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方法論記事

カリネクテス・サピドゥスにおける神経ペプチドの多面的質量分析調査

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DOI:

10.3791/63322

⸱

2022年5月31日

 ,  , 
1Department of Chemistry, University of Wisconsin-Madison, 2School of Pharmacy, University of Wisconsin-Madison

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

神経ペプチドの質量分析特性評価は、配列、定量、および局在化情報を提供します。この最適化されたワークフローは、神経ペプチド研究だけでなく、他の内因性ペプチドにも有用です。ここで提供されるプロトコルは、LC-ESI-MS、MALDI-MS スポッティング、および MALDI-MS イメージングを使用した神経ペプチドのサンプル調製、MS 取得、MS 分析、およびデータベース生成について説明しています。

要約

神経ペプチドは、発生、生殖、食物摂取、外部ストレッサーへの応答など、ほぼすべての生理学的および行動的プロセスを調節するシグナル伝達分子です。しかし、神経ペプチドの生化学的メカニズムと完全な補完物、およびそれらの機能的役割については、ほとんど理解されていない。これらの内因性ペプチドの特性評価は、このクラスのシグナル伝達分子内の膨大な多様性によって妨げられている。さらに、神経ペプチドは、神経伝達物質の濃度よりも100倍〜1000倍低い濃度で生理活性であり、シナプス放出後に酵素分解を起こしやすい。質量分析(MS)は、 先験的な 包括的な知識がなくても分析物を同定、定量、局在化できる高感度分析ツールです。これは、神経ペプチドをグローバルにプロファイリングし、新規ペプチドの発見を支援するのに適しています。このクラスのペプチドの豊富さと化学的多様性が低いため、いくつかのサンプル調製方法、MS取得パラメータ、およびデータ分析戦略がプロテオミクス技術から適応され、最適な神経ペプチド特性評価が可能になりました。ここでは、液体クロマトグラフィー(LC)-MSおよびマトリックス支援レーザー脱離/イオン化(MALDI)-MSを使用して、配列特性評価、定量、および局在化のために、複雑な生物学的組織から神経ペプチドを単離するための方法について説明する。青いカニから神経ペプチドデータベースを調製するためのプロトコルには、包括的なゲノム情報を持たない生物であるCallinectes sapidusが含まれている。これらのワークフローは、様々な器具を用いて、異なる種の内因性ペプチドの他のクラスを研究するために適合させることができる。

概要

神経系は複雑であり、生物全体に信号を伝達するためにニューロンのネットワークを必要とする。神経系は感覚情報と生物学的反応を調整します。シグナル伝達に関与する複雑で複雑な相互作用は、神経伝達物質、ステロイド、および神経ペプチドなどの多くの異なるシグナル伝達分子を必要とする。神経ペプチドは、ストレスおよび他の刺激に対する生理学的応答を活性化する上で重要な役割を果たす最も多様で強力なシグナル伝達分子であるため、これらの生理学的プロセスにおけるそれらの特異的役割を決定することは興味深い。神経ペプチドの機能は、移動度、受容体相互作用、および親和性を決定するアミノ酸構造に関連しています1。神経ペプチドの構造と機能を調べるために、神経ペプチドが組織の異なる領域で合成、保存、放出され得るため重要である組織化学、および電気生理学などの技術が採用されてきた2,3,4が、これらの方法は、神経ペプチドの膨大な配列多様性を解明するためのスループットおよび特異性によって制限されている。

質量分析(MS)は、神経ペプチドの構造と存在量のハイスループット分析を可能にします。これは、さまざまなMS技術、最も一般的には液体クロマトグラフィー - エレクトロスプレーイオン化MS(LC-ESI-MS)5およびマトリックス支援レーザー脱離/イオン化MS(MALDI-MS)6を介して行うことができる。高精度の質量測定とMSフラグメンテーションを利用して、MSは、先験的な知識なしに複雑な混合物からの神経ペプチドにアミノ酸配列および翻訳後修飾(PTM)ステータスを割り当てる能力を提供し、その機能を確認するのに役立ちます7,8。定性的な情報に加えて、MSは標識フリー定量(LFQ)または同位体または等圧標識などの標識ベースの方法を通じて神経ペプチドの定量情報を可能にします9。LFQの主な利点には、そのシンプルさ、分析の低コスト、サンプル損失を最小限に抑えることができるサンプル調製ステップの削減が含まれます。しかし、LFQの欠点は、実行ごとの変動性からの定量的誤差に対処するために複数の技術的反復を必要とするため、計測器の時間コストの増加です。これはまた、小さな変動を正確に定量化する能力の低下にもつながる。標識ベースの方法は、複数のサンプルをさまざまな安定同位体を使用して差動的に標識し、1つのサンプルに結合し、質量分析によって同時に分析できるため、系統的な変動が少なくなります。これによりスループットも向上しますが、同位体標識は合成や購入に時間とコストがかかる可能性があります。フルスキャンマススペクトル(MS1)スペクトルの複雑さも多重化が増加するにつれて増加し、断片化して同定することができるユニークな神経ペプチドの数が減少する。逆に、等圧標識はMS1レベルでスペクトルの複雑さを増大させませんが、神経ペプチドなどの低存在量の分析物には課題をもたらします。等圧定量はフラグメントイオン質量スペクトル(MS2)レベルで行われるため、より豊富なマトリックス成分がフラグメンテーションのために選択され得るので、存在量の低い神経ペプチドは定量することができず、選択されたものは定量されるのに十分な存在量を有しない可能性がある。同位体標識により、同定されたすべてのペプチドに対して定量を行うことができます。

