アプタマーアフィニティービーズを使用したグラム陰性菌のフロースルー分離のためのマイクロ流体音響泳動

Summary

本稿では、マイクロ流体音響泳動技術と、培地からのグラム陰性菌の迅速かつ効率的な単離に使用できるアプタマー修飾マイクロビーズを用いたマイクロ流体音響ホレストリーチップの製造と操作について説明します。

Abstract

この記事では、マイクロ流体音響泳動技術と、培地からのグラム陰性菌の迅速かつ効率的な単離に使用できるアプタマー修飾マイクロビーズを使用したマイクロ流体音響ホレスティックチップの製造と操作について説明します。この方法は、長い正方形のマイクロチャネルのミックスを使用して分離効率を高めます。このシステムでは、サンプルとバッファーはフローコントローラを介して入口ポートに注入されます。ビーズセンタリングとサンプル分離のために、パワーアンプを備えたファンクションジェネレータを介して圧電トランスデューサにAC電力を印加し、マイクロ流路に音響放射力を発生させます。入口と出口の両方に二股のチャネルがあり、同時に分離、精製、濃縮が可能です。この装置は、10倍の用量濃度まで>98%の回収率および97.8%の純度を有する。この研究は、細菌を分離するための既存の方法よりも高い回収率および純度を実証しており、この装置が細菌を効率的に分離できることを示唆している。

Introduction

マイクロ流体プラットフォームは、誘電体移動、磁気泳動、ビーズ抽出、フィルタリング、遠心マイクロ流体学および慣性効果、および弾性表面波^1,2に基づく方法に加えて、医療および環境サンプルから細菌を単離するために開発されている。病原菌の検出はポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いて継続されますが、通常は手間がかかり、複雑で、時間がかかります^3,4。マイクロ流体音響泳動システムは、合理的なスループットと非接触細胞分離^5、6、7を通じてこれに対処する代替手段です。アコーストフォレーシスは、音波を介した物質の動きの現象を利用してビーズを分離または濃縮する技術です。マイクロ流路に音波が入ると、ビーズの大きさ、密度等に応じて選別され、浮遊培地^7,8の生化学的・電気的性質に応じて細胞を分離することができる。そこで、多くの音響フォレーシス研究が盛んに進められ⁹

Protocol

1. マイクロ流体音響泳動チップ設計

メモ:図1は、音響泳動によるマイクロチャネルからのターゲットマイクロビーズの分離と収集の概略 図 を示しています。マイクロ流体音響泳動チップは、CADプログラムを使用して設計されています。

1. 細菌の大きさに対応するアプタマー修飾ビーズとストレプトアビジン被覆ポリスチレン(PS)ビーズの混合物を使用して、デバイスの分離性能を検討するマイクロ流体音響泳動チップを設計します。
2. ターゲット出口でPSビーズを収集し、PSサンプル混合物をサンプル入口に注入した後、出口を通って残りを廃棄するマイクロ流体音響泳動チップを設計します( 図2 および 表1を参照)。
   メモ:この目的のために、音響流体チップは、サンプルとバッファを注入するための2つのインレット、マイクロビーズを中央に整列させるための圧電トランスデューサ(PZT)が取り付けられたメインチャネル、およびサンプルが収集され、廃棄物が排出される2つのアウトレットで構成されるように設計されています(図3A)
3. マイクロビーズ、バッファー、バクテリア、アプタマーがメインチャネルを通過し、PZTによって....

Results

図5 は、PZT電圧(オフ、0.1V、0.5V、5V)の関数としてのビードフローの画像を示しています。本研究で紹介した音響フォレティックチップの場合、PZTの電圧が上昇するにつれて、10μmサイズのビーズの中心濃度が上昇することが確認された。10μmサイズのビーズのほとんどは、PZT電圧の5Vで中央に集中していました。この結果により、シングルチャンネルファンクションジェネレータで3.66MHzの共振周波数を生成し、パワーアンプを用いて一般信号を16dB(約9倍)増幅しました。

表3 は、本試験で用いた音響流体チップに1 μm(セルサイズ)と10 μm(アプタマー付着ビーズ)のマイクロビーズ混合物を注入し、出口流量(400、450、475 μL/min)によるチップ分離性能を評価した結果である。回収率は、注入された10μmサイズのビーズの総数に対する出口で回収したビーズ数の割合で、それぞれ98%±2.2%、98%±2.5%、90%±9.8%であった。純度は、収集されたビーズの総数に対する10.......

Discussion

培養試料中のGN細菌を、その大きさや種類に応じた連続走行法に基づき、高速で捕捉・移送する音波浮上マイクロ流体装置と、アプタマー修飾マイクロビーズを開発しました。長い正方形のマイクロチャネルにより、以前に報告された20、²¹、22、²³、²⁴、^25、26よりもシンプルな設計と2D音響泳動のコスト効率が向上します。この装置は、10倍の用量濃度まで>98%の回収率を有する。この研究は、細菌を分離するための既存のラベルフリー方法20、^21、22、^23、

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 &マイクロ;m ポリスチレンマイクロビーズ	Bang Laboratories	PS04001	Cell size beads
10 & micro;m ストレプトアビジンコーティングマイクロビーズ	Bang Laboratories	CP01007	Aptamer アフィニティビーズ
4インチ シリコンウェーハ/SU-8 モールド	4science	29-03573-01	チップのコンポーネント
Aptamer	Integrated DNA Technologies	GN3-6'RNA	for bacteria conjugation
ホウケイ酸ガラス	Schott	ボロフロート 33	チップ
遠心分離機	ダイハン	CF-10Wasing	粒子
シアノアクリレート接着剤	3M	AD100	にPZTを取り付け
ます。	KCTC	KCTC2571	対象菌
機能発電機	GW Instek	AFG-2225	発生周波数
高速度カメラ	フォトロン	FASTCAM ミニ	分離観察
ホットプレート	1個として	HI-1000	液体硬化用加熱プレート PDMS
KOVAX-SYRINGE 10mL シリンジ	韓国ワクチン	22G-10ML	マイクロ流体音響導入チャネルに、気泡のない脱塩水を満たします。
液状ポリジメチルシロキサン、PDMS	Dow Corning Inc.	Sylgard 184	チップの成分
LB Broth Miller	BD Difco	244620	細胞培養(Luria-Bertani培地)
顕微鏡	オリンパス株式会社	IX-81	分離
PBSバッファー	山羊座科学	PBS-1A	Wasing bacteria
PEEK Tubes	Saint-Gobain Ppl Corp.	AAD04103	粒子の注入または収集
圧電変換器	富士セラミックス	C-213	チャネル内に特定の波を発生させる
パワーアンプ	アンプ研究	75A250A	周波数を増幅する
圧力コントローラー/μflucon	AMED	AMED-μflucon	空気圧/流量コントローラーの制御
Tris-HCl buffer	invitrogen	15567027	Wasing particles
チューブローテーター	SeouLin Bioscience	SLRM-3	アプタマーとビーズの修飾