カルシウムイメージング技術によるニューロン-グリア回路の変化の可視化

サマリー

細胞カルシウムイメージングは、ユニークな機能的シグネチャを与えるカルシウム透過性チャネル/受容体の発現に基づいて、培養中の混合集団、または覚醒した動物でさえも、個々の細胞の動的シグナル伝達を研究するための汎用性の高い方法論です。

要約

ここでは、カルシウムシフトの観点から動的に研究されたグリア(アストロサイト、希突起膠細胞、ミクログリア)および/または末梢(後根神経節)および中枢組織(皮質、脳室下帯、オルガノイド)からのニューロンに基づく回路の選択的in vitroモデルについて報告する。結果を説明するために選択されたモデルは網膜であり、複雑な細胞相互作用を有する単純な組織である。カルシウムは、重要な細胞の役割のほとんどに関与する普遍的なメッセンジャーです。我々は、培養中の網膜ニューロングリア細胞がどのように調製され、評価され、カルシウムシフトを想定することができるかを段階的なプロトコルで説明する。このモデルでは、KClおよびATPに対する選択的応答に基づいてニューロンをグリアと区別する。カルシウム透過性受容体およびチャネルは、異なる区画において選択的に発現される。カルシウム応答を分析するために、我々はFura-2のようなレシオメトリック蛍光ダイスを使用する。このプローブは、Ca2+非含有およびCa2+結合形態に基づいて遊離^Ca2+濃度を定量し、2つの波長で知覚される蛍光強度に基づいて2つの異なるピークを提示する。

概要

セカンドメッセンジャーとしてのカルシウムの普遍的な特性のために、このイオンは、遺伝子転写、誕生と死、増殖、遊走と分化、シナプス伝達、可塑性など、膨大な数のシグナル伝達活動に関与しています。したがって、カルシウム活性化ダイナミクスを忠実度と敏捷性で追跡できる方法は、ユニークな空間 - 時間応答を観察する方法を提供するでしょう。このような方法は、細胞カルシウムイメージング技術であり、カルシウムシフト機能データを、それらの別個の応答に基づいて特定の細胞表現型と相関させる。

^Ca2+プローブは1980年代に初めて開発され、後に改良され、これらの分子を生細胞アッセイで使用できるようになりました¹。化学的指標として、Fura-2は定量的[^Ca2+]_i測定の標準であると考えられています。この指標のアセトキシメチル(AM)エステル(すなわち、Fura-2AM)は、細胞膜を容易に透過し、インキュベーション希釈液の20倍大きい細胞内濃度(例えば、[5μM]_o/[100μM]_i)に達することができる。Fura-2のもう1つの利点は、良好なフォトブリーチング耐性を有することである。したがって、このインジケータを長期間イメージングしても、蛍光能力に大きく影響することはありません。最後に、Fura-2は、〜100nM〜〜100μMの広範囲のカルシウ....

プロトコル

動物を含むすべての実験は、「実験動物ケアの原則」(NIH、ベセスダ、米国)に従って、リオデジャネイロ連邦大学の施設動物ケアおよび使用委員会のガイドラインによって承認され、それに従って実施されました。受精ホワイトレグホーン鶏の卵のための許可番号IBCCF-035。

1. 溶液の調製

1. クレブス溶液(132 mM NaCl、4 mM KCl、1.4 mM MgCl2、_2.5 mM _CaCl2、6 mM グルコース、10 mM HEPES、pH 7.4、373 mOsm)を調製する。
2. 生理食塩水緩衝液(^Ca2+およびMg2+遊離溶液 - CMF)を調製する:76.55 g/L NaCl、3.05 g/L KCl、1.65 g/L Na2HPO4、0.610 g/L _KH2PO4、21.95 g/L グルコース、および 7.90 g/L NaHCO3。
3. インキュベート溶液を調製する(クレブス溶液中のFura-2と共に:)5μMフラ-2-アセトキシメチルエステル(フラ-2)、0.1%脂肪酸非含有ウシ血清アルブミン(BSA)、および0.02%ポロクサマー407。
4. 混合集団またはグリア....

結果

ここでは、胚発生8日目のひよこからの培養中の網膜細胞を用いて、ニューロンとグリアのシグナルがカルシウムシフトでどのように変化するかを調べた。培養物は、本質的に記載されているように^15,19を混合ニューロングリア細胞として(≥1 x ¹⁰⁶細胞/ディッシュの密度で)インビトロで7日間の段階で調製した(図1A)。あるいは、低密度で調製した濃縮ニューロン細胞(5 x ¹⁰⁵細胞/ディッシュ)を、インビトロで3日間の段階で処理したポリ-L-リジン(10 μg/mL)カバーグラス上に播種する(図1B

ディスカッション

我々は網膜組織を用いて、KClまたはATPによって媒介されるカルシウム応答が、それぞれニューロン応答およびグリア応答に明確に区画化されていることを示した(図1)。文献中のいくつかのデータは、P2X7受容体がニューロンに発現しており、ニューロン活性およびシナプス神経伝達物質の放出を調節する^{ことを示唆しているが20}、他の著者らはニューロンP2X7受容体の存在に疑問を呈している。実際、現在の結果は、初代グリアP2X7受容体が、不健康な組織に見られる高い細胞外ATP濃度に合計されたニューロン効果を媒介するという考えを支持している²¹。

我々は以前、KClまたはAMPA(グルタミン酸アゴニスト)によって活性化される[^Ca2+]iシフトの変異が成熟ニューロン^のマーカーである微小管関連タンパク質(MAP-2)を発現するように、網膜細胞の機能分化を表現型ディスプレイと結びつけ.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
15 mm カバーガラス	Paul Marienfeld GmbH & Co. KG	111550	セルサポート
510 nm ロングパスフィルター	カールツァイス
ATP	Sigma	A1852
B-27 サプリメント	Gibco	17504044	Suplement
CaCl2	Sigma-Aldrich	C8106
CoolSNAP デジタルカメラ	ローパーサイエンティフィック、ニュージャージー州
D-(+)-グルコース	ネオン	1466
DMEM/ F-12	Gibco	12400-24	細胞培養培地
Excel ソフトウェア	マイクロソフト
子牛胎児 血清	Sigma-Aldrich	F9665	補助
蛍光顕微鏡	Axiovert 200;カールツァイス	B 40-080
Fura-2 AM	分子プローブ	F1221	レシオメトリック Ca2+ インジケータ
ゲンタマイシン 硫酸塩	カルビオケム	1405-41-0	抗生物質
HEPES	シグマ	H4034
KCl	シグマ	P5405
KH2PO4	シグマ	P5655
ラムダDG-4 装置	Sutter Instrument, Novato, CA	DG-4PLUS/OF30
Laminin	Gibco	23017-015	細胞接着を助ける
Metafluor software	Universal Imaging Corp. West Chester, PA
MgCl2	Sigma	M4880
Na2HPO4	Vetec	129
NaCl	Isofar	310
NaHCO3	Vetec	306
PH3 platform	Warner Intruments, Hamden, CT	64-0286
Pluronic F-127	Molecular Probes	P6866	nonionic, surfactant
Poly-L-lysine	Sigma-Aldrich	P8920	細胞接着を助ける
トリプシン-EDTA0.25%	Gibco	25200056	解離酵素

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