同定および定量化に加えて、局在化情報は、MALDI−MSイメージング(MALDI−MSI)10を介してMSによって得ることができる。サンプル表面を横切ってレーザーをラスタリングすることにより、MSスペクトルを各 m/z 値のヒートマップ画像にコンパイルすることができます。条件全体にわたる異なる領域における一過性ニューロペプチドシグナル強度のマッピングは、機能決定のための貴重な情報を提供することができる11。神経ペプチドの局在化は、神経ペプチドの機能が位置12によって異なる可能性があるため、特に重要である。

神経ペプチドは、神経伝達物質などの他のシグナル伝達分子よりもインビボで存在量が少なく、したがって検出には高感度な方法が必要である13。これは、脂質11、14などのより存在量の多いマトリックス成分の除去によって達成することができる。神経ペプチドの分析のための追加の考慮事項は、主にほとんどのneuropeptidomic分析が酵素消化を省略しているため、一般的なプロテオミクスワークフローと比較すると、行う必要があります。これは、ほとんどがプロテオミクスデータとペプチド検出によって知らされたタンパク質一致に基づくアルゴリズムで構築されたため、神経ペプチドデータ分析のためのソフトウェアオプションを制限します。しかし、PEAKS15などの多くのソフトウェアは、de novoシーケンシング機能により、神経ペプチド分析に適しています。抽出法からMSデータ解析までの神経ペプチドの解析には、いくつかの要因を考慮する必要があります。

ここで説明するプロトコルには、LC-ESI-MS、MALDI-MS、およびMALDI-MSIによる神経ペプチドのサンプル調製およびジメチル同位体標識、データ取得、およびデータ分析のための方法が含まれる。いくつかの実験からの代表的な結果を通して、青いカニ、 カリネクテス・サピドゥスからの神経ペプチドを同定、定量、および局在化するこれらの方法の有用性および能力が実証される。神経系をよりよく理解するために、モデル系が一般的に使用される。多くの生物は、完全に配列決定されたゲノムを利用可能にしていないため、ペプチドレベルでの包括的な神経ペプチドの発見を妨げている。この課題を軽減するために、完全なゲノム情報を持たない生物のデータベースを生成するための新規神経ペプチドおよびトランスクリプトームマイニングを同定するためのプロトコルが含まれる。ここで提示されるすべてのプロトコールは、任意の種からの神経ペプチドサンプルに対して最適化することができ、また、任意の内因性ペプチドの分析に適用することができる。

