊毛拍動サイクルの平均を計算して頻度を決定し、その結果を年齢の基準値と比較します( 表1参照)14。
      figure-protocol-1 (1)
      ここで、X は 10 ビートのサイクル中に通過するフレームの数です。
    4. CBPを評価するには、拍動繊毛の動きがフルレンジにあり( 図1参照)、同期しているかどうかを確認します。2人の独立したオペレータにCBPを評価してもらい、選択バイアスを防止します。
    5. HSVMA分析の結果がPCDと互換性があるか、起こりそうにないか、または決定的ではないかのいずれかを報告する。

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結果

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ビデオ1とビデオ2は、CBFとCBPが正常範囲内にある正常なコントロールを示しています(図1参照)。ビデオ3、ビデオ4、ビデオ5、およびビデオ6は、DNAH11遺伝子にホモ接合型変異を有するPCD患者の2つの症例(c.2341G > A;p. Glu781Lys)3を表す。これらの代表的なビデオが選ばれたのは、DNAH11遺伝子の変異の表現型が、形態学的変化がないためTEMで診断できないため注目に値するからである3,4,5。

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ディスカッション

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ここでは、HSVMAを用いたPCDの診断プロセスを、第一選択診断に照らして説明し、議論する。HSVMAは、比較的容易に確立でき、費用対効果が高く、11、および経験豊富な手12における信頼できる方法であるにもかかわらず、落とし穴のない診断尺度ではない。異常なCBFおよびCBPは、気管支呼吸器上皮15の炎症につながる二次感染に起因する可能性があり、同じ理由で、喫煙者は異常な拍動頻度16、17を有し得る。さらに、PCDの診断を確立する前に、嚢胞性線維症を排除すべきである。患者サンプルの分析がPCDと互換性があると判断される前に、新しいブラッシングとCBFとCBPの再分析を必要とする2つの独立して収集されたサンプルで異常な結果を確認する必要があります。これは、特に子供にとっては難しいかもしれません。したがって、一部の研究者は、ブラッシングの繰り返しを避けるために、最初のブラッシングセッシ...

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開示事項

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著者らは開示するものは何もありません。

謝辞

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小児科看護師のヨハンナ・ユヴァンコスキ夫人には、ブラッシングの素晴らしい助けに特別な感謝の意を表したいと思います。また、Heymut Omran教授(University Clinic Münster, UKM)が、彼らのウェブサイトから正常な毛様体運動の概略図を使用する許可を与えてくれたことに特別な感謝の意を表したいと思います。最後に、原稿の校正をしてくれたPGCEのアラン・ブラウンBA(Hons)氏に感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
アモキシシリン-クラブラン酸オリオン Oyj40 mg/kg 2回分/日 成人用 875/125 mg 1 錠 x2/日
カメラソフト浜松HCI 画像
・輸送用コールドパック任意
差動干渉顕微鏡カールツァイス反転、細胞観察顕微鏡
デジタルハイスピードビデオカメラ浜松オルカフラッシュ4.0、デジタルカメラタイプC11440
ダルベッコ´s モディファイドイーグル培地サーモフィッシャー10565018基礎細胞培養培地
エッペンドルフチューブエッペンドルフ301200861.5mLチューブ
ガラス底マイクロウェルディッシュMatTekP35G-1.5-14-C顕微鏡用
キュベット 加熱ユニットカールツァイス/PeCon810-450001カールツァイスインキュベーションエレメント、PeCon TempModule S1温度制御付き
歯間ブラシ 0.6 mmDoft872267ジップバッグ
カールツァイス100x/1.46、αプランアポクロマートDIC対物レンズ
用のポリスチレンボックス
保存輸送蓋付き小型