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プロトコル

記載された全ての組織サンプリングは、ウィスコンシン大学マディソン校ガイドラインに準拠して実施した。

1. 神経ペプチドのLC-ESI-MS解析

  1. ニューロペプチドの抽出と脱塩
    1. 組織取得に先立って、16に記載のように酸性化メタノール(acMeOH)(90:9:1 MeOH:水:酢酸)を調製する。
    2. 甲殻類17 から脳組織を採取し、鉗子を用いて、20μLのacMeOHを含む0.6mLチューブにそれぞれ1つの組織を直ちに配置する。
      注:組織解剖プロトコルは、動物や組織タイプによって大きく異なります。読者は、甲殻類から脳組織および複数の他の組織タイプを解剖する方法に関する詳細な説明のためにプロトコル17 を参照される。サンプルは、使用時まで-80°Cで保存することができます(理想的には6ヶ月以内)。記載されているボリュームは、 Callinectes sapidusの単一の脳に使用されます。体積は、組織サイズに合わせてスケーリングする必要があります。組織は溶媒なしで直ちにフラッシュ凍結され得るが、これは内因性タンパク質分解酵素が阻害されず、活性を維持するので推奨されないが、寒いときは遅い速度で。
    3. サンプルに150 μLのacMeOHを加える。超音波ホモジナイザーで合計超音波処理時間を24秒、パルス時間を8秒、一時停止時間を15秒に設定し、振幅を50%に設定し、氷上でサンプルを均質化します。
      メモ:利用可能な異なる均質化システムがあります。サンプルの種類や設備に合わせて設定や条件を調整します。
    4. サンプルを4 °C で 20,000 x g で 20 分間遠心分離します。ピペットで上清をチューブに移し、約35°Cの真空濃縮器(266 x g、1 x 10-4 Torr)で乾燥させます。
      注:乾燥したサンプルは、使用時まで(理想的には6ヶ月以内に)-80°Cで保存することができます。真空濃縮器の加熱は注意して行わなければなりません。熱は乾燥時間を短縮しますが、ペプチドの分解を最小限に抑えるために、すべての液体が蒸発した直後にサンプルを濃縮器から取り除かなければなりません。これを避けるために、加熱は、これおよび後続のすべてのステップから省略されてもよい。
    5. 脱塩のために、抽出された組織サンプルを20μLの0.1%ギ酸(FA)で再構成し、よくボルテックスし、室温の水浴中で1分間超音波処理する。
      注:利用可能な脱塩材料は異なります。樹脂の同一性およびニューロペプチド量に応じて溶液および体積を調整する。全ペプチド量は、市販のペプチド定量アッセイ( 材料表を参照のこと)を用いて推定することができる。
    6. 0.5 μLのサンプルをpHストリップに塗布し、pHが4<ことを確認します。pHが高い場合は、pHが4になるまで10%FAのアリコートを1μL加<ます。
    7. 脱塩のための製造業者のプロトコルに従ってください18.100 μL の 50% アセトニトリル (ACN) を含む湿潤溶液、100 μL の 0.1% FA を含む平衡化溶液、100 μL の 0.1% FA を含む洗浄溶液、および 20 μL の 25% ACN/0.1% FA、20 μL の 50% ACN/0.1% FA、および 20 μL の 75% ACN/0.1% FA を含む溶出溶液を調製します。
    8. C18樹脂で10 μLの脱塩チップを取得します( 材料表を参照)。
    9. 脱塩チップを 15 μL に設定した 20 μL ピペットの上に置きます。脱塩チップが濡れたら、ピペットが廃棄されるまで溶液がなくなったときにピペットを押し下げておくことで、空気が通過するのを防ぎます。
    10. 先端3xを湿潤溶液で、3xを平衡化溶液で吸引する。試料10xを吸引し、続いて洗浄液で3xを洗浄し、各洗浄液を廃棄する。ACNを増加させる順にそれぞれの溶出溶液中で10倍吸引して溶出する。
      注:溶出画分は、分離しておくことも、さらなる分析のために組み合わせることもできます。
    11. 使用済みの脱塩チップを捨て、溶出した神経ペプチドを真空濃縮器(266 x g、1 x 10-4 Torr)で約35°Cで乾燥させた。
      注:これは、使用時まで-80°Cで保存することができます(理想的には6ヶ月以内)。
  2. 組織抽出物中の神経ペプチドの同位体標識
    メモ: このステップはオプションであり、定量が必要な場合にのみ使用されます。
    1. ヒュームフード内の2-プレックス同位体ジメチル標識溶液を調製する:1%CH2OH2(ストック37重量/重量百分率(重量%)の13.5μLの水)、1%CH2OD2(ストック25μLのストック475μLの水中の20重量%溶液)、および0.03Mボランピリジン(996.25μLの水中のストック8M溶液の3.75μL)。
      警告:ホルムアルデヒドは有毒であるため、すべての溶液は換気されたフードに保管してください。手袋、白衣、目の保護具、不浸透性の履物を着用してください。コンタクトレンズは、この材料で作業するときに着用しないでください。
      注:異なる同位体試薬があります。サンプルの種類と必要なラベリングチャンネルの数に基づいて適切なものを選択します。
    2. 粗神経ペプチド抽出物を10μLの水に溶解し、10分間超音波処理する。
    3. 定量的に測定される各異なる実験条件に、異なる同位体ホルムアルデヒド溶液(すなわち、CH2OH2、CH2OD2など)を10μL加える。渦がよく混合するように、各サンプルを2,000 x gで短時間遠心分離する。
    4. 各サンプル管に10 μLの0.03 Mボランピリジンを加える。渦がよく混合するように、各サンプルを2,000 x gで短時間遠心分離する。
    5. サンプルを水浴中で37°Cで15分間インキュベートする。
    6. サンプルを水浴から取り出し、10 μLの100 mM炭酸水素アンモニウムを加えます。渦がよく混合するように、各サンプルを2,000 x gで短時間遠心分離する。
    7. 標識したサンプルを1つの2-plexサンプルに結合し、神経ペプチドを真空濃縮器(266 x g、1 x 10-4 Torr)で約35°Cで乾燥させます。
    8. 標識された神経ペプチドを脱塩するには、手順1.1.5~1.1.10を繰り返して行い、データ取得の準備が整うまで保存します。
  3. データ集録
    1. 乾燥した脱塩ニューロペプチドを12μLの3%ACN/0.1%FAで再構成し、よくボルテックスし、37°Cの水浴中で超音波処理を1分間行い、2,000 x gで短時間遠心分離する。各サンプルをオートサンプラーバイアルに移します。
      注: ニューロペプチド量に応じてサンプル量を μL あたり約 1 μg のペプチド濃度に調整します。総ペプチド量は、市販のペプチド定量アッセイ ( 材料表を参照) を使用して見積もることができます。
    2. オートサンプラーを使用して、1 μL のサンプルを高分解能ナノ LC-MS/MS 装置に注入します ( 材料表を参照)。
    3. 水中の 0.1% FA を移動相 A として、ACN で 0.1% FA を移動相 B としてサンプルを実行するには、長さ約 15 cm の逆相 (RP) C18 列 ( 材料表を参照) を使用します。B の勾配が 3% ~ 95% のサンプルを 300 nL/分の速度で 11 分間以上実行します。
    4. ここで使用するMS装置は、スプレー電圧に2.00kV、キャピラリー温度に275°Cの一般的なMS条件を使用してください。
    5. 分解能60,000、自動ゲイン制御(AGC)ターゲット1 x 106、最大イオン注入時間(IT)150msで、200~2,000m/zの範囲のMSスペクトルを取得します。
    6. 正規化された衝突エネルギー 30、分離窓 2.0 m/z、分解能 15,000、AGC ターゲット 2 x 105、最大 IT 250 ms を使用して、高エネルギー衝突解離 (HCD) フラグメンテーションのために、最も強度の高い15 個のイオン (最小強度 3.2 x 104) を選択します。
    7. 動的除外ウィンドウを 30 秒に設定します。電荷が1または≥8のイオンおよび電荷状態が認識されないイオンを除外する。
  4. 神経ペプチドの同定と定量
    注:データベース検索とペプチド定量のための多くのソフトウェア(オープンソースと商用の両方)が利用可能です。ここでは、PEAKS Studio(プロテオミクスソフトウェア)15 を使用します。
    1. 1.4.2 ~ 1.4.6 で概説されている手順を使用してデータベース検索を実行します。
    2. 新しいプロジェクトを作成し、LC-MS データを追加し、酵素の場合は None を選択し、機器には Orbitrap 、フラグメントの場合は HCD 、集録にはデータ依存取得 (DDA) を選択します。
      メモ: データ集録パラメータに基づいて適切なパラメータを選択します。
    3. [ 識別 ] を選択し、[前駆体の 修正 [DDA ] と [質量のみ] を選択します。
    4. データベース検索を選択し、前駆体質量にモノアイソトピック質量、フラグメントイオン質量に0.02Da、酵素タイプになし、消化モードに非特異的、最大欠落切断に100、ペプチドあたりの最大許容可変PTMが3の次の可変PTMを使用して、エラー許容を20.0ppmに設定します:アミド化、酸化(M)、Eからのパイログル、 Qからのパイログル。
    5. ニューロペプチドデータベースを選択し、おとり融合による偽発見率(FDR)を推定する。
      メモ: 質量公差誤差は、収集されたデータと一致するように調整する必要があります。サンプル・タイプに適したデータベースを使用します。酵素が選択されていない場合、最大欠落切断パラメータは検索には影響しません。ただし、ソフトウェアにオプションとして [未指定] ダイジェスト モードがない場合は、多数の切断の欠落が必要です。
    6. ラベルフリーの定量が必要な場合は、[ 定量] を選択し、[ ラベルフリー ] を選択して、誤差許容値を 20.0 ppm、 保持時間許容値を 1.0 分に設定します。
    7. 同位体標識のための工程1.2が行われた場合は前駆体イオン定量を行う。
      1. 「定量」を選択し、「前駆体イオン定量」を選択し、保持時間範囲 1.0 分を使用し、FDR しきい値 1% を使用します。
      2. プリセットまたはカスタム定量方法を [方法の選択] ドロップダウン メニューから選択します。
      3. 新しいカスタムメソッドを作成するには、「 ウィンドウ>構成」>「Qメソッド>新規ラベル付け」をクリックします。新しい方法に名前を付け、[方法の種類] で [ 前駆体イオン定量] を選択します。「 行の追加」 を選択し、「PTM オプション」リストから「変更」を選択します。
      4. LC-MSデータを追加し、実験の対照条件から神経ペプチドに対する修飾となる 参照条件 を選択する。
    8. 手順 1.4.9 ~ 1.4.11 の説明に従って検索結果を評価します。
    9. -10lgP ≥ 20 のペプチドとタンパク質の [概要] タブで結果をフィルター処理し、 1 つの 一意のペプチド≥選択し、[ 有意なペプチド] とラベル付けされたボックスを選択します。
    10. データベース検索結果を評価します (ここで、Protein.csv は神経ペプチドの同定を表し、Peptide.csv は神経ペプチドフラグメントの同定を表します。
    11. データベース検索で、タンパク質およびペプチドのスコア、質量精度、および配列カバレッジを調べます。
      メモ: 各データベース検索ソフトウェアは固有のスコアリングアルゴリズムを使用するため、それに応じて評価が必要な場合があります。同定は、完全なフラグメントイオン系列を含む同定されたペプチドについて観察されたスペクトルを手動で検査することによって評価することができる。