参考文献

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  1. Werner, C., Onnebrink, J. G., Omran, H. Diagnosis and management of primary ciliary dyskinesia. Cilia. 4 (1), 2(2015).
  2. Mirra, V., Werner, C., Santamaria, F. Primary ciliary dyskinesia: An update on clinical aspects, genetics, diagnosis and future treatment strategies. Frontiers in Pediatrics. 5, 135(2017).
  3. Schultz, R., Elenius, V., Lukkarinen, H., Saarela, T. Two novel mutations in the DNAH11 gene in primary ciliary dyskinesia (CILD7) with considerable variety in the clinical and beating cilia phenotype. BMC Medical Genetics. 21 (1), 237(2020).
  4. Knowles, M. R., et al. Mutations of DNAH11 in patients with primary ciliary dyskinesia with normal ciliary ultrastructure. Thorax. 67 (5), 433-441 (2012).
  5. Boon, M., et al. Primary ciliary dyskinesia: critical evaluation of clinical symptoms and diagnosis in patients with normal and abnormal ultrastructure. Orphanet Journal of Rare Diseases. 9, 11(2014).
  6. Kouis, P., et al. Prevalence of primary ciliary dyskinesia in consecutive referrals of suspected cases and the transmission electron microscopy detection rate: a systematic review and meta-analysis. Pediatric Research. 81 (3), 398-405 (2017).
  7. Marthin, J. K., Nielsen, K. G. Choice of nasal nitric oxide technique as first-line test for primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal. 37 (3), 559-565 (2011).
  8. Jackson, C. L., Behan, L., Collins, S. A. Accuracy of diagnostic testing in primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal. 47 (3), 837-848 (2016).
  9. Lucas, J. S., et al. European Respiratory Society guidelines for the diagnosis of primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal. 49 (1), 1601090(2017).
  10. Shoemark, A., Dell, S., Shapiro, A., Lucas, J. S. ERS and ATS diagnostic guidelines for primary ciliary dyskinesia: similarities and differences in approach to diagnosis. European Respiratory Journal. 54 (3), 1901066(2019).
  11. Kouis, P. Cost-effectiveness analysis of three algorithms for diagnosing primary ciliary dyskinesia: a simulation study. Orphanet Journal of Rare Diseases. 14 (1), 142(2019).
  12. Rubbo, B., et al. Accuracy of high-speed video analysis to diagnose primary ciliary dyskinesia. Chest. 155 (5), 1008-1017 (2019).
  13. Friedman, N. R., Pachigolla, R., Deskin, R. W., Hawkins, H. K. Optimal technique to diagnose primary ciliary dyskinesia. The Laryngoscope. 110 (9), 1548-1551 (2000).
  14. Chilvers, M. A., Rutman, A., O´Callaghan, C. Functional analysis of cilia and ciliated epithelial ultrastructure in healthy children and young adults. Thorax. 58 (4), 333-338 (2003).
  15. Lucas, J. S., Paff, T., Goggin, P., Haarman, E. Diagnostic methods in primary ciliary dyskinesia. Paediatric Respiratory Reviews. 18, 8-17 (2016).
  16. Ballenger, J. J. Experimental effect of cigarette smoke on human respiratory cilia. New England Journal of Medicine. 263, 832-835 (1960).
  17. Stanley, P. J., Wilson, R., Greenstone, M. A., Mac William, L., Cole, P. J. Effect of cigarette smoking on nasal mucociliary clearance and ciliary beat frequency. Thorax. 41 (7), 519-523 (1986).
  18. Kobbernagel, H. E., et al. Efficacy and safety of azithromycin maintenance therapy in primary cilia dyskinesia (BESTCILIA): a multicentre, double-blind, randomised, placebo-controlled phase 3 trial. Lancet Respiratory Medicine. 8 (5), 493-505 (2020).
  19. Takeyama, K., Tamaoki, J., Chiyotani, A., Tagaya, E., Konno, K. Effect of macrolide antibiotics on ciliary motility in rabbit airway epithelium in-vitro. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 45 (8), 756-758 (1993).
  20. Toskala, E., Haataja, J., Shirasaki, H., Rautliainen, M. Culture of cells harvested with nasal brushing: a method for evaluating ciliary function. Rhinology. 43 (2), 121-124 (2005).
  21. Pifferi, M., et al. Simplified cell culture method for the diagnosis of atypical primary ciliary dyskinesia. Thorax. 64 (12), 1077-1081 (2009).
  22. Hirst, R. A., et al. Culture of primary ciliary dyskinesia epithelial cells at air liquid interface can alter ciliary phenotype but remains a robust and informative, diagnostic aid. PLoS One. 9 (2), 89675(2014).
  23. Papon, J. F., et al. Quantitative analysis of ciliary beating in primary ciliary dyskinesia: a pilot study. Orphanet Journal of Rare Diseases. 7 (10), 78(2012).
  24. Smith, C. M., et al. Cilia FA: a research tool for automated, high-throughput measurement of ciliary beat frequency using freely available software. Cilia. 1 (8), 14(2012).
  25. Sampaio, P., et al. Ciliar Move: new software for evaluating ciliary beat frequency helps find novel mutations by a Portuguese multidisciplinary team on primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal Open Research. 7 (1), 00792(2021).
  26. Mullowney, T., et al. Primary ciliary dyskinesia and neonatal respiratory distress. Pediatrics. 134 (6), 1160-1166 (2014).
  27. Leigh, M. W., et al. Standardizing nasal nitric oxide measurement as a test for primary ciliary dyskinesia. Annals of the American Thoracic Society. 10 (6), 574-581 (2013).

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