2. 神経ペプチドのMALDI−MSスポッティング解析

  1. サンプル調製
    1. 定量が必要な場合は、ステップ1.1またはステップ1.1~1.2に従い、ステップ1.2.8を除きます(MALDI-MS分析の前に同位体標識後の脱塩は必要ありません)。
    2. 乾燥した脱塩ニューロペプチドを5μLの0.1%FA中で再構成し、よくボルテックスし、超音波処理物を37°Cの水浴中で1分間、2,000 x gで短時間遠心分離する。
    3. 甲殻類組織における神経ペプチドのスポッティングのために、マトリックスとして50%メタノール(MeOH)/ 0.1%FA(v / v)中に150mg / mLの2,5-ジヒドロキシ安息香酸(DHB)を調製する。
    4. 疎水性フィルム上にサンプルの3 μLの液滴をピペット( 材料表を参照)し、サンプル液滴上にマトリックスのピペット3 μLを直接置きます。ピペットを上下にして混ぜる。
    5. 1:1サンプルのピペット1 μL:MALDIステンレス鋼ターゲットプレートのウェルへのマトリックス混合物。ピペットチップを使用して、各混合物をサンプルウェルの端に広げます。サンプルは、均一な分布を容易にするために、ウェル彫刻のエッジに触れる必要があります(図4A)。
    6. 1:1 キャリバーント:マトリックス混合物(市販またはカスタム校正ミックス、ポリマー材料(MeOHに溶解した赤リン)、または一般的なマトリックスクラスターイオン)12 をサンプル近くのウェルに1 μLスポットします。
      注:赤リンは、斑点を見つける前にマトリックスと混合する必要はありません。
  2. データ集録
    1. 乾燥したサンプルスポットを含むターゲットプレートをMALDIタンデム飛行時間(TOF/TOF)機器に挿入します( 材料表を参照)。
    2. DHBマトリックスの場合、レーザー出力を 95%に設定し、 自動最適検出器ゲイン、および スマート - 完全なサンプルサンプル キャリア移動モードを選択します。200~3200 m/z の範囲のMSスペクトルを取得し、各スポットから複数のスペクトルを一緒に追加して、神経ペプチドの信号対雑音比を高めます。
      メモ:レーザー出力、検出器ゲインの割合を最適化し、適切なサンプルキャリア移動モードを選択して、すべての集録がスポット全体をほぼカバーし、その後の集録が前の位置に進まないようにします。
    3. 機器を校正します。
      注:所望の神経ペプチド範囲を包含するように質量範囲を調整してください。
  3. データ解析
    1. データ解析ソフトウェア( 材料表を参照)でMALDI-MSファイルを開き、ここで使用するソフトウェアの ベースライン減算 をクリックします。
    2. ピークピッキングを実行するには、[ マスリストを検索]をクリックします。ピークが少なすぎる場合は、「マスリストを編集」を選択してマスリストを手動で編集し、スペクトル内のピークをクリックして マスリスト に追加します。
    3. 質量リストを[M+H]+ m/z 値を含むニューロペプチドデータベースと比較することにより、正確な質量マッチングを実行します(200ppm誤差±)。
      注: [M+K]+、[M+Na]+、および [M+NH4]+ などの一般的な塩付加物も、正確な質量一致ターゲット リストに含める必要があります。
    4. 同定されたピークを検証するには、目的の m/z のリストを生成し、MS/MS実験を実行します。

3. 神経ペプチドのMALDI−MSイメージング解析

  1. サンプル調製
    メモ: 切片化するには薄すぎる組織には、埋め込みおよび切片化の手順は必要ありません。
    1. クライオスタットカップの半分にゼラチン(37°C、脱イオン水で100mg/mL)を入れ、室温で固化させます。残った液体ゼラチンを37°Cの水浴中で温かく保ちます。
    2. 動物から所望のニューロン組織を収集し、鉗子を使用して、脱イオン水を含む0.6mLチューブに組織を直ちに1秒間浸漬する。
      注: ニューロン組織郭清については、ステップ 1.1.2 注 を参照してください。
    3. 固体ゼラチンの上に組織を置き、クライオスタットカップの残りの部分を液体ゼラチンで満たします。鉗子を使用して組織を配置します。
    4. クライオスタット カップを平らな面に置き、ドライアイスで凍らせます。
      注:使用時まで-80°Cでサンプルを保管してください(理想的には6ヶ月以内)。
    5. 切片作製のために、ゼラチン包埋サンプルをクライオスタットモールドから分離し、モールドを切断する。
    6. 1mLの脱イオン水の液滴をチャックにピペッティングし、直ちに埋め込み組織を液滴に押し付けることによって、埋め込み組織をクライオスタットチャック上に取り付ける。
    7. 凍結したら、組織の周りにさらに脱イオン水をピペットで留め、さらにチャックに固定する。これらの手順は、-20 °C に設定したクライオスタット ボックス ( 材料表を参照) 内で実行します。
    8. 組織を1つの細胞のおおよその厚さ(サンプルの種類に応じて8〜20μm)で切断し、スライドの片側をセクションの近くに置き、スライドの反対側に指を置いてガラスをゆっくりと温め、セクションがスライドにくっつくようにすることによって、各セクションをインジウムスズ酸化物(ITO)コーティングされたスライドガラスにマウントして解凍します。
      注:組織切片は、ゼラチンの一方の端をピンセットで拾い上げ(-20°Cに冷やし)、ITOコーティングされたスライドガラスの上に置き、スライドの反対側に指を置いてガラスをゆっくりと温め、セクションがスライドにくっつくようにすることによって、解凍して取り付けることもできます。
    9. 疎水性ペンを使用して組織切片の近くに小さな円を描き、その円の内側にキャリブラントを配置して、キャリブラントとして使用するサンプルを見つけます(キャリブラントのオプションについてはステップ2.1.6を参照)。
    10. スライドの各角にホワイトアウト ペンのマークを付け、ティーチ ポイントとして使用する鋭いエッジ (つまり、x) を含む小さな図形を付けます。
    11. スライドガラスをMALDIスライドアダプタプレートに入れ、スキャナを使用して高解像度(≥2400 DPI)の光学画像スキャンを行います。
    12. 自動噴霧器を使用して組織断面にマトリックスをスプレーします(噴霧器の詳細と手順については 、材料表 を参照してください)。
    13. 甲殻類組織中の神経ペプチドのMSIについては、マトリックスとして50%メタノール/0.1%FA(v/v)中の40mg/mL DHBを使用し、ノズル温度を80°C、速度を1,250mm/min、流量を0.1mL/min、パス数を12、各パス間に30秒設定して自動噴霧器とした。
  2. データ集録
    1. マトリックスを噴霧した解凍マウント組織切片を含む完全に乾燥したターゲットプレートを挿入する。
    2. MS イメージング取得ファイルのパラメータを設定して、レーザーの直径がラスターのステップ サイズより小さくなるようにします。
    3. スキャンした光学画像をロードし、xティーチポイントを使用してサンプルプレートを校正します。実際の組織切片よりもわずかに大きい測定対象の組織領域を定義して、マトリックスのみを含む領域も含むようにします。
    4. 機器を校正し、200 ~ 3200 m/z の範囲のスペクトルを取得します。所望の神経ペプチド範囲を包含するように質量範囲を調整する。
  3. データ解析
    1. データを処理するには、MSイメージングデータセットを目的のソフトウェアにインポートし、ベースライン除去アルゴリズムを選択し、 総イオン数を使用してデータを正規化します。
      注: 中央値、二乗平均平方根 (RMS) 値、参照 m/z 値の強度など、さまざまな正規化アルゴリズムを選択すると、多くの m/z 値の空間分布が変わる可能性があります。目的の分析物に最も適した正規化アルゴリズムを選択します。
    2. 理論上のピークリストから各m / z値の画像を生成するには、神経ペプチド[M + H]+、[M + Na]+、[M + NH4]+などを含むカンマ区切り値(CSV)ファイルをアップロードします。m/z 値を取得するには、「ファイル」>「ピーク・リスト>インポート」をクリックします。ピーク リストに名前を付けます。
    3. 適切なppm誤差閾値を推定するには、まずMSスペクトル中のニューロペプチドピークを手動で同定し、それをニューロペプチド理論質量と比較します。ppm 誤差を計算し、「 ファイル>ファイルのプロパティ」>「間隔幅 」および「入力 ppm 誤差」をクリックします。
    4. ドロップダウンメニューからピークリストを選択し、「 ピークリストの間隔ごとにm /z イメージを作成」をクリックします。
    5. 各 m/ z 画像 のスクリーンショットを保存をクリックして、各 m/z 画像を保存します。
      注:推定神経ペプチド同定は、分析物シグナルが組織内にのみ局在し、周囲のマトリックスには局在しない m / z 画像を同定することによって行うことができる。
    6. ピークの同一性を検証するには、目的の m/z のリストを生成し、MS/MS実験を実行します。

4. de novo シーケンシングを用いた新規推定神経ペプチドの発見

  1. 手順 1.4.2 ~ 1.4.5 を実行します。
  2. PEAKSソフトウェアからde novoのみのペプチドをエクスポートし.csv平均ローカル信頼度(ALC)スコア は≥75です。
    注: de novo シーケンシングを実行するために使用できるソフトウェアは多数あり、それぞれに独自のスコアリングアルゴリズムがあり、それに応じて評価する必要があります。
  3. 特定の神経ペプチドファミリー19に属する神経ペプチドを示す既知の配列モチーフについてペプチドリストを検索する。
    注:モチーフは種を超えて一般的によく保存されていますが、検索されたモチーフはサンプル生物を考慮して選択する必要があります。

5. 予測された神経ペプチド配列のトランスクリプトームマイニング

注: このステップはオプションであり、既存のニューロペプチドデータベースへの追加または新しいニューロペプチドデータベースの構築にのみ使用されます。

  1. 目的の既知のプレプロホルモンアミノ酸配列を選択し、tBLASTn(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=tblastn&BLAST_PROGRAMS=tblastn&PAGE を使用する
    _TYPE=ブラスト検索&SHOW_DEFAULTS=オン&リンク
    _LOC=blasthome) を使用して、nr/nt、Refseq_genomes、EST、TSA などのデータベースに対してクエリ プレプロホルモン配列を検索します。
    注: タンパク質データベースに対してクエリ配列を検索するには、BLASTp (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&BLAST_PROGRAMS=blastp&PAGE を使用します。
    _TYPE=ブラストサーチ&SHOW_DEFAULTS=オン&ブラスト
    _SPEC=&LINK_LOC=ブラストタブ&LAST_PAGE=トブラストn)。
    1. ターゲット生物 (税 ID) を選択し、[ 期待しきい値] アルゴリズム パラメーターを 1000 に変更して、低スコアのアライメントを含めます。
    2. BLASTプログラムを実行し、有意なアライメントを生成するクエリ配列と被験者配列の間で高い相同性スコアがないか結果を確認します。塩基配列を含むFASTAファイルを保存します。
      注:類似の相同性スコアを有する複数の対象配列がある場合、推定配列20、21を絞り込むためにMAFFTアラインメントを実施する。
  2. Expasy Translationツールを使用して、プレプロホルモンヌクレオチド配列をプレプロホルモンペプチド配列 に翻訳する (https://web.expasy.org/translate/)。C. sapidusの場合、遺伝暗号として 無脊椎動物のミトコンドリア を選択します。
  3. SignalP(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP)を用いてペプチド配列中のシグナルペプチド配列およびプロホルモン切断部位を確認する。
    注:既知のプレプロホルモンプロセシングスキームに対する相同性はまた、プロホルモン切断部位を同定するために使用され得る。シグナルペプチドに対する可能な翻訳後修飾は、所望により予測され得る。スルフィネーター(https://web.expasy.org/sulfinator/)は、チロシン残基の硫酸化状態を予測するために使用することができる。DiANNA(http://clavius.bc.edu/~clotelab/DiANNA/)は、ジスルフィド結合結合の結合性を予測するために使用することができる。

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結果

サンプル調製とMS分析のワークフローを 図1に示します。ニューロン組織の解剖後、均質化、抽出、および脱塩を行い、ニューロペプチドサンプルを精製する。同位体標識ベースの定量が必要な場合は、サンプルを標識し、再度脱塩します。得られたサンプルは、神経ペプチドの同定および定量のためにLC-MS/MSを介して分析されます。

プロテオミクスソフトウェアを介して同定された神経ペプチドは、良好なペプチド断片化配列カバレッジを有するべきであるが、これは世界的に定義または標準化されていない。絶対同定のためには、すべてのアミノ酸は、明確な同定および局在化を提供するフラグメントイオンを生成するべきである。これはまた、各フラグメントイオンの強度の確認のために合成ペプチドと比較しなければならない。すべての推定同定でこれを実行するためのコストは実現不可能であるため、同定は一般に、より観察されたフラグメントイオンがペプチド同定の信頼度を高める信頼度に基づいて記述される。図2A,B...

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ディスカッション

神経系に見られる神経ペプチドおよび内因性ペプチドの正確な同定、定量、および局在化は、それらの機能を理解する上で極めて重要である23,24。質量分析は、完全に配列決定されたゲノムを持たない生物でも、これらすべてを達成できる強力な技術です。LC-ESI-およびMALDI-MSの組み合わせを介してC. sapidusから採取された組織から神経ペプチドを検出、定量、および局在化するこのプロトコルの能力が実証されている。

LC-ESI-MS分析のサンプル調製中に、考慮する必要があります。MSは高感度な技術ですが、ニューロン組織のペプチド濃度が低い(フェムトモル範囲25まで)ことは深刻な制限をもたらします。タンパク質や脂質などのより豊富で干渉的なマトリックス成分を除去するだけでなく、各ステップ26、27

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開示事項

著者らは開示するものは何もありません。

謝辞

この研究は、米国国立科学財団(CHE-1710140およびCHE-2108223)および米国国立衛生研究所(NIH)の助成金R01DK071801を通じて支援されました。A.P.は、NIH化学生物学界面トレーニング助成金(T32 GM008505)によって部分的に支援されました。N.V.Q.は、国立心肺血液研究所からウィスコンシン大学マディソン心臓血管研究センター(T32 HL007936)へのルース・L・キルシュシュタイン国立研究サービス賞の下で、国立衛生研究所によって部分的に支援されました。L.L.は、NIHの助成金R56 MH110215、S10RR029531、S10OD025084、ならびにウィスコンシン同窓会研究財団とウィスコンシン大学マディソン薬学部が提供する資金援助を受けて、ヴィラス特別業績教授職とチャールズメルボルンジョンソン教授職からの資金援助を認めたいと思います。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
化学薬品、試薬、消耗品
2,5-ジヒドロキシ安息香酸(DHB)マトリックスSupelco39319
酢酸フィッシャーケミカルA38S-500
アセトニトリルオプティマ LC/MSグレードフィッシャーケミカルA955-500
重炭酸アンモニウムSigma-Aldrich9830
ボランピリジンSigma-Aldrich179752
BrukerペプチドキャリブレーションミックスBruker DaltonicsNC9846988
キャピラリーPolymicro1068150019ナノフローカラム(75 µm内径×360&マイクロ;m外径)
クライオスタットカップSigma-AldrichE6032カップまたは金型は機能するはずです
 マイクロ遠心チューブエッペンドルフ30108434
ホルムアルデヒドSigma-Aldrich252549
ホルムアルデヒド - D2Sigma-Aldrich492620
ギ酸 Optima LC/MS グレードフィッシャーケミカルA117-50
ゼラチンDifco214340場所 37 °疎水性バリアペンを溶かすCウォーターバス
Vector Labs15553953
酸化インジウムスズ(ITO)コーティングガラススライドDelta TechnologiesCB-90IN-S10725 mm x 75 mm x 0.8 mm (幅 x 長さ x 厚さ)
LC-MS バイアルThermoTFMSCERT5000-30LVW
メタノール Optima LC/MS グレードフィッシャーケミカルA456-500
パラフィルムSigma-AldrichP7793疎水性フィルム
pHインジケーターストリップSupelco109450
赤リンクラスターSigma-Aldrich343242
逆相 C18 材料Waters186002350Nanoflow カラムに手動で詰め込まれ
ワイトアウト ペンBIC150810
ZipTipミリポアZ720070
Instruments and Tools
Automatic matrix sprayer system- M5HTX Technologies, LLC
遠心分離機 - 5424 REppendorf05-401-205
クライオスタット- HM 550Thermo Fisher Scientific956564A
乾燥剤Drierite2088701
鉗子WPI501764
MALDI ステンレス鋼 ターゲット プレートBruker Daltonics 8280781
Pipet-Lite XLSRainin17014391200 & マイクロ;L
Q Exactive Plus ハイブリッド四重極-OrbitrapサーモフィッシャーサイエンティフィックIQLAAEGAAPFALGMBDK
ラピfleX MALDI-TOF/TOFブルカー ダルトニクス
SpeedVac - SVC100サヴァントSVC-100D
超音波洗浄機ブランソニック2510R-MTH超音波
処理用 超音波ホモジナイザーフィッシャーサイエンティフィックFB120110 FB120 超音波ディスクレーター CL-18 プローブ
真空ポンプ - Alcatel 2008 理想真空製品P10976極限圧力 = 1 x 10-4 Torr
Vortex ミキサーコーニング6775
ウォーターバス (37C) - Isotemp 110フィッシャーサイエンティフィック15-460-10
データ分析ソフトウェア
Expasyhttps://web.expasy.org/translate/
FlexAnalysisBruker Daltonics
FlexControlBruker Daltonics
FlexImagingBruker Daltonics
PEAKS StudioBioinformatics Solutions, Inc.
SCiLS Labhttps://scils.de/
SignalP 5.0https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0
tBLASTnhttp://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=tblastn&BLAST_
プログラム=tblastn&PAGE_
TYPE=ブラストサーチ&SHOW_
デフォルト=オン&LINK_LOC
=ブラストホーム
任意のています

参考文献